Virologie cours n°4 14/11/2008 à 8h30 Ronéotypeuse : Delphine Le Donné La chimiothérapie antivirale Plan I / Introduction








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Virologie cours n°4


14/11/2008 à 8h30

Ronéotypeuse : Delphine Le Donné
La chimiothérapie antivirale


Plan

I / Introduction



II / Qu’est-ce qu’un bon antiviral ?

A / Détermination du pouvoir antiviral d’une molécule
B/ Détermination de la résistance d’une souche virale à un antiviral


III/ Les différentes méthodes de mise au point des antiviraux
IV / Les cibles de la chimiothérapie antivirale
V / Les inhibiteurs d’attachement : exemple du VIH

A/ Structure et cycle de réplication du VIH

B/ Rôle de l’enveloppe virale dans l’infection
C/ Les co-récepteurs du VIH

D/ Les inhibiteurs d’entrée du VIH
VI / Les inhibiteurs de la libération du virus dans le

cytoplasme : exemple du virus grippal

A/ Structure des virus grippaux 

B/ Cycle des virus grippaux 

C/ Molécules qui interagissent avec M2 : Amantidine et Rimantidine
VII/ Les inhibiteurs de la réplication virale : exemples des virus de l’Herpès et du VIH

A / Herpès-virus

B/ VIH : Inhibiteurs de la réverse transcriptase
C/ Analogues nucléosidiques

D/ Analogues nucléotidiques

E/ Inhibiteurs non nulcéosidiques de la réverse transcriptase (NNRTIs)

F/ Analogues du pyrophophate

G/ Inhibiteurs de l’intégrase

VIII / Les Inhibiteurs des étapes finales de la réplication virale 

A / Les antiprotéases contre VIH 

B/ Les antineuraminidases contre les virus grippaux
IX/ Les limites de la chimiothérapie antivirale

X/ La résistance aux antiviraux : exemple du VIH


A/ Mécanismes d’apparition des mutations de résistance

B/ Causes de la sélection de mutants résistants

I/ Introduction
Le développement de la chimiothérapie antivirale fut lent et difficile pour différentes raisons :

1/ 3 propriétés intrinsèques des virus :

  • leur parasitisme intracellulaire strict (ne se répliquent qu’à l’interieur d’une cellule)

  • leur incapacité à s’autorépliquer

  • leur diversité (virus à ARN, ADN…)

2/ La chimiothérapie se heurte à trois obstacles :

- l’interférence avec le métabolisme cellulaire normal (risque de cytotoxycité car les antiviraux agissent aussi sur les composants cellulaires)

  • la variabilité génétique des virus

  • son incapacité à éradiquer l’infection virale latente (il est très difficile d’éradiquer un virus qui s’est intégré dans une cellule )

3/ Action virostatique et non virucide des antiviraux

4/ Le développement de certains vaccins a ralenti le développement d’antiviraux
Le développement de la chimiothérapie antivirale a été grandement facilité par l’avènement des techniques de biologie moléculaire :

  • la compréhension du cycle de multiplication virale a permis l’identification d’enzymes virales qui sont des cibles spécifiques pour les antiviraux

  • l’élaboration de techniques de diagnostic rapide permet la prescription précoce d’une thérapie antivirale adéquate favorisant son efficacité



II / Qu’est-ce qu’un bon antiviral ?
On attend d’un bon antiviral :

  • qu’il respecte les synthèses cellulaires normales

  • qu’il inhibe à l’intérieur des cellules la synthèse des constituants viraux effectuée sous le contrôle du génome viral.



A / Détermination du pouvoir antiviral d’une molécule






  • Haut du tableau : on fait plusieurs cultures de cellules avec le virus puis on rajoute notre molécule supposée être antivirale à des concentrations croissantes et on fait bien sûr une culture témoin sans antiviral. La multiplication du virus dans ces cellules se manifeste par des plages de lyse (petits ronds sur le schéma). On détermine ainsi la concentration inhibitrice 50 (CI50) = la concentration de la molécule pour laquelle 50% de la multiplication virale est inhibée.

