I. Généralités tp sur lectine Con A. A. Application








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date de publication18.11.2017
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Analyse moléculaire et biologique

Chapitre 1 :

Lectines (pytohemagglutinine) : protéines ou glycoprotéines qui reconnaissent des structures glycaniques (oses ou osides).

I.Généralités


TP sur lectine Con A.

A.Application


Les lectines étaient au départ extraites à partir de végétaux. Les lectines, vis-à-vis de certains types d’hérithrocites, forment des agglutinations. Les oses présents dans les glycoconjugués diffèrent entre les groupes sanguins. La spécificité des groupes sanguins est portée par des molécules glycaniques. On utilise donc des lectines pour identifier un groupe sanguin.

Glycoconjugués : 2 classes de molécules : glycolipides et glycoprotéines. Exemple : ovalbumine, immunoglobulines.

Sur une lectine il y a 4 binding sites.



glycanes

On a cherché ces protéines dans le but de leur faire détecter des cellules tumorales. Il fallait donc purifier des protéines qui reconnaissent des glycanes qui détectent les tumeurs. Ce qui entraina l’apparition de la chimiothérapie anti tumorale. La cellule tumorale à un métabolisme plus rapide qu’une cellule saine. Deunorubicine : drogue anti-tumorale. Mais il y a des effets secondaires : perte des cheveux, vomissements… Mais elle avait aussi une cardio-toxicité, et donc pouvait entrainer la mort par arrêt cardiaque. Donc il faut faire un ciblage de drogues anti-tumorales : « Drug-targetting ». On cherche donc à cibler spécifiquement la drogue suivant la tumeur. Mais trouver le vecteur spécifique n’est pas évident. On a cherché des marqueurs spécifiques. Dans les années 70, des techniques ont été mises au point pour préparer des anticorps monoclonaux.

B.Vaccination


Il faut injecter avant d’être malade des macromolécules (immunogènes) associées à l’agent pathogène. A la surface de la grippe, et donc de H5N1, on trouve 2 molécules : Hémagglutinine (lectine) et neuraminidase. Un immunogène est une macromolécule qui mène à une réponse immunitaire une fois injectée : synthèse d’anticorps capables de reconnaître des molécules particulières. Ce sont des lymphocytes B qui se différencient en plasmocytes. Ils produisent des anticorps neutralisants (polyclonaux) dirigés contre les cibles (H et N).

Si les antigènes sont reconnus, on peut éliminer les complexes Anticorps-Antigènes. On avait préparé des protéines qui reconnaissent des antigènes présents à la surface de la cellule tumorale. On voulait en plus mettre des drogues qui reconnaissaient les tumeurs. A la surface de nos alvéoles pulmonaire, on a trouvé NANA : N-Acetyl Neuraminic Acid = acide sialique. C’est un nonose. Interaction sucre-protéine importante.

Problème d’extraction des protéines.

C.Structure des protéines


  • Structure primaire : connaître la séquence des acides aminés correspondant à cette protéine. A gauche : N-ter A droite : C-ter

  • Structure secondaire : hélice α ou feuillet β. S’il y a des assemblages, on a des β-turn.

Structure tertiaire : Structure 3D des hélices α et feuillet β, avec possibilité de changement de conformation. A une conformation donnée on a une propriété chimique donnée. Configuration diffère de conformation par une rupture de liaisons covalentes dans le cas de la configuration. Exemple : 3 sucres



β-Glc glycopyranose glucose




mannose Man



galactose




α-Glc glycopyranose glucose Glc

Ce sont des représentations de Haworth
Pour passer de l’un à l’autre il faut casser des liaisons pour les refaire dans un sens différent : changement de configuration. Idem entre α-Glc et β-Glc.


Conformation chaise


Une β glucose en 4C1, tous les hydroxyles sont en position équatoriale. Changement de conformation de 4C1 à 4C1 par apport d’énergie. Dans le cas 4C1, tous les hydroxyles sont en position axiale. La conformation la plus stable est celle qui a le plus d’hydroxyles en position équatoriale.

  • Structure quaternaire : auto association de sous unités polypeptidiques identiques ou différentes associées par des liaisons non covalentes. Exemple : l’hémoglobine, qui contient 2 chaines α, et 2 chaines β. La myoglobine est une structure tertiaire, mais pas quaternaire, bien qu’elle ressemble à la structure 3D de l’hémoglobine.

Les acides aminés sont tous de la série L sauf 1 qui est de la série D : la Glycine. Liaison CONH s’appelle liaison peptidique Amine plane Trans.

II.Extraction des protéines

A.Choix du matériel biologique


Il faut faire un choix sur le matériel biologique de départ. Il faut prendre en compte le cout, et la biodisponibilité du matériel de départ. La chitine est un polysaccharide, c’est l’équivalent de la cellulose, mais avec de la N-acétyl glucosamine (voir 1). La limule (Horse shoe crab), a un liquide physiologique bleu (plutôt que rouge). Chez nous, l’atome de fer qui est oxydé donne la couleur rouge. Chez la limule, l’hémolymphe a un atome de cuivre, ce qui donne la couleur bleue, de par les hémocyanines contenues. La limuline, qui est un lectine, présente dans l’hémolymphe présente un intérêt majeur, puisqu’elle reconnaît des choses intéressantes. La limule se trouve dans la baie de cap code, dans le Massachussetts. Pour faire venir l’hémolymphe, il fallait la congeler. Cependant, la congélation dénaturait l’hémolymphe. Mais notre objectif est de purifier la protéine qui a encore une activité biologique. Se pose encore le choix du matériel biologique. Il fallait éviter la décongélation de l’échantillon, puisqu’il aurait fallu le recongeler, et donc le dénaturer un peu plus. La solution était d’utiliser de la carboglace (Dry ice). La carboglace c’est du CO2 solide. La carboglace se sublime (solide à gazeux). Cependant, 40g de glace donne 22,4 litres de liquide. Il ne fallait donc pas mettre de carboglace dans un espace confiné. Il fallait de plus prévoir des quantités suffisantes pour toute l’année. Le problème de la congélation est la favorisation de l’agrégation des protéines. Il ne faut donc pas congeler, décongeler, recongeler… Il faut faire des fragments aliquotes, de façon à ne pas décongeler tout l’échantillon. La congélation c’est surtout la conservation, qui peut être conservée à -80°C, dans le cas d’ultracongélation. Les congélations doivent se faire rapidement. On peut les faire avec de l’azote liquide. Les légumineux sont très riches en lectines.

Griffonia simplicifolia

B.Mise en évidence de la protéine


La question à se poser est : quel type de protéines doit-on purifier ? Mais le problème, c’est qu’à chaque étape de la purification, il faut prouver la présence de la protéine. Il faut donc un produit spécifique de la protéine qui permet de mettre en évidence cette protéine. Pour les lectines, on fait un test d’agglutination des lectines.

Dans le cas d’E. Coli, on cherche à mettre en évidence la β-galactosidase d’E. Coli. Elle coupe les liaisons β à partir d’un échantillon de galactose. C’est une enzyme

Structure du lactose : Galactose β-1,4-Glucose

N-acétyl lactosamine : Galactose β-1,4-Glucose N-acétyl glucosamine

β -galactosidase coupe la liaison β-1,4 du lactose. L’idée, c’est de repérer l’activité enzymatique, grâce à de la colorimétrie (petits disques qui deviennent jaunes).

Voir 2

L’inconvénient de cette méthode est qu’il faut être en milieu basique. C’est un test colorimétrique, qui ne marche pas en milieu acide. Il y a beaucoup de test de révélation par coloration. Le seul inconvénient, c’est que ce n’est pas très sensible. On a des méthodes plus sensibles, en faisant de la spectrofluorimétrie :

D’un état fondamental en début de cours, nous passons à un état d’excitation singulé, par apport d’énergie, assimilé à l’ambiance du cours. ΔE=hν h : constante de Planck ν : fréquence

νλ=c c : célérité λ=c/ν

Après avoir absorbé les lumières du prof, on repasse à notre état fondamental en réémettant les lumières. Le passage à l’état fondamental est appellé ΔE’, plus petit que ΔE, puisque ΔE= ΔE’+Q

ν’<ν λ’>λ

Les protéines absorbent les UV, et les réémettent à une longueur d’onde plus élevée. C’est le principe de la fluorescence. On voit une lumière absorbée en UV. La phosphorescence se fait dans un état excité triplé, plus faible que le singulé, mais qui peut être irradié par des états singulés. Le retour à un état fondamental se fait avec encore plus de perte :

ΔE’’< ΔE’< ΔE ν’’< ν’< ν λ’’> λ’> λ

La durée de vie d’un état d’excitation triplé peut durer plusieurs minutes. On ne peut pas manipuler des radio-isotopes facilement. Il vaut mieux les oublier.

Le lysozyme fut l’un des premiers antibiotiques utilisés. Il dégrade la paroi bactérienne. En particulier le peptidoglycane, contenu aussi bien par les gram+ que par les gram-. Le lysozyme coupe ce peptidoglycane. Il coupe entre le 3ème et le 4ème résidu de sucre.

Schéma 3

Antigène/Anticorps. On fait un test ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbant Assay

Dans des puits, on fixe un premier anticorps sur l’antigène. Puis on fixe un deuxième anticorps anti-premier anticorps, qui est couplé à de la beta galactosidase et autres.

Extraction de protéines à partir d’un liquide physiologique (plus difficile dans le cas d’un tissu) par extraction et non en solution. Il faut travailler à basse température pour ne pas dénaturer la protéine. On peut par exemple travailler en chambre froide.

C.Extraction de la protéine


On peut soit repartir d’un liquide physiologique, soit d’un solide. Dans un premier temps, on veut extraire des protéines hydrosolubles. La Protéine est diluée, il faudra envisager des méthodes de concentration avant de se lancer dans la purification.

1er cas : extraction de protéines hydrosolubles. Il faut utiliser des détergents. La protéine est diluée, il faut alors envisager des méthodes de concentration. Il faut alors chauffer à +100°C qui permet d’évaporer de l’eau pour augmenter la concentration en protéines. On ne peut appliquer cette technique à des protéines, car ça les dénature.

On peut ajouter du sel qui capte l’eau, pour précipiter les protéines.

On peut utiliser la lyophilisation. Pour lyophiliser un produit il faut d’abord congeler la solution. Ensuite, cette solution congelée, on la met sous enceinte à pression réduite. La glace fait alors une sublimation. L’eau se sublime et on va mettre un piège très froid qui va de nouveau condenser l’eau, et la piéger sous forme de glaçon. Pour augmenter la surface de congélation, on va congeler les échantillons à lyophiliser en coquilles. L’évaporation provoque le froid. De même, la sublimation entraine un refroidissement de la paroi. Il y a une compensation thermique due à la température ambiante, qui empêche les échantillons de descendre à la même température que le piège. Les appareils industriels ont besoin d’une petite résistance chauffante pour éviter que l’échantillon baisse trop en température. Tous les produits lyophilisés ne gardent pas leurs propriétés quand on les remet en solution. Le risque majeur est une agrégation des produits lyophilisés : c’est une dénaturation, les protéines se collent les une aux autres.

Si on laisse des tissus végétaux comme par exemple des pommes coupées, ils brunissent, à cause de l’oxydation des tissus. La solution est de mettre un agent antioxydant (réducteur), comme par exemple le jus de citron. En broyant des tissus, on libère des endopeptidases, des protéases, qui coupent les protéines. Par exemple, la trypsine (coupe au niveau des Arginines et des Lysines), la chymotrypsine (au niveau des aromatiques). Pour éviter cela, il faut ajouter des inhibiteurs de protéases. On peut jouer sur un autre paramètre pour limiter les dégradations et les cinétiques : la température. On aura l’habitude de travailler à 4°C. Il faut de plus limiter l’acidité, en travaillant dans un tampon. Pour travailler aux alentours de 7,2°C, on utilisera des tampons phosphates, ou des tampons Tris/HCl.

