Ii composition chimique des acides nucléiques a les bases hétérocycliques








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E) Les caractéristiques des radioéléments utilisés en biologie



Les principaux isotopes utilisés en biologie sont des isotopes instables, c'est-à-dire ceux qui émettent des rayonnements radioactifs : 32P ; 35S ; 14C ; 3H ; 125I; 131I.

Et peuvent aussi être des isotopes stables ou lourds : 15N ; 18O ; 13C ; 2H.
F) Détection et mesure de la radioactivité

1) L'autoradiographie
Les radiations ionisantes sont susceptibles d'imprégner un film autoradiographique.
Exemple : on veut suivre la synthèse de protéines dans une culture bactérienne, E. Coli, on met un acide aminé marqué glycine. Au bout d'un moment, on extrait des protéines et on les hydrolyse. On prend une plaque de chromatographie sur gel de silice, on y met un certain nombre de témoins et notre mélange d'acides aminés.
On fait la chromatographie. Lorsqu’on retire la plaque, on n’observe rien car protéine incolore. L'anidrine n'est pas assez sensible pour la glycine incorporée.
On superpose à cette plaque un film photographique et on place l'ensemble dans l'obscurité pendant 24h. Les radiations ionisantes sont capables d'impressionner ce film pendant 24h. On développe et on obtient des taches plus sombres qui permet un repérage de la glycine. On pourra donc dire que les bactéries ont incorporé de la glycine pendant l'expérience.



On utilise l'autoradiographie dans le cas où l’on utilise des molécules radioactives avec émissions  mou : carbone 14 ou tritium. Parce que la trace donnée pour chaque désintégration est faible sur le film. Dans le cas du phosphore 32,  dur, on fera une électrophorèse mais, cette fois-ci, la radioactivité est incluse dans un support épais.
2) Compteur de radioactivité
Le principe des compteurs de radioactivité est de transformer l'énergie cinétique, c'est-à-dire la désintégration par minute d'un émetteur en un flash lumineux qui sera enregistré par l'appareil sous forme d'impulsions électriques que l'on mesure en coups par minute.

Entre l'énergie cinétique et l'impulsion enregistrée, il y a une perte qui correspond à un certain pourcentage. On calcule donc le rapport de rendement du comptage :


Le comptage peut être effectué en milieu aqueux seulement pour des molécules marquées au phosphore 32. Car l'énergie émise par le phosphore 32 est suffisamment forte pour être correcte même avec les pertes les impulsions électriques. On parle de comptage Cerenkov. On a 30% de radioactivité et 70% de pertes.

Pour les autres émetteurs, on fait un comptage en scintillation liquide : carbone 14, tritium, soufre 35, … On utilise un agent scintillateur, c'est un liquide qui contient des substances chimiques excitables par les particules radioactives et qui vont permettre la transformation de l'énergie des particules en énergie lumineuse. Le rendement de comptage est de 80% pour le carbone 14, 30% pour le tritium, 90% pour le soufre 35 et 100% pour le phosphore 32.


G) Les méthodes de marquage en biologie


1) Leurs utilisations
Ces méthodes seront utilisées dans les cas :
a) Où l'on veut calculer le taux de synthèse instantanée d'une molécule en un temps très court. C'est-à-dire la quantité synthétisée par unité de temps de molécules ou macromolécules, ce qui permet de déterminer des quantités synthétisées de 10-6 à 10-12 M/min.
b) Où l’on veut étudier le taux d'accumulation en un temps donné plus long. Dans ce cas, cela revient à mesurer la quantité de molécules qui vont être accumulées pendant un temps donné et qui représente la résultante entre le taux de synthèse et de dégradation.
c) Où l'on veut suivre le devenir de molécule au cours du temps.
2) les méthodes
Première méthode : utilisation d'un marqueur radioactif.

Lorsque l’on s'intéresse à la synthèse de macromolécules, on utilise une petite molécule marquée précurseur spécifique de la macromolécule. C'est-à-dire que si l'on veut suivre la synthèse de protéines, on va utiliser un acide aminé, précurseur spécifique, marqué au carbone 14. Pour la synthèse d'ADN, on utilise le TTP marqué au phosphore 32 en 5'  ou du tritium. Pour l'ARN, on utilise du UTP marqué au phosphore 32 en 5' ou du tritium.
Cas de l'étude du taux de synthèse, cela revient à calculer le taux de synthèse instantanée.

On met en culture des bactéries en présence de molécules radioactives. Pendant un temps de réaction très court, correspondant au temps de marquage (30s), il y a synthèse de macromolécules composées de précurseur radioactif. Il reste aussi des molécules radioactives dans le milieu non-incorporé. Entre le temps 0 et le temps 30s, la radioactivité est la même. On a trouvé un réactif qui a permis de séparer les molécules non-incorporées de la macromolécule formée. Dans le cas des protéines, on utilisera du TCA : acide trichloracétique - ou le SDS. Il coupe les liaisons ioniques, ce qui fait que les protéines précipitent et les molécules non-incorporées restent solubles. On connaît la concentration de départ des molécules radioactives, on mesure la quantité du surnageant.

On obtient le taux de synthèse =





Le SDS déroule et entraîne la modification secondaire et tertiaire des protéines et les fait précipiter. Dans le cas où l'on suit le taux de synthèse instantanée d'un ADN ou ARN, on utilise le TCA.

Cas de l'étude du taux d'accumulation.
Le temps est beaucoup plus long 10 min, car durant ces 10 minutes il y aura synthèse et dégradation.
Taux d'accumulation par minutes =

Deuxième méthode : la dilution isotopique

Cette technique consiste à ajouter pendant un temps très court un précurseur radioactif avant d'ajouter le même précurseur non-marqué d'où une dilution isotopique. On mesure ensuite la décroissance de la radioactivité pendant un certain temps. On utilise cette méthode dans trois cas :

1e cas : les molécules marquées et le précurseur radioactif ne peuvent pas être séparés ;
2e cas: on veut suivre au cours du temps la molécule synthétisée sans la détruire ;
3e cas: pour des raisons économiques, étant donné que les produits radioactifs sont très coûteux : exemple : 1ml de glycine marquée au carbone 14 coûte 2000€.

Comment utiliser cette technique ?





Cette technique permet de calculer le temps de demi-vie qui correspond à la dégradation de 50% des molécules. Cette méthode permet d'étudier le devenir des ARN messagers sans les détruire.

LES OUTILS MOLÉCULAIRES DE L’ANALYSE DES ACIDES NUCLÉIQUES


I) Le génome et le programme génome humain
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