Rapporteurs : Pr Lysiane Richert








télécharger 1.72 Mb.
titreRapporteurs : Pr Lysiane Richert
page14/32
date de publication20.11.2017
taille1.72 Mb.
typeRapport
b.21-bal.com > droit > Rapport
1   ...   10   11   12   13   14   15   16   17   ...   32

2. Tests de cytotoxicité

2.1. Test du MTT.



Ce test est basé sur la coloration des mitochondries dans les cellules vivantes. En effet, seules les mitochondries des cellules vivantes vont absorber la solution bleue de diméthylthiazolyl-diphenyltétrazolium (appelée MTT). Le principe de ce test est de mesurer par absorbance la quantité de bleu absorbé par les cellules et de déterminer au moyen d’une courbe étalon la quantité de cellules vivantes dans la suspension cellulaire étudiée.



Le test est réalisé sur des plaques 96 puits. Les cellules sont ensemencées dans du milieu de culture. Pour le calcul du blanc, il est nécessaire de laisser quelques puits sans cellules. Après traitement des cellules, on ajoute 20 µl de la solution MTT à 5mg/ml puis on incube environ 1 heure à l’étuve à 37°C. Le diméthylthiazolyl-diphenyltétrazolium (MTT) est réduit par les déshydrogénases cellulaires en cristaux insolubles de formazan de couleur bleue qui se déposent au fond du puits. La formation des cristaux de formazan est contrôlée au microscope (Olympus®), le milieu de culture est ensuite éliminé et 200µl de DiMethyl SulfOxide (DMSO) sont ajoutés. Afin de dissoudre les cristaux de formazan, on homogéneise à la pipette. L’absorbance est lue avec un lecteur de plaques à 540 nm. Les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules vivantes par rapport aux cellules non traitées (Mosmann, 1983).

Solution de MTT à 5 mg/ml : préparer extemporanément et en fonction du nombre de plaques à traiter, une solution de bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (Sigma) dans du tampon PBS 1X. Stériliser par filtration sur membrane d’acétate de cellulose de porosité 0,2 µm.
2.2. Test d’exclusion au bleu Trypan.
Le principe de cette technique est d’évaluer le nombre de cellules mortes ayant ingéré le bleu trypan tandis que les cellules vivantes l’excluent.

- à 500 µl de suspension cellulaire, ajouter 50 µl de solution de Bleu Trypan à 0,4 % (Biomerieux)

- homogénéiser à la pipette et attendre 5 min.

- déposer une goutte de suspension colorée sur la lame de l'hémocytomètre

- laisser sédimenter quelques instants

- procéder à la numération cellulaire en cellule de Malassez :

* les cellules colorées en bleu sont mortes (perméables au colorant)

* les cellules non perméables restent claires et réfringentes : elles sont vivantes et seules à être prises en compte.
Remarque : la préparation ne doit pas contenir plus de 20 % de cellules mortes (sauf après décongélation où l'on peut en trouver davantage), pour mettre les expériences en pratique. Les cellules (notées N) présentes dans la cellule de Malassez correspondant à un volume de 1 µl sont notées N. Le nombre de cellules est alors de N cellules / µl soit : N  x 103 cellules / ml.

3. Traitements des cellules.



3.1. Préparation des solutions.
Solution de lovastatine : Dissoudre 4 mg de lovastatine dans 100 µl d’éthanol et chauffer légèrement entre 40 et 45 °C. Quand la solution est bien limpide, ajouter 890 µl de NaOH 0,1 N. La solution obtenue a une concentration de 10-2 M. La solution sera diluée afin d’obtenir des solutions à 10-3 M et 10-4 M.
Solution de fluvastatine : 4,33 mg de fluvastatine sont dissouts dans 1 ml d’eau stérile pour obtenir une solution de 10-2 M. Les solutions à 10-3 et 10-4 M sont obtenues par dilution de la solution mère dans de l’eau stérile.
Solution d’atorvastatine : 5,77 mg d’atorvastatine sont dissouts dans 500 µl de DMSO ; la solution obtenue a ainsi une concentration de 2.10-2 M. Les solutions à 2.10-3 et 2.10-4 sont obtenues par dilution de la solution mère. La toxicité apparaît à partir de 0,0625% de DMSO (Doostdar et al., 1988) ; les concentrations des solutions sont alors adaptées en fonction du volume déposé dans les boites de Pétri.
Solution de pravastatine : 4.46 mg de pravastatine sont dissouts dans 1 ml de méthanol afin d’obtenir une solution mère de 10-2 M, les solutions à 10-3 et 10-4 M sont obtenues par dilutions successives de la solution mère.
3.2. Traitements.
Les cellules sont cultivées pendant trois jours dans des boîtes de Pétri. Le milieu est ensuite remplacé par du milieu sans sérum de veau et les cellules sont soit non traitées soit traitées pendant trois jours par les différentes solutions de statines ou par les solvants respectifs de chaque molécule.
1   ...   10   11   12   13   14   15   16   17   ...   32

similaire:

Rapporteurs : Pr Lysiane Richert iconRapporteurs

Rapporteurs : Pr Lysiane Richert iconRapporteurs

Rapporteurs : Pr Lysiane Richert iconRapporteurs

Rapporteurs : Pr Lysiane Richert iconRapporteurs

Rapporteurs : Pr Lysiane Richert iconRapporteurs : Madame Emmanuelle reynaud

Rapporteurs : Pr Lysiane Richert iconRapporteurs : Professeur Bruno levy (Nancy)

Rapporteurs : Pr Lysiane Richert iconRapporteurs
«kmp girls» qui se reconnaitront ici et à Bruno Delépine qui me fait l’honneur de participer au jury de la thèse








Tous droits réservés. Copyright © 2016
contacts
b.21-bal.com