1.Lyophilisation


On peut utiliser la lyophilisation. Pour lyophiliser un produit il faut d’abord congeler la solution. Ensuite, cette solution congelée, on la met sous enceinte à pression réduite. La glace fait alors une sublimation. L’eau se sublime et on va mettre un piège très froid qui va de nouveau condenser l’eau, et la piéger sous forme de glaçon. Pour augmenter la surface de congélation, on va congeler les échantillons à lyophiliser en coquilles.

L’évaporation provoque le froid. De même, la sublimation entraine un refroidissement de la paroi. Il y a une compensation thermique due à la température ambiante, qui empêche les échantillons de descendre à la même température que le piège. Les appareils industriels ont besoin d’une petite résistance chauffante pour éviter que l’échantillon baisse trop en température. Tous les produits lyophilisés ne gardent pas leurs propriétés quand on les remet en solution. Le risque majeur est une agrégation des produits lyophilisés : c’est une dénaturation, les protéines se collent les une aux autres.

Si on laisse des tissus végétaux comme par exemple des pommes coupées, ils brunissent, à cause de l’oxydation des tissus. La solution est de mettre un agent antioxydant (réducteur), comme par exemple le jus de citron. En broyant des tissus, on libère des endopeptidases, des protéases, qui coupent les protéines. Par exemple, la trypsine (coupe au niveau des Arginines et des Lysines), la chymotrypsine (au niveau des aromatiques). Pour éviter cela, il faut ajouter des inhibiteurs de protéases. On peut jouer sur un autre paramètre pour limiter les dégradations et les cinétiques : la température. On aura l’habitude de travailler à 4°C. Il faut de plus limiter l’acidité, en travaillant dans un tampon. Pour travailler aux alentours de 7,2°C, on utilisera des tampons phosphates, ou des tampons Tris/HCl.

2.Précipitation


Pour concentrer notre échantillon, on peut utiliser la précipitation.

La solubilité décroit de façon exponentielle avec l’augmentation la force ionique



Force ionique : µ = ½ ∑ Ci Zi²

NaCl 0,1 M

± = ½ (0,1 x 1 + 0,1 x 1²) = 0,1

0,1 M de sulfate d’ammonium : (NH4)2 SO4 Ammonium NH4+ + SO42-

µ = ½ (0,2 x 1² + 0,1 x 2²) = 0,3

Tampon Phosphate Na3 PO4 Na2 H PO4 Na H2 PO4

Na2 H PO4 se dissocie en : Na+ + H PO42-

Na H2 PO4 se dissocie en : Na+ + H2 PO4-

µ Na2 H PO4 = ½ (0,2 x 1² + 0,1 x 2²)

La force ionique augmente très vite quand on utilise des sels polyvalents.

On rajoute du Na N3, de l’Azoture de Na, ou de l’Azide de Na, qui tue les micro-organismes qui veulent se développer dans les préparations. Dans des conditions standard, la concentration de se bactéricide est de 2 pour 10 000 (2 grammes dans 10 litre de solution).

Toute protéine présente une solubilité optimale pour une force non nulle, équivalente de 0,15 M NaCl, qui équivaut aux conditions physiologiques.

3.La dialyse


Il existe des boudins de cellulose, qui une fois hydratés forment des membranes semi perméables. Si l’on trempe un boudin dans un large volume d’eau, elle va chercher à atteindre un équilibre osmotique, et donc les sels sortent du boudin, et de l’eau va rentrer à la place. On va chercher au final à accélérer la sortie, car elle va ralentir si l’on change l’eau de dialyse. Donc on ajoute du sulfate d’ammonium, qui va permettre de précipiter plus rapidement. La purification se fait par centrifugation. La solution est saturée en sulfate d’ammonium. S’il reste des cristaux dans le solvant, la solution est saturée jusqu’à 100%. On utilise alors la technique de fractionnement des protéines par re-largage du sulfate d’ammonium (salting-out effect). Il y a moins de protéines dans le sérum que dans le plasma. Il s’agit d’une technique non dénaturante. La précipitation peut se faire soit par du sulfate d’ammonium, soit par des solvants organiques miscibles à l’eau. Les protéines sériques sont de l’éthanol à froid °C, initialement fractionnés (fraction de Cohn).

