Le bp brevet Professionnel de Préparateur en Pharmacie








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4.APPLICATION DES EXTRACTIONS
 
Elles sont utilisées pour des dosages particuliers.
En effet, l'extraction à contre-courant sert pour des concentrations, des purifications ou des identifications comme pour les antibiotiques et les peptides.
Ces séparations peuvent permettre d'isoler les isomères d'une substance ou les homologues d'une même série.
 
III.METHODES DE FRACTIONNEMENT ET DE PURIFICATION
 
1.PRECIPITATION
 
1.1.PRECIPITATION SIMPLE
 
C'est le phénomène par lequel il se forme un corps insoluble dans un liquide qui se dépose au fond du récipient.
Cette méthode est souvent une méthode analytique pour les protéines.
 
1.2.PRECIPITATION FRACTIONNEE
 
C'est une précipitation sélective souvent utilisée pour purifier partiellement ou totalement une substance ou pour fractionner un mélange.
 
2.DECANTATION-CENTRIFUGATION-ULTRACENTRIFUGATION
 
2.1.DECANTATION
 
C'est une méthode de séparation des solides des liquides lorsque la différence de densité est suffisante pour séparer les 2 phases.
 
2.2.CENTRIFUGATION
 
C'est une méthode qui utilise la force centrifuge et qui permet de séparer les particules d'un solvant.
En biologie, les particules sont généralement des cellules, des organites ou des macromolécules.
Ces particules vont se distinguer par leur dimension, leur masse et leur densité.
 
2.3.ULTRACENTRIFUGATION
 
C'est une centrifugation à très grande accélération et, pour éviter tout échauffement, le rotor va fonctionner dans une chambre dans laquelle on fait le vide et qui est réfrigérée.
 
3.DIALYSE
 
3.1.DEFINITION
 
C'est une technique permettant de séparer des substances en utilisant leur capacité à franchir les pores d'une membrane.
On peut utiliser la dialyse circulaire, la dialyse sur grand volume, la dialyse sur petit volume et l'électrodialyse qui permet l'élimination de sels minéraux.
 
3.2.APPLICATION
 
L'électrodialyse permet de retirer le sel des échantillons avant la chromatographie.
Elle permet aussi d'éliminer des produits diffusibles des solutions protéiques.
 
4.CHROMATOGRAPHIES
 
4.1.DEFINITION ET PRINCIPE
 
C'est une méthode de fractionnement utilisée pour séparer différentes macromolécules d'un mélange complexe ainsi que les petites molécules d'une même famille chimique.
Cette séparation peut être destinée soit à analyser un mélange soit à isoler les constituants à étudier. Ainsi, les molécules à séparer sont dissoutes dans un solvant convenable et la solution obtenue circule entre les particules d'un support.
On va classer les différents types de chromatographie en fonction de la nature des phases, des principes physicochimiques ou des techniques opératoires.
 
4.2.EN FONCTION DE LA NATURE DES PHASES
 
Chromatographie liquide/solideSa phase stationnaire est un solide et sa phase mobile est un liquide
Chromatographie liquide/liquideSa phase stationnaire est un liquide immobilisé par imprégnation d'un solide
Chromatographie en phase vapeur ou chromatographie gaz/liquide L'échantillon à analyser est transformé en vapeur par chauffage et va traverser la phase liquide stationnaire 
4.3.EN FONCTION DES PRINCIPES PHYSICOCHIMIQUES
 
Il existe 5 mécanismes de chromatographie :
Chromatographie d'absorptionElle va utiliser un support qui fixe les molécules à séparer par des liaisons hydrophobes
Chromatographie d'échange ionique sur résine échangeuse d'ionsQuand le support est chargé positivement, il va échanger des anions et, quand il est chargé négativement, il va échanger des cations. Les ions fixés vont être retenus avec plus ou moins de force selon leur nombre de charge et leur nature chimique
Chromatographie de filtration en gel ou chromatographie d'exclusionLe support poreux va laisser pénétrer les petites molécules et va exclure les grosses qui restent à l'extérieur et qui peuvent ainsi être séparées des petites qui sortiront du gel plus tard
Chromatographie de partageElle utilise un support qui retient un premier solvant et qui est traversé par un solvant non miscible au premier. Les substances à séparer vont donc se partager entre les 2 solvants
Chromatographie d'affinitéElle va utiliser des interactions spécifiques comme la réaction enzyme/substrat ou comme la réaction antigène/anticorps. Elle va donc permettre de purifier une protéine en fixant l'anticorps spécifique
 
4.4.EN FONCTION DES TECHNIQUES OPERATOIRES
 
La chromatographie pourra être analytique c'est-à-dire utilisée pour caractériser certaines substances ou préparative et servir à préparer certaines substances.
 
4.4.1.CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE
 
Dans une colonne cylindrique remplie de poudre ou de gel, on verse le mélange à fractionner et ses constituants vont rester fixés.
On verse un liquide appelé éluant qui déplace l'un après l'autre les constituants du mélange qui vont descendre séparément le long de la colonne. On recueille le liquide par petites fractions dans lesquelles se trouvent les constituants du mélange qui pourront être ensuite analysés ou dosés.
On utilise cette technique pour doser les mélanges d'acides aminés. En effet, les acides aminés sont déposés sur une colonne échangeuse d'ions. L'éluant est une solution tampon de pH variable avec le temps. Le liquide sortant de la colonne est mélangé avec de la ninhydrine et chauffé pour que la colonie se développe, puis un spectrophotomètre va lire l'absorption pour l'ensemble des acides aminés. Cette lecture sera enregistrée sur un papier millimétré.
 
4.4.2.CHROMATOGRAPHIE SUR PAPIER
 
Elle utilise des feuilles de papier filtre maintenues verticales dans une cuve qui est une enceinte fermée.
Il existe une phase stationnaire constituée par l'humidité du papier et une phase mobile qui est un solvant organique ou un mélange.
Cette phase mobile va être disposée au fond de la cuve à la base du papier de telle sorte qu'elle monte par capillarité = chromatographie ascendante.
Si elle est disposée près du bord supérieur du papier dans un petit récipient qui permet au solvant de couler lentement de haut en bas de la feuille = chromatographie descendante.
Avant le passage du solvant, on va déposer sur le papier une goutte de l'échantillon à analyser et le solvant va séparer les substances contenues dans l'échantillon.
Une fois le passage du solvant terminé, on va recueillir la feuille de papier ou chromatogramme, on va la sécher et on va la révéler. On va donc faire apparaitre les différentes molécules qui ont été séparées sous forme de tache à l'aide d'un procédé approprié.
 
4.4.3.CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE
 
Le principe est le même que pour la précédente mais elle est beaucoup plus utilisée car elle est plus rapide, moins encombrante, de conservation plus facile et d'application plus vaste.
En effet, la feuille de papier est remplacée par une couche de support qui peut être un gel et qui est étalée sur une plaque en verre ou en plastique.
 
4.4.4.CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE
 
Elle utilise des particules très fines et très résistantes ce qui va augmenter la surface d'échange entre la colonne, les molécules à fractionner et les éluants.
Cette chromatographie va être considérablement plus rapide et on doit opérer en circuit fermé et à pression relativement élevée.
 
5.ELECTROPHORESE
 
On appelle électrophorèse le déplacement de particules chargées dans un champ électrique continu.
On l'utilise sur milieu solide et on peut utiliser le papier comme support mais aussi d'autres supports permettant une meilleure résolution.
 
IV.METHODES DE DOSAGE
 
1.GRAVIMETRIE ET VOLUMETRIE
 
1.1.GRAVIMETRIE
 
Une substance d'un milieu biologique peut être dosée par gravimétrie après précipitation sous forme de produit insoluble qui est recueilli par filtration ou centrifugation puis séché et pesé. Du poids du précipité formé, on pourra déduire la concentration de la substance : on utilisera des balances.
 
1.2.VOLUMETRIE
 
On réalise une réaction entre une solution s contenant la substance à tirer et un volume nécessaire de réactif r de concentration connue.
Le dosage le plus courant est le dosage acide/base et on va déterminer le point d'équivalence c'est-à-dire lorsque la solution contient autant de OH- que de H3O+ ceci à l'aide d'un indicatif coloré ou par potentiométrie.
Grâce à cette dernière, on va mesurer la variation de potentiel au cours d'une réaction en fonction de la concentration de la substance à doser avec un potentiomètre qui possède des électrodes sensibles aux ions.
 
2.METHODES OPTIQUES
 
2.1.PHOTOMETRIE ET SPECTROPHOTOMETRIE D'ABSORPTION
 
2.1.1.PRINCIPE
 
La spectrophotométrie d'absorption est utilisée pour l'identification et le dosage de molécules biochimiques.
Lorsque l'on fait passer de la lumière à travers une solution colorée, celle-ci absorbe de la couleur complémentaire. Si on utilise un rayon monochrome correspondant à cette couleur, il sera absorbé au moins en partie.
 
2.1.2.APPAREILS UTILISES
 
On utilise les photomètres si seules certaines longueurs d'onde sont utilisables et les spectrophotomètres si toutes sont disponibles.
 
2.1.3.DOSAGE
 
La densité optique étant proportionnelle à la concentration d'une solution.
On peut doser cette dernière en lisant sa densité optique dans un appareil étalonné avec la même substance à différentes concentrations connues.
 
2.2.PHOTOMETRIE DES MILIEUX TROUBLES
 
2.2.1.OPACIMETRIE
 
On utilise une mesure de la lumière qui a traversé le milieu étudié dans la direction de la lumière incidente à l'aide de spectrophotomètre avec une longueur d'onde entre 620 et 670 nm et on va l'utiliser pour mesurer les concentrations des suspensions cellulaires en bactériologie.
 
2.2.2.NEPHELEMETRIE
 
Elle mesure la lumière diffusée à 90° par rapport à la direction de la lumière incidente. Elle est utilisée pour mesurer les concentrations de certaines protéines sériques par immuno-précipitation.
 
2.3.SPECTROPHOTOMETRIE D'ABSORPTION ATOMIQUE
 
Elle consiste à mesurer l'absorption de radiations de photons spécifiques par des atomes de vapeur.
En biologie clinique, on l'utilise pour le dosage sérique du calcium, du magnésium, du fer, du cuivre...
En toxicologie et en pharmacologie, on l'utilise pour doser des métaux.
 
2.4.PHOTOMETRIE D'EMISSION ATOMIQUE
 
Par chauffage apparaissent dans une solution des ions à l'état excité grâce à l'énergie apportée par la flamme.
En revenant à l'état normal, les atomes émettent une énergie lumineuse dont la longueur d'onde est caractéristique de l'élément à doser et dont l'intensité est proportionnelle à sa concentration.
 
2.5.FLUORIMETRIE
 
Cette méthode repose sur le fait que les molécules sous l'action d'un rayon X ou UV ou visible passent à l'état excité c'est-à-dire un niveau d'énergie supérieur puis reviennent à l'état normal en émettant une lumière fluorescente.
 
3.METHODES ENZYMATIQUES
 
3.1.GENERALITES
 
Les enzymes sont des catalyseurs protéiques possédant une spécificité vis-à-vis d'un substrat et elles catalysent un seul type de réaction.
L'activité des enzymes varie selon les conditions expérimentales comme le pH, la température et la concentration des substrats.
En réalité, pour chaque enzyme donnée, chaque laboratoire possède ses propres valeurs de référence.
 
3.2.PRINCIPALES METHODES UTILISEES
 
3.2.1.DOSAGES PHOTOMETRIQUES
 
On peut mesurer la vitesse d'une réaction enzymatiques en appréciant dans un temps donné soit la quantité du substrat disparu soit la quantité de produit apparu (ex : on peut doser les transaminases sériques grâce à l'acide alphacétoglutarique).
 
3.2.2.DOSAGES FLUORIMETRIQUES
 
On va suivre la variation de fluorescence du produit formé au cours de la réaction enzymatique.
Ces mesures peuvent être faussées par la fluorescence propre des réactifs et la pureté insuffisante de certaines enzymes.
 
3.2.3.DOSAGES ISOTOPIQUES
 
On va utiliser un substrat radioactif et on va mesurer la radioactivité du produit formé pour obtenir la vitesse de sa formation qui sera représentative de l'activité enzymatique.
 
4.METHODES IMMUNOLOGIQUES
 
Ces méthodes vont utiliser soit des anticorps spécifiques pour identifier et éventuellement mesurer les antigènes soit des antigènes pour déterminer un taux d'anticorps.
 
4.1.DIFFERENTES METHODES
 
On les classe en 3 groupes :
Les méthodes qui permettent l'observation directe de la réaction antigène/anticorps = méthodes de précipitation et d'agglutinationLes méthodes qui utilisent un réactif marqué. On marque soit l'antigène soit l'anticorps par une substance susceptible d'émettre un signal identifiable par l'œil ou un appareil spécialiséLes méthodes fondées sur l'observation d'un effet biologique de la réaction immunitaire 
4.2.EXEMPLE D'UNE TECHNIQUE IMMUNOCHIMIQUE
 
Il s'agit de la méthode Elisa.
Elle est basée sur le principe suivant : l'antigène ou l'anticorps fixé sur la phase solide peut être détecté grâce à l'utilisation d'un anticorps ou d'un antigène complémentaire marqué par une enzyme elle-même capable d'agir sur un substrat.
Quand le substrat est mis en présence l'antigène, la présence de l'antigène de l'anticorps peut être révélée par l'apparition d'une coloration.
On l'utilise surtout pour détecter les anticorps dirigés contre les virus HIV1 et/ou HIV2 dans le cadre du dépistage, lors du diagnostic ou de don du sang.
Ce test se déroule en 3 étapes et on a pour support réactionnel des micro-puits recouverts d'un mélange de 4 antigènes recombinants de type HIV1 ou HIV2.
1ère étape : l'échantillon est dilué dans un diluant échantillon de couleur verte. Cette addition entraine une modification de la couleur qui peut être contrôlée visuellement ou par spectrophotométrie à 610 nm. L'échantillon est incubé dans un micro-puits pendant un temps précis et si les anticorps anti-HIV1 et anti-HIV2 sont présents dans le prélèvement, des complexes antigène/anticorps vont se former à la surface du puits2ème étape : un mélange de 4 antigènes recombinants (le conjugué) marqués par la peroxydase est ajouté au micro-puits. Le conjugué se lie de façon spécifique aux immunoglobulines humaines anti-HIV1 et anti-HIV2 des complexes antigène/anticorps3ème étape : le substrat composé d'ophényléthylènediamine ou OPD et de peroxyde d'hydrogène est ajouté et si le conjugué lié est présent, l'OPD sera oxydé entrainant l'apparition d'une coloration orange. Puis, on ajoute de l'acide chlorhydrique pour stopper la réaction et l'intensité de la coloration va dépendre de la quantité de conjugué liée donc de la concentration en anticorps anti-HIV1 et/ou anti-HIV2 dans l'échantillon. L'intensité de la coloration sera lue grâce à un spectrophotomètre qui mesurera la densité optique dans chaque micro-puits
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