Rapporteurs : Pr Lysiane Richert








télécharger 1.72 Mb.
titreRapporteurs : Pr Lysiane Richert
page2/32
date de publication20.11.2017
taille1.72 Mb.
typeRapport
b.21-bal.com > droit > Rapport
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   32

I. Populations étudiées. 84

1. Echantillons de veines saphènes humaines. 84


2. La Cohorte Stanislas. 84

II. Mesure des paramètres biologiques. 85

1. Données médicales. 85

2. Données biologiques. 85

III. Culture cellulaire. 85

1. Les cellules. 86

1.1. Cellules HSaVEC. 86

1.2. Cellules ECV304. 87

1.3. Cellules musculaires lisses. 88

1.4. Cellules HepG2. 89

1.5. Conditions de conservation. 90

2. Tests de cytotoxicité 90

2.1. Test du MTT. 90

2.2. Test d’exclusion au bleu Trypan. 91

3. Traitements des cellules. 92

3.1. Préparation des solutions. 92

3.2. Traitements. 93

IV. Etudes biochimiques. 93


1. Dosage des protéines selon la méthode de Lowry. 93

2. Préparation des microsomes. 93

3. Western Blot. 94

3.1. Préparation des gels. 94

3.2.Préparation du marqueur et des échantillons. 95

3.3.Transfert des protéines du gel sur une membrane (ImmobilonP). 96

3.4. Saturation de la membrane. 97

3.5. Fixation des anticorps. 97

3.6. Révélation. 97

V. Biologie moléculaire. 98

1 Extraction des acides ribonucléiques. 98


2. Quantification des ARNs. 99

3.Technique de détection des ARNm. 99

3.1. Réaction de reverse transcription. 99

3.2. La polymerase chain reaction (PCR). 100

3.2.1. La PCR semi-quantitative. 102

3.2.2. La PCR quantitative. 102

VI. Etudes de polymorphisme. 104

VII. Etudes statistiques. 107
RESULTATS
I. Enzymes impliquées dans la production de molécules vasoactives. 108

1. Expression des enzymes vaso-actives dans les tissus veineux humains. 109

1.1. Expression des cytochromes P450. 110

1.1.1. Le cytochrome P450 1B1. 110

1.1.2. Le cytochrome P450 2C total. 112

1.1.3. Le cytochrome P450 2E1. 113

1.1.4. Le cytochrome P450 2J2. 115

1.1.5. Le cytochrome P450 3A5. 116

1.1.6. Le cytochrome P450 4A11. 118

1.1.7. Les cytochromes P450 dans les veines saphènes humaines. 119 1.2. Expression des cyclooxygénases. 120

1.2.1. Cyclooxygénase de type 1. 121

1.2.2. Cyclooxygénase de type 2. 122

1.3. Expression des NO synthases. 123

2. Volume des cellules musculaires lisses issues des tissus des veines saphènes. 124

3. Expression des enzymes vaso-actives dans les cellules humaines. 125

3.1. Les cellules endothéliales. 125

3.1.1. Les cytochromes P450. 125

3.1.2. Les cyclooxygénases. 126

3.1.3. Les récepteurs nucléaires. 126

3.2. Les cellules musculaires lisses. 128

3.2.1. Les cytochromes P450. 128

3.2.2. Les cyclooxygénases. 129

3.2.3. Les récepteurs nucléaires. 129

4. Etudes de corrélations. 130

5. Discussion. 132
II. Etude de régulation des cytochromes P450 2C, 2J2 et 3A5 par les statines. 140

1. Introduction 140

2. Cytotoxicité in vitro des statines. 142

3. Effet des statines sur l’expression des cytochromes P450. 143

3.1. Les cytochromes P450 de la famille 2C. 143

3.1.1. Le cytochrome P450 2C total. 143

3.1.2. Le cytochrome P450 2C9. 145

3.1.3. Le cytochrome P450 2C8. 146

3.1.4. Etude de l’expression de la protéine de CYP2C9. 147

3.2. Le cytochrome P450 2J2. 148

3.3. Les cytochromes P450 de la famille 3A. 149

4.Effet des statines sur les récepteurs nucléaires. 151

4.1. Le récepteur CAR. 152

4.2. Le récepteur PXR. 152

4.3. Le récepteur GR. 153

5. Discussion. 155

III. Etudes de polymorphisme. 138

A. Polymorphismes de CYP2J2, CYP2C19 et hypertension. 162

1. Polymorphisme de CYP2C19. 162

2. Etude de la fréquence allèlique des SNP 681 et 990. 162

3. Polymorphisme et pression sanguine. 163

4. Discussion. 164

B. Polymorphisme et marqueurs inflammatoires. 165

1. Etude de la fréquence allèlique. 166

2. Interleukine-6. 167

3. Autres marqueurs inflammatoires. 167

4. Polymorphisme et paramètres lipidiques. 169

5. Discussion. 171

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES. 176
BIBLIOGRAPHIE. 179

Avant Propos.
Ce travail se situe au croisement de l’expérience du laboratoire sur le rôle des cytochromes P450 (CYPs) et de recherches plus récentes concernant les gènes candidats en pathologie cardiovasculaire.

Il est en effet démontré que des cytochromes P450 sont exprimés dans les tissus cardiaques et vasculaires ou dans les cellules qui en dérivent. Plusieurs cytochromes P450 sont capables de métaboliser l’acide arachidonique en métabolites vasodilatateurs ou vasoconstricteurs et donc de jouer un rôle dans le tonus vasculaire. Ces cytochromes sont régulés par de nombreux facteurs tels que certaines conditions physiologiques ou des substances exogènes. Enfin, les cytochromes P450 présentent de nombreux polymorphismes. Les différentes formes polymorphiques de ces cytochromes P450 produisent des enzymes moins actives voire inactives. Ce qui peut avoir des conséquences dans le métabolisme des médicaments et dans certaines pathologies.

Notre hypothèse est que les voies CYP-dépendantes de la cascade de l’acide arachidonique jouent un rôle majeur dans le tonus vasculaire.

Après avoir examiné ces différents arguments, au vu de l’importance des cytochromes P450 dans le système vasculaire, nous nous sommes attachés au rôle des cytochromes P450 dans le tonus veineux et plus précisément leur rôle dans la pathologie variqueuse. Pour cela, nous nous sommes intéressés dans un premier temps à l’expression des enzymes impliquées dans la production de molécules vaso-actives dans les tissus de veines saphènes humaines, mais également à leur expression dans des cellules issues de tissus vasculaires. Dans un deuxième temps, nous avons réalisé des études de régulation par des molécules hypocholestérolémiantes : les statines. En effet, ces molécules présentent un intérêt grandissant dans les pathologies cardiovasculaires. Nous nous sommes intéressés plus particulièrement aux cytochromes P450 dont l’expression est la plus affectée dans la pathologie variqueuse. Enfin dans une dernière partie, nous avons étudié les polymorphismes du CYP2C19 et leur implication dans le métabolisme de l’acide arachidonique et la composante inflammatoire des pathologies cardiovasculaires.

INTRODUCTION

I. Les cytochromes P450 dans les tissus cardiaques et vasculaires.


    1. Généralités.


Les cytochromes P450 (CYP) forment une superfamille multigénique d’enzymes impliquées dans le métabolisme oxydatif de molécules très diverses, comprenant aussi bien des xénobiotiques (médicaments, pesticides, toxiques, cancérigènes...) que des substances endogènes (hormones stéroïdiennes, acides gras, vitamines,...). Les cytochromes P450 ont tous en commun un thiolate comme ligand axial du fer au centre de l’hème. Ce sont d’ailleurs les propriétés de ce chromophore qui lui ont donné son nom : en 1963, deux chercheurs japonais, Sato et Omura, ont appelé « pigment P450 » le composé responsable du pic d’absorbance à 450 nm qui apparaît quand on sature en monoxyde de carbone une préparation subcellulaire de glandes surrénales par le dithionite de sodium. Les cytochromes P450 se trouvent dans la plupart des êtres vivants : dans les archaebactéries, des eubactéries, des plantes, des animaux... Chez les mammifères et notamment chez l’homme, les cytochromes P450 sont présents dans presque tous les tissus, sauf le muscle, les os et les globules rouges. les organes particulièrement riches en cytochromes P450 sont le foie et les glandes surrénales.

Les réactions de bio-transformation des xénobiotiques catalysées par les cytochromes P450 s’inscrivent dans un processus de détoxification évitant l’accumulation de substances potentiellement toxiques dans l’organisme. La grande diversité des molécules rencontrées a conduit au cours de l’évolution à une importante variabilité inter- et intra-espèce en terme de profil métabolique. Une des caractéristiques de ces enzymes est leur inductibilité, en particulier par certaines hormones, médicaments ou polluants chimiques. Paradoxalement ces enzymes peuvent parfois catalyser l’activation chimique de certains composés et produire des métabolites toxiques, mutagènes voire cancérogènes. Chez l’homme les formes quantitativement prépondérantes de cytochromes P450 sont représentées par les sous-familles CYP1, CYP2C et CYP3A (figure 1).














Figure 1 : Répartition des cytochromes P450 dans le foie humain.
1.1.Classification.
Nelson et al., (1996) recensait en 1995, 481 gènes et 22 pseudo-gènes codant pour des cytochromes P450. Ces gènes ont été décrits chez 85 eucaryotes, incluant vertébrés, invertébrés, plantes et algues et 20 procaryotes. De nombreux autres cytochromes P450 ont été isolés depuis et plus de 1000 sont aujourd’hui clairement identifiés. Depuis 1987, ces protéines sont répertoriées et désignées selon une nomenclature basée uniquement sur le pourcentage d’homologie entre les séquences en acides aminés (Nebert et al., 1987), les similitudes en terme d’activité enzymatique et de régulation ne sont pas prises en compte (Nelson et al., 1993). Ainsi, deux cytochromes P450 appartiennent à la même famille lorsque leurs séquences en acides aminés présentent une homologie supérieure à 40 %. Si l’homologie est supérieure à 55% les protéines font partie de la même sous-famille. Les protéines ayant moins de 3 % de divergence sont classées comme variants allèliques. On dénombre actuellement 17 familles de cytochromes P450 chez l’homme, comportant 50 gènes et 15 pseudo gènes (http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html).

1.2. Structure.
Les cytochromes P450 sont composés d’une partie protéique, l’apoprotéine et d’un groupement prosthétique constitué d’une protoporphyrine IX liée à un atome de fer par quatre liaisons covalentes (figure 2). La cinquième liaison de coordination du fer est réalisée avec le groupement thiolate d’une cystéine conservée et positionnée dans le site catalytique. Enfin, la sixième liaison permet la fixation de diverses molécules comme l’eau et l’oxygène moléculaire. Le spectre d’absorption du CYP à l’état ferrique va dépendre du sixième ligand.



protoporphyrine IX


Fer


Figure 2 : Représentation tridimensionnelle du cytochrome P450 4A.
1.3. Cycle réactionnel.
Les cytochromes P450 sont associés à des chaînes de transfert d’électrons distinctes suivant leurs localisations microsomales ou mitochondriales mais qui utilisent toutes les deux la NADPH comme source d’électrons. Les CYPs du réticulum endoplasmique sont réduits par une protéine membranaire, la NADPH cytochrome P450 réductase. Cette protéine comporte deux domaines contenant chacun une flavine. Deux électrons sont ainsi transmis du FAD au FMN puis à l’ion ferrique Fe3+ de l’hème du cytochrome. Pour les cytochromes mitochondriaux, la chaîne de transfert des électrons comporte, outre une réductase à flavine, une composante supplémentaire (protéine Fer-Soufre), la ferredoxine (adrénodoxine dans les glandes surrénales) qui joue le rôle de donneur d’électrons (figure 3).


Figure 3 : Chaîne de transfert d’électrons associées aux cytochromes P450.
Dans la réaction type, le cytochrome P450 transforme un substrat hydrophobe en produit hydrophile, souvent par l’introduction d’une fonction hydroxyle. Cette réaction nécessite une molécule d’oxygène, deux protons et deux électrons. La séquence d’événements qui conduit à cette réaction peut s’écrire suivant le bilan global :

RH + NADPH + H+ + O2  ROH + NADP+ + H2O

Le cycle réactionnel des cytochromes P450 représenté sur la figure 4 peut se résumer de la façon suivante : le substrat est tout d’abord fixé sur le site actif de l’enzyme et remplace ainsi la molécule d’eau liée à la forme ferrique du fer. Le fer ferrique (Fe3+) est réduit en fer ferreux (Fe2+) par transfert d’un électron de la NADPH réductase sur le fer ferrique. L’oxygène moléculaire se fixe sur la sixième liaison de l’atome de fer. Un électron supplémentaire est alors ajouté et réduit le dioxygène ferreux en complexe activé capable de réagir avec le substrat. Deux protonations successives sont nécessaires pour libérer une molécule d’eau. Il se produit ensuite un transfert de protons du substrat vers l’oxygène et formation d’intermédiaires radicalaires OHº et Rº. Le radical hydroxyle (OHº) se lie au radical Rº, (à ce stade, il peut y avoir formation de radicaux libres dans la cellule pouvant générer un stress oxydant). La réaction se termine par la libération du produit du groupement hèminique.




Figure 4 : Cycle réactionnel des cytochromes P450.
1.4. Fonctions biologiques des cytochromes P450.
Environ 40 types de réactions d’oxydation différentes sont catalysées par les cytochromes P450 ce qui montre la grande diversité d’action de ces enzymes. De ce fait, le nombre de molécules chimiques pouvant servir de substrat est très grand (Hasler, 1999).
Les fonctions biologiques des cytochromes P450 peuvent se diviser en deux domaines d’importance égale : d’une part le métabolisme de substances endogènes, d’autre part le métabolisme de xénobiotiques. Les principaux types d’activités observées pour les cytochromes P450 sont :

- une activité monooxygénase qui produit des réactions d’hydroxylation, d’époxidation, de N-hydroxylation, de O-dealkylation,

- une activité oxydase comprenant des réactions d’hydroxylation aromatique et d’oxydation de fonctions alcooliques.

- une activité réductase agissant notamment sur des fonctions azotées ou halogénées.

- enfin une activité peroxydase .
Les principales réactions catalysées par les cytochromes P450 dans le métabolisme des substances endogènes ont trait à l’hydroxylation des stéroïdes, des vitamines A et D et des acides biliaires (Kagawa et Waterman, 1995) mais d’autres réactions telles que le métabolisme de l’acide arachidonique semblent tout aussi importantes pour l’organisme notamment au niveau vasculaire (Fleming, 2001).
Les cytochromes P450 impliqués dans le métabolisme des xénobiotiques montrent des spécificités larges et croisées pour de nombreux substrats. En effet, la spécificité de substrats des cytochromes P450 est relative (un cytochrome P450 peut métaboliser plusieurs substrats) et chevauchante (un substrat peut être métabolisé par plusieurs cytochromes P450).
Le système monooxygénase participe à la biosynthèse d’hormones stéroïdes et au métabolisme de substances endogènes et exogènes. Parmi les substances endogènes, on trouve par exemple les stéroïdes et des acides gras tels que l’acide arachidonique. Les cytochromes P450 métabolisent de nombreux composés étrangers à l’organisme tels que les médicaments, les drogues et les polluants. Certains composés métabolisés par ce système peuvent devenir cancérigènes sans être éliminés par l’organisme, c’est le cas notamment de composés aromatiques tels que le benzo-pyrène.

Les différentes réactions catalysées par les cytochromes P450 et la multitude de substrats métabolisés par ces derniers montre l’importance de ces enzymes dans les systèmes biologiques. La place des cytochromes P450 dans le métabolisme est aujourd’hui bien connu contrairement à leur rôle dans la fonction vasculaire qui commence a être étudié depuis quelques années seulement. C’est pourquoi, notre intérêt pour les tissus vasculaires veineux nous a conduit à rechercher l’expression des cytochromes P450 dans ces tissus et nous avons dressé une sorte d’inventaire de l’expression de ces enzymes.

2. Place des cytochromes P450 dans le métabolisme de l’acide arachidonique.
2.1. Le métabolisme de l’acide arachidonique.
Le métabolisme de l’acide arachidonique se fait par trois voies : la voie des cyclooxygénases, la voie des lipoxygénases et celle des cytochromes P450, plus récemment décrite (Rahman et al., 1997) (figure 5).

1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   32

similaire:

Rapporteurs : Pr Lysiane Richert iconRapporteurs

Rapporteurs : Pr Lysiane Richert iconRapporteurs

Rapporteurs : Pr Lysiane Richert iconRapporteurs

Rapporteurs : Pr Lysiane Richert iconRapporteurs

Rapporteurs : Pr Lysiane Richert iconRapporteurs : Madame Emmanuelle reynaud

Rapporteurs : Pr Lysiane Richert iconRapporteurs : Professeur Bruno levy (Nancy)

Rapporteurs : Pr Lysiane Richert iconRapporteurs
«kmp girls» qui se reconnaitront ici et à Bruno Delépine qui me fait l’honneur de participer au jury de la thèse








Tous droits réservés. Copyright © 2016
contacts
b.21-bal.com