Ii composition chimique des acides nucléiques a les bases hétérocycliques








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C) L'ultracentrifugation


1) Détermination d'une constante de sédimentation
Les acides nucléiques (surtout ARN) sont caractérisés par leur constante de sédimentation. Exemple : ARNs ribosomaux 5s, 23s,…


Dans l'étude théorique sur la vitesse de sédimentation sur l'ultracentrifugation, on a vu :



S est la constante de sédimentation d'une substance ; elle représente la vitesse de sédimentation de la particule par unité de champ gravitationnel, tel que ω²x = 1.


Expérimentalement, on détermine S par l'étude du mouvement de la frontière.
ln x = f(t)



ω : vitesse angulