U niversite cadi ayyad, faculte des sciences semlalia








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UNIVERSITE CADI AYYAD, FACULTE DES SCIENCES SEMLALIA

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

TD 2

REPARATION DU DNA ET RECOMBINAISON


  1. Produits issus d’événements de recombinaison homologue

E
(1)

(2)

(3)
n vous aidant de l’exemple, schématiser les produits d’un événement de recombinaison obtenus par crossing-over (enjambement) entre les régions homologues des molécules 1 à 5.


exemple

(4)

(5)




  1. Mode d’action de la protéine RecBC

Des séquences de DNA spécifiques appelées « sites Chi », stimulent localement la recombinaison homologue faisant intervenir RecBC chez E. coli. L’interaction entre la protéine RecBC et le site Chi accélère vraisemblablement une étape limitante du processus de recombinaison. Afin d’étudier cette interaction en détail, RecBC est purifiée et incubée en présence d’un fragment de DNA double brin linéaire contenant un site Chi.
Différents échantillons de DNA linéaire sont tout d’abord spécifiquement marqués à l’extrémité 5’ de gauche (5’g), à l’extrémité 5’ de droite (5’d), à l’extrémité 3’ de gauche (3’g) et à l’extrémité 3’ de droite (3’d). Chaque échantillon est alors incubé dans un milieu réactionnel contenant RecBC. Comme témoin, on incube dans les mêmes conditions l’un des DNA marqués sans ajouter la protéine RecBC.


site Chi

gauche (g)

droite (d)


Après un temps de réaction d’une heure, le DNA est dénaturé et les simples brins sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. L’électrophorégramme montre les fragments de DNA radiomarqués. Comme témoin supplémentaire, on a placé sur le gel un échantillon (3’d) incubé en présence de RecBC mais n’ayant pas subi de dénaturation.


    1. Qu’est- ce qui prouve que RecBC clive le site Chi ? Coupe-t-elle l’un des brins ou les deux ? Si c’est au niveau d’un seul brin, préciser lequel et expliquer pourquoi.




    1. Qu’est ce qui prouve que RecBC peut agir comme une DNA hélicase ?




    1. Comment l’action de RecBC peut stimuler la recombinaison homologue au voisinage d’un site Chi ?



  1. Mode d’intégration du génome d’un rétrovirus

Quand des rétroviraux infectent des cellules, leur génome composé de RNA linéaire est copié en DNA double brin linéaire par la transcriptase inverse virale. Ce DNA linéaire comporte les gènes viraux encadrés par deux répétitions directes : les « Long Terminal Repeats » ou « LTR ». Le DNA linéaire peut se circulariser par :

(a)- Recombinaison homologue entre les deux LTR, formant un cercle contenant une LTR.

(b)- Ligation de ses deux extrémités, formant un cercle contenant deux LTR adjacentes.
Une de ces 3 formes (linéaire ou circulaires) extrachromosomiques s’insère dans le chromosome conduisant à la forme intégrée typique du virus avec toujours deux LTR (une de chaque côté des gènes viraux)
Afin de déterminer laquelle des trois formes libres est le précurseur de la forme intégrée, trois génomes rétroviraux différents sont créés in vitro puis utilisés pour infecter des cellules hôtes :
(A) est le génome viral normal,
(B) est un génome contenant une LTR interne,
(C) un génome contenant deux LTR internes mises bout à bout.



Après infection par chaque génome, le DNA chromosomique des cellules hôtes est isolé et digéré par des enzymes de restriction (ou ■).
Les fragments de DNA résultants sont séparés par électrophorèse sur gel et le DNA rétroviral visualisé par hybridation avec une sonde marquée spécifique des séquences du rétrovirus.
(Pour plus de clarté, les fragments contenant du DNA cellulaire en plus des séquences rétrovirales ne sont pas représentées sur le schéma).
A partir de ces résultats, déduire la structure du précurseur de la forme intégrée du virus et indiquer le raisonnement suivi.






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