4.L’ultrafiltration




Après la pression, le solvant et les sels minéraux passent à travers la membrane. Cette technique est valable pour de petits volumes. On peut définir la notion de rétentat, qui est la partie de protéines qui ne passent pas à travers la membrane filtre (différent du filtrat). A l’échelle du laboratoire, on peut faire de l’ultrafiltration par filtron (1 mL  10 mL). L’eau devient miscible à l’éthanol, ce qui entraine éventuellement des composés colorés. Puis la centrifugation (culot imbibé d’éthanol) permet l’extraction des lipides avec le dichlorométhane.
HPLC
  1. ELEMENTS DE THEORIE

    1. Définition générale de la chromatographie


"C'est un ensemble de procédés, applicables à des mélanges moléculaires ou ioniques, basés sur des différences de distribution des solutés entre une phase stationnaire, généralement dispersée, et une phase mobile continue, les deux phases étant mises en contact intime et à contre courant."
    1. Cas de la Chromatographie Liquide Haute Performance


  • La Chromatographie Liquide Haute Performance, initialement chromatographie liquide haute pression, est basée sur les mêmes principes que la chromatographie sur colonne et met en oeuvre, selon la nature de la phase stationnaire, aussi bien des phénomènes de partage que d'absorption, d'échange d'ions ou d'exclusion.

  • La chromatographie de partage est la plus usuelle et permet la mise en oeuvre de deux types de phase stationnaire :

    • soit une phase stationnaire normale (polaire) qui nécessite l'utilisation d'une phase mobile peu polaire (hydrocarbures).

    • soit une phase stationnaire inverse ou greffée (non polaire) qui nécessite l'utilisation d'une phase mobile polaire (mélanges : eau-méthanol ; eau-acétonitrile ; eau-tétrahydrofuranne).

  • Exemples de phases stationnaires :

  • amine : - (CH2)3 - NH2 (polarité forte)

  • nitrile : - (CH2)n - C N (polarité moyenne)

  • alkyle : - (CH2)7 - CH3 (apolaire) "colonne C8"

  • alkyle : - (CH2)17 - CH3 (apolaire)"colonne C18"

  • phényle : - (CH2)n - C6H5 (apolaire)



CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE OU H.P.L.C.
  1. SCHEMA DE PRINCIPE D'UN APPAREIL D'HPLC


  • Dans tout appareil de chromatographie liquide haute performance on retrouvera toujours les éléments de base suivants :

    • un ou plusieurs réservoirs de phase mobile contenant soit des solvants purs soit des mélanges de solvants dans des concentrations connues.

    • un système d'injection comportant une boucle d'échantillonnage calibrée (généralement une vanne RHEODYNE).

    • une colonne remplie, en acier inox, de quelques centimètres de long.

    • un détecteur permettant à la fois, de mettre en évidence la sortie des solutés de la colonne et de donner un signal proportionnel à la quantité de chacun de ces solutés, dans un mélange.

  • Les principaux détecteurs utilisés sont les suivants : détecteur réfractométrique, détecteur U.V. (classique ou à barrette de diodes), détecteur à conductivité thermique, détecteur électrochimique, ...(cf. annexe I).

c:\aurel\cours\analyse moléculaire biologique\chm12.gifc:\aurel\cours\analyse moléculaire biologique\chm14.gif

  • L'utilisation d'un solvant pur ou d'un mélange de solvants de composition constante dans le temps correspond à une étude en mode ISOCRATIQUE.