  • Bas du tableau : on a des cultures cellulaires sans virus dans lesquelles on rajoute aussi de cette molécule, dont on recherche l’activité antivirale, à concentration croissante. A partir d’une certaine concentration il y a mort cellulaire. C’est ce qu’on appelle l’effet cytotoxyque. On détermine ainsi la concentration cytotoxique 50 ( CC50 ).

  • Index de sensibilité : IS = CC50/CI50

Un bon antiviral doit avoir un IS élevé ce qui signifie qu’il est cytotoxique à des concentrations très élevées de la molécules et qu’il limite la multiplication virale à des concentrations faibles.

Cette technique n’est plus utilisée ; cependant aujourd’hui on calcule toujours le IS grâce aux CC50 et CI50.

B/ Détermination de la résistance d’une souche virale à un antiviral




On représente le pourcentage d’inhibition de la réplication virale en fonction en fonction de la concentration d’antirétroviral. La courbe de gauche représente une souche sauvage témoin.

Quand une souche devient résistante la courbe sigmoïde est décalée sur la droite avec une CI50 plus élevée. On fait le rapport entre la CI50 de la souche étudiée et la CI50 de la souche sauvage témoin.

On considère qu’une souche virale est résistante quand sa CI50 est supérieure à 4 fois la CI50 de la souche témoin.
III/ Les différentes méthodes de mise au point des antiviraux
Pour savoir si une molécule est antivirale il existe plusieurs méthodes :

  • Le criblage à l’aveugle : les firmes pharmaceutiques ont fabriqué un très grand nombre de molécules dont elles ne connaissent pas l’activité (molécules orphelines). Quand un nouveau virus est mis en évidence ces molécules sont testées dessus. Ex : Zidovudine (AZT) et Névirapine (NVP)

  • Le criblage orienté : à partir d’une molécule identifiée par le criblage à l’aveugle on améliore ses caractéristiques chimiques.

  • La modélisation d’une molécule à partir de la structure tridimensionnelle de l’enzyme ciblée. On obtient des molécules appelées molécules de deuxième génération. C’est la technique la plus utilisée. Ex : les inhibiteurs de protéases.



IV / Les cibles de la chimiothérapie antivirale



Les cibles de la chimiothérapie antivirale sont classées en fonction de leur niveau d’action dans le cycle de réplication du virus.

Le cycle de réplication de tous les virus comporte 6 étapes :

  1. L’attachement du virus à la cellule

  2. La pénétration du virus dans la cellule

  3. La décapsidation partielle du virus (capside = protéines qui entourent et protègent le génome viral)

  4. La réplication virale

  5. L’assemblage du virus

  6. Libération du virus hors de la cellule


Nous allons maintenant étudier les différents types d’antiviraux à l’aide d’exemples.

V/ Les inhibiteurs d’attachement : exemple du VIH



A/ Structure et cycle de réplication du VIH
L’enveloppe virale du VIH est composée entre autres de deux glycoprotéines :

- gp120 est un trimère qui fait saillie à la surface de la cellule

- gp41 est un trimère qui traverse la double couche lipidique constituant le facteur de fusion du virus.



Le virus se fixe à son récepteur sur la cellule, puis il y a fusion entre l’enveloppe virale et l’enveloppe cellulaire, puis il y a décapsidation partielle, réverse transcription (l’ARN est rétrotranscrit en ADN), puis passage dans le noyau, intégration de l’ADN viral dans le chromosome cellulaire, transcription de l’ADN viral en ARNm, exportation du noyau, traduction des ARNm, assemblage, maturation et sortie du virus par bourgeonnement.
B/ Rôle de l’enveloppe virale dans l’infection
Le VIH est un virus enveloppé. Pour infecter les cellules les virus enveloppés doivent :

  • s’attacher à un récepteur spécifique sur la membrane cellulaire

  • entraîner un événement déclenchant la fusion des membranes. Cet événement peut être la diminution du pH ou la mise en action d’une partie des protéines d’enveloppe virale


En ce qui concerne le VIH :

- Les 3 sous-unités de gp120 se fixent à la 1ère boucle du récepteur CD4 de la cellule

  • changement de conformation du virus

  • apparition de la gp41

  • mise en contact de gp41 avec l’enveloppe cellulaire

  • fusion des deux enveloppes

- La fixation de gp120 au CD4 entraîne aussi une modification de la conformation de gp120

  • exposition d’un autre site de fixation de la gp120 à un co-récepteur traversant la membrane cellulaire



C/ Les co-récepteurs du VIH


Il existe deux types de co-récepteurs du virus HIV à la surface des cellules : CCR5 et CXCR4. Ce sont des récepteurs de chémokine.

Beaucoup de virus n’utilisent que CCR5. Ce sont des virus R5.

Beaucoup de virus utilisent les deux à la fois. Ce sont des virus R5/X4.

Quelques virus n’utilisent que CXCR4. Ce sont des virus X4.

D/ Les inhibiteurs d’entrée du VIH
Il existe trois classes majeures d’inhibiteurs d’entrée du VIH dans la cellule :

  • Les inhibiteurs de fixation du virus à CD4




  • Les inhibiteurs de fixation du virus aux co-récepteurs :

Ex : le Maraviroc est un inhibiteur de CCR5 qui est le seul antirétroviral qui agit en liant à une protéine cellulaire et non virale. Cela entraine donc une cytotoxicité. Cette molécule est donnée à des patients à un stade évolué. Ces patients sont surveillés très étroitement.

Ex : le Vicrviroc est en essai clinique





  • Les inhibiteurs de fusion :

Ex : l’Enfuvirtide s’attache à une partie de gp41. Il existe des résistances à cette molécule. Cette molécule n’est active que par voie cutanée, est très puissante et administrée à un stade tardif de l’infection.
VI / Les inhibiteurs de la libération du virus dans le cytoplasme : exemple du virus grippal

A/ Structure des virus grippaux 


  • 8 segments d’ARN au centre

  • protéines d’enveloppe : Hémagglutinine (HA), Neuraminidase (NA), Matrix1 (M1) tapisse l’intérieur de la couche lipidique, Matrix2 (M2).


B/ Cycle des virus grippaux 

- le virus se fixe à l’acide sialique à la surface des cellules, puis il est capté par un endosome dans la cellule.

- Il y a ensuite destruction de l’enveloppe virale par dissociation des protéines M1car M2 qui est un canal à protons tétramérique entraîne une acidification du contenu de la particule virale donc sa destructuration.

- Puis décapsidation, migration vers le noyau, transcription des ARN viraux en ARNm, réplication.
C/ Molécules qui interagissent avec M2 : Amantidine et Rimantidine

Ces molécules ne sont pas actives sur des sujets infectés.

Elles ont un effet préventif.

Ce sont des amines de synthèse qui se fixent sur M2 :

  • inhibition irréversible de l’activité canal à protons de M2

  • inhibition de l’entrée du virus dans la cellule

Elles n’ont pas d’action sur les virus de la grippe B mais sont très efficaces en prévention de la grippe A (200mg/j pendant 10 jours prévient les manifestations cliniques avec une efficacité identique à la vaccination dans 70% des cas).
VII/ Les inhibiteurs de la réplication virale : exemples des virus de l’Herpès et du VIH

A / Herpès-virus



Chez l’homme on trouve différents espèces d’herpès :

  • Herpès simplex types 1et 2

  • Varicelle-Zona

  • Cytomégalovirus

(pour ces 4 premiers il existe des antiviraux)

  • Herpès virus humain 6, 7 et 8

  • Virus d’Epstein-Barr

Ce sont des virus enveloppés.
Cycle de réplication des herpès-virus : le virus se fixe sur un récepteur. Fusion des enveloppes. Le virus va directement dans le noyau. Réplication de l’ADN viral grâce à l’ADN polymérase virale. Formation d’ARNm très précoces (pour la formation d’enzymes virales de la régulation de la réplication virale), précoces et tardifs (pour la formation de protéines virales). Assemblage du virus dans le noyau. Le virus traverse le pore nucléaire, le cytoplasme. Il est libéré dans le milieu extérieur.
Inhibition de l’ADN polymérase virale

Il existe plusieurs types d’inhibiteurs de l’ADN polyméras virale :

  • Les analogues de nucéosides :

- La désoxyguanoside (aciclovir, valaciclovir,penciclovir, famciclovir, ganciclovir, valganciclovir)

-La désoxyuridine (brivudine)

  • Les analogues de nucléotides : la cytidine (cidofovir)

  • Les analogues du pyrophosphate (foscarnet)


B/ VIH : Inhibiteurs de la réverse transcriptase
Il existe plusieurs types d’analogues de la réverse transcriptase du VIH :

  • Les analogues nucléosidiques

  • Les analogues nuclélotidiques

  • Les inhibiteurs non nucléosidiques

  • Les analogues du pyrophosphate


C/ Anaolgues nucléosidiques


Ils agissent par interférence avec la synthèse des acides nucléiques viraux.

Leurs cibles principales sont les enzymes virales de la réplication :

  • l’ADN polymérase pour les principaux antiherpétiques

  • la transcriptase inverse pour le VIH (AZT, 3TC, ddC, ddi, d4T)


Ce sont des promédicaments :

  • ils doivent pénétrer dans la cellule et subir une triphsphorylation par des kinases pour être actifs. Ces kinases peuvent être uniquement cellulaires ou cellulaires et virales et sont de concentration variable selon les étapes du cycle cellulaire et selon l’état d’activation de la cellule.

  • ils entrent en compétition avec les nucléosides triphosphates naturels en tant que substrats de l’ADN polymérase et pour certains avec des ADN polymérases cellulaire. Ils deviennent des substrats privilégiés.


Ils agissent :

  • soit en bloquant le site actif de l’enzyme, empêchant ainsi la fixation d’une nouvelle molécule

  • soit en s’incorporant dans le brin d’ADN néo-formé = ce sont alors des terminateurs de chaine d’ADN. C’est leur mode d’action principal.


Ils diffèrent des nuclésides naturels puriques et pyrimidiques par l’absence du groupement hydroxyle en position 3’ du désoxyribose qui est nécessaire à la croissance de la chaine d’ADN.

Ils ont une affinité 100 fois plus grande pour la réverse transcriptase que pour les ADN polymérase cellulaire (ils inhibent aussi une Adn mitochondriale)

On peut obtenir une quantité importante d’analogues de nucléosides différents car le nucléoside peut subir de nombreuses modifications :

  • substitution d’atomes

  • modification de la base azotée

  • remplacement du sucre par un autre

  • addition de groupements fonctionnels

  • modification de l’hydroxyle

  • rupture du cycle


Exemple de la Ribavirine analogue de la guanosine

  • Son spectre d’activité antivirale est assez large

  • Virus Respirtoire Syncytial (VRS) : elle est administrée par aérosols pour le traitement des bronchiolites sévères

  • Hépatite C : elle est utilisée dans le traitement des hépatites chroniques en association avec l’interféron

  • Adénovirus, rougeole, oreillons, fièvres hémorragiques…

  • Elle n’est pas bien tolérée (peut provoquer une anémie transitoire). Elle a une activité tératogène chez les rongeurs. Elle ne doit pas être utilisée chez la femme enceinte.


L’efficacité d’un nucléoside dépend :

  • de son aptitude à être facilement phosphorylé dans la cellule (l’étape limitante étant la première phosphorylation)

  • de l’affinité du nucléoside tripohsphorylé vis à vis de la transcriptase inverse qui devra être plus grande pour les polymérases cellulaires (il y a un risque de toxicité, notamment mitochondriale, si le nucléoside est incorporé par une enzyme cellulaire)


Les précurseurs d’analogues de nucléosides

  • Ce sont des promédicaments qui ont été fabriqués pour pallier aux propriétés pharmacologiques défavorables de certains analogues, notamment en ce qui concerne leur disponibilité par voie orale

  • Ces précurseurs sont facilement absorbés par voie digestive

  • Ils sont métabolisés dans l’organisme pour donner un analogue nucléosidique actif

  • Ex : Valaciclovir, Valganciclovir (actifs sur les Herpès virus)


D/ Analogues nucléotidiques

Ce sont des molécules auxquelles on a rajouté un premier groupement phosphorylé. Elles ont donc une activité renforcée. Elles sont plus actives, interagissent mieux avec l’ADN polymérase du virus.

Ex : Cidofovir et Adéfovir pour les Herpès virus, Ténofovir pour le VIH et le VHB
E/ Inhibiteurs non nulcéosidiques de la réverse transcriptase inverse (NNRTIs)

Ils agissent en bloquant directement l’activité de la RT en se fixant sur un site très proche de son site catalytique.

Ils sont toujours utilisés en association car sinon il y a émergence rapide de virus résistants.

IL y en a deux sur le marché :

  • Névirapine : elle a une excellente biodisponibilité mais une toxicité cutanée et hépatique

  • Efavirenz : toxicité cutanée et neuropsychiatrique, contre-indiqué chez la femme enceinte car tératogène



F/ Analogues du pyrophophate


Le Foscarnet est un analogue de pyrophosphate qui a une action sur l’ADN polymérase sans étape de phosphorylation : il bloque la réplication de l’ADN viral en agissant sur un site proche mais différent du site de fixation des nucléosides naturels.

Il est utilisé pour les infections à cytomégalovirus (CMV) et le VIH
G/ Inhibiteurs de l’intégrase
Rappel sur le VIH : il y a formation d’un Adn viral bicaténaire qui passe dans le noyau où il est intégré grâce à une intégrase dans l’ADN chromosomique

Le Raltégravir bloque l’intégration de l’Adn viral dans l’Adn cellulaire. Il entraîne en monothérapie pendant 8 à 10j une diminution d’au moins 2log de la charge virale. C’est donc une des molécules les plus actives sur le VIH.


VIII / Les Inhibiteurs des étapes finales de la réplication virale
A / Les antiprotéases contre VIH 





La protéase est une protéine virale qui intervient avant la sortie de virus de la cellule. Elle sert à la maturation du virus. Si elle est inhibée, le virus peut sortir de la cellule, cependant il ne sera pas mature et ne pourra pas pénétrer dans une autre cellule.

Rôle de la protéase : l’ARNm viral comprend toutes les protéines internes du virus correspondant aux gènes gag et pol. Ce grand ARNm est traduit en une ployprotéine qui est clivée par la protéase.

La protéase virale est un dimère avec un centre catalytique. Les inhibiteurs de la protéase virale se fixent sur ce centre catalytique l’empêchant de fonctionner.

Ces inhibiteurs sont nombreux (Saquinavir, Ritonavir, Indinavir, Nelfinavir, Amprenavir, Lopinavir, FosAmprenavir, Atazanavir…)
B/ Les antineuraminidases contre les virus grippaux
A la fin de la réplication des virus grippaux, le virus est hors de la cellule mais reste accroché à celle-ci car son hémagglutinine se lie à l’acide sialique de la cellule. La neuraminidase va alors couper l’acide sialique, empêchant donc sa liaison avec l’hémagglutinine. Le virus peut alors partir.

Des inhibiteurs de neuraminidase vont donc forcer le virus à rester collé à la cellule.

Il en existe deux : Zanaminvir et Oseltamivir

IX/ Les limites de la chimiothérapie antivirale





  • Les antiviraux sont en général de spécificité étroite : le diagnostic doit donc être précis et il n’existe pas de thérapie à large spectre.

  • L’activité antivirale est limitée : il est difficile de contrôler la réplication à haut niveau et impossible d’éradiquer une infection latente.

  • Certaines toxicités cellulaires sont découvertes tardivement. Une surveillance à long terme est nécessaire.

  • Le coût est en général important

  • L’émergence de la résistance



X/ La résistance aux antiviraux : exemple du VIH




A/ Mécanismes d’apparition des mutations de résistance


Des mutations apparaissent dans le génome du virus du VIH car :

- La dynamique de production virale est très rapide (10^9 à 10^10 virions produits par jour)

- Le VIH a une variabilité génétique très importante : la transcriptase inverse fait des erreurs lors de la réplication (1 erreur par cycle et par virus). Les mutations apparaissent au hasard tout le long du génome.

- Avant tout traitement préexistent quelques variants viraux présentant des mutations de résistance.

B/ Causes de la sélection de mutants résistants


La résistance aux antiviraux est favorisée par :

  • La non- observance

  • Une posologie insuffisante

  • Les interactions pharmacocinétiques entre les médicaments

  • Un effet antiviral insuffisant


To all the bitches out there shaking their ass like they just don’t care…






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