  • L'utilisation d'un mélange de solvants dont la composition est variable dans le temps correspond à une étude en mode GRADIENT.
  1. ETUDE DETAILLEE DES ELEMENTS D'UN APPAREIL D'HPLC.

    1. La colonne


La colonne qui sera utilisée pendant la séance de travaux pratiques est une µBONDAPAK C18 de chez WATERS. Elle est remplie d'une phase stationnaire greffée (chaîne alkyle linéaire à 18 atomes de carbone) non polaire. La granulométrie des grains garnissant la colonne est de l'ordre de 6 à 10 µm. Si dans le cadre des travaux pratiques la colonne travaille à la température ambiante, il est possible d'effectuer des séparations à des températures variables.
    1. L'éluant


  • La colonne utilisée contenant une phase stationnaire non polaire (encore appelée phase inverse) on choisira un solvant soit polaire soit moyennement polaire, ce qui permet l'utilisation de l'eau, solvant polaire, associée à des solvants moins polaires tels que le méthanol, l'acétonitrile ou le tétrahydrofuranne.

  • Dans le cadre des études menées au cours de la séance de travaux pratiques on utilisera un mélange eau-méthanol de composition variable dans le temps (utilisation de l' Automated Gradient Controler WATERS).

  • La phase stationnaire étant non polaire et le méthanol un solvant moins polaire que l'eau, un enrichissement du mélange des deux solvants en méthanol le rendra plus élutif.

  • L'utilisation de solvants en HPLC implique le respect de quelques règles essentielles :

    • utilisation de solvants spécifiques pour l'HPLC

    • utilisation d'eau déminéralisée exempte de toute trace de matière organique

    • filtration nécessaire des solvants sur filtres spéciaux (0,4 à 0,5 µm)

    • dégazage des solvants aux ultrasons après filtration

    • les solvants utilisés en HPLC sont fraîchement préparés chaque jour selon les règles énoncées ci-dessus.
    1. Les pompes (WATERS 501 HPLC POMP)


  • Les pompes utilisées en HPLC permettent de délivrer les solvants à débit constant sous de fortes pressions pouvant atteindre quelques centaines de bar (70 bars # 1000 psi).

Schéma d'une vanne rhéodyne




    1. L'injecteur


Le type d'injecteur le plus couramment utilisé comporte une vanne à boucle d'échantillonnage d'une capacité fixée à 10, 20, 50, ... µl. Cette boucle calibrée, remplie de l'échantillon à étudier, peut être introduite, sans variation importante de la pression, dans le circuit allant des pompes vers l'entrée de la colonne.
    1. Le détecteur (L.C. SPECTROPHOTOMETER WATERS).


Le type de détecteur qui équipe l'appareil utilisé en travaux pratiques est un détecteur à absorption U.V. (c'est le détecteur le plus utilisé en HPLC), travaillant à une longueur d'onde fixe mais réglable dans la gamme 190 - 800 nm. Il est constitué d'une cuve à circulation en quartz, d'une capacité d'environ 10 µl, traversée en continu par le faisceau U.V.
    1. Le calculateur-enregistreur (WATERS 740 Data module).


  • Le signal généré par le détecteur est transmis au calculateur muni d'une table traçante intégrée.

  • Les différents réglages indispensables à un bon usage du calculateur sont précisés dans le document disponible en travaux pratiques.
  1. MANIPULATION


La manipulation sera divisée en deux parties : étude en ISOCRATIQUE et étude en GRADIENT.
    1. Etude en ISOCRATIQUE


L'ensemble des études en mode isocratique se fera sur le mélange des trois PARABEN suivants :c:\aurel\cours\analyse moléculaire biologique\chm16.gif

  • le parahydroxybenzoate de méthyle :

c:\aurel\cours\analyse moléculaire biologique\chm17.gif


  • le parahydroxybenzoate d'éthyle :

c:\aurel\cours\analyse moléculaire biologique\chm18.gif

  • le parahydroxybenzoate de propyle :



      1. Etude de l'influence de deux paramètres : débit et polarité de l'éluant, sur la séparation de ces trois paraben


  • Enregistrer le chromatogramme du mélange de ces trois solutés

  • Vérifier l'équilibre du système pression - composition de l'éluant

  • Enregistrer le chromatogramme de chaque "paraben" à l'état pur. CONCLUSION ?

  • Etudier l'influence du débit de l'éluant sur la séparation des trois" paraben". Cette étude se fera pour trois débits différents. CONCLUSION?

  • Etudier l'influence de la polarité de l'éluant sur la séparation des trois paraben au débit défini dans le cadre de l'étude 1.4. Cette étude se fera pour trois % de méthanol différents. CONCLUSION ?

  • Rechercher les conditions optimales de séparation des trois paraben (recherche du meilleur compromis résolution - séparation pour un temps d'analyse le plus faible possible).

  • Pour cette mise au point on disposera de deux essais maximum.
      1. Analyse quantitative d'un mélange inconnu des trois paraben par la méthode de l'étalon externe à un point de calibration.


  • Enregistrer le mélange des trois paraben de concentrations connues (exprimer ces concentrations en mg l-1) dans les conditions optimales définies précédemment.

  • Programmer l'intégrateur en suivant strictement le mode opératoire mis à disposition. Pour chacun des constituants du mélange l'appareil mémorise une courbe d'étalonnage spécifique à partir du zéro et du point de calibration fonction de la concentration connue.

  • Enregistrer le chromatogramme du mélange inconnu, l'intégrateur donne directement la concentration de chacun des solutés du mélange dans l'unité de mesure choisie au départ (mg l-1).
    1. Etude en GRADIENT


  • Tester les trois gradients sauvegardés dans les mémoires 1, 2, 3 du programmateur.

  • A partir de l'analyse des résultats obtenus rechercher le meilleur gradient possible permettant d'obtenir une bonne résolution accompagnée d'une dérive continue de la ligne de base pour un temps d'analyse le plus faible possible.

  • Effectuer le maximum d'essais dans le créneau de temps disponible.

REMARQUE : attention le volume mort entre la chambre de mélange des solvants à la sortie des pompes et l'entrée de la colonne correspond à un temps de migration des solutés de l'ordre de trois minutes.

TD1 de Biologie Moléculaire
Introduction

Exercice 1 :

Bases puriques : Adénine, guanine

Bases pyrimidiques : Thymine, cytosine, uracile

Pyrimidine :










Cytosine : 2-oxy-4-aminopyrimidine

Thymine : 2,4-dioxy-5-méthylpyrimidine ou 5-méthyluracile

Uracile : 2,4-dioxypyrimidine

Purine :

Adénine : 6-aminopurine

Guanine : 2-amino-6-oxypurine

Tautomérie : manière d’écrire une même molécule d’au moins deux manières différentes en délocalisant les électrons.

Tautomères :

-Cétone/Alcool :

-Imine/Amine

-Amino cétone (Lactame)/Imino alcool (Lactime)

Analyse des Biologies moléculaires

Prendre blouse et marqueur
  1. La Concanavaline A


Protéine étudiée : con A contenue dans la fève Jack

Purification de la protéine par chromatographie d’affinité, pour purifier en une seule étape. On va évaluer son activité, et faire une analyse électrophorétique. La plante est la fève Jack ou Canavalia ensiformis, plante dressée, avec des stolons, qui s’enroule autour d’un support, parfois buissonnante, pouvant atteindre 10m. Elle s’enracine profondément. Elle résiste à la sécheresse. La graine est comestible mais toxique en grande quantité.

Lectines : protéines ou glycoprotéines non immunes qui s’attachent à des sucres. Elles ont la capacité d’agglutiner des cellules ou de précipiter des polysaccharides ou des glycoconjugués. Pour que les cellules s’agglutinent, il faut que la protéine ait 2 sites de reconnaissance (au moins 2 sous unités). Chaque lectine est définie par sa spécificité osidique. La reconnaissance est plus ou moins forte. On détermine cette force en calculant la concentration minimale de monosaccharides nécessaires pour inhiber l’accumulation.

Molécule tétramérique de 106kDa. 4 sous-unités identiques de 26,5kDa. Association des sous unités dépendante du pH : en dessous de 5,6, association de 2 sous-unités, pour des valeurs de pH supérieur, forme tétramérique. Métalloprotéine. Activité biologique qui nécessite obligatoirement Mn2+ et Ca2+. Site de liaison avec Man caractérisé d’un point d vue structural.

Précipite certains biopolymères contenant des résidus glucopyranosyl (ou leurs dérivés acétomido-2-désoxy-2) ou mannopyrannosyl ou encore fructofuranosyl si ceux-ci sont en position terminale non réductrice.

Elle reconnaît le glycogène, l’amidon, les dextrans, les mannanes et fructanes, certaines glycoprotéines, les substances des groupes sanguins, les lypopolysaccharides…

Elle représente 20% des protéines de la farine de fève Jack. Elle est contenue dans des poches de réserves.

La chromatographie d’affinité permet a partir d’un milieu bio complexe de fixer de façon sélective et réversible une protéine ayant une affinité pour le support choisi.

Schémas 1

Dextran : polysaccharide, polymère de glucose.
  1. Chromatographie d’affinité

    1. Fixation


Fixation de la con A sur les grains de gel de dextran, les autres protéines ne s’y fixent pas.
    1. Adsorption


Après lavage par une solution de NaCl…
    1. Désorption


Décrochage de la Con A du support par du D-glucose.

Schéma « principales manipulations à réaliser » du polycopié.

Etape 1 : on place la farine dans une solution de NaCl. Tout ce qui est soluble se retrouve en solution.

Etape 2 : précipitation au sulfate d’ammonium à 30% de saturation. On élimine une certaine quantité de protéines.

Le matériel soumis à la chromatographie d’affinité est un matériel déjà prétraité afin d’éliminer les protéines indésirables.

On apprécie l’état de pureté et on détermine son poids moléculaire par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, en présence de SDS. SDS dénature la protéine, qui perd sa structure tertiaire, voir quaternaire. Elle se retrouve porteuse d’une charge globale négative. En plus, on ajoute le beta-mercatoéthanol qui rompt les ponts disulfures entre les sous-unités. Elles seront ensuite séparées suivant leur masse.

Piste 5 : marqueurs

Piste 4 : molécule brute

Piste 3 : molécule lavée

Piste 2 : produit de décrochage

Piste 1 : con A commerciale.

Détermination de l’activité de la protéine, qui a la capacité de reconnaître des sucres. Pour cela, on met en œuvre un teste d’érythoagglutination : soit il y a agglutination (protéine inactive), soit il y a non-agglutination (protéine active). On le fait sur microplaque. S’il y a assez de lectine pour agglutiner les globules rouges, on obtient un tapis de globules rouges qui recouvre le fond du puits. S’il n’y a pas assez, les globules rouges sédimentent, mais ne s’agglutinent pas (on obtient un monticule au fond, on voit un point du dessus). On peut aussi déterminer la teneur en lectine, et la plus faible teneur en lectine nécessaire pour l’agglutination. Le titre de la solution de lectine est l’inverse de la dilution de la solution.
    1. Plan attendu


  1. Introduction /1

  2. Purification de la con A par chromatographie d’affinité /2

  3. Dosage des protéines par la méthode de Bradford /4

  4. SDS-PAGE /4

  5. Test d’érythroagglutination /3+2

  6. Conclusion /2

Réponse aux questions /1

  1. Documents annexes

1 point sur le soin.

    1. Conseils


Pas de rappels méthodologiques

Respect des 5 pages

Soin de la présentation : titre – sous-titre / marge

Maladresse d’expression : pas de lague parlée, de jargon

Fautes d’orthographe

Longueur des phrrases ; lourdeur de l’expression

Valeurs numériques : virgule, point

Dialysat

Puits

Paginer le document

Numéroter les figures, les tableaux, légender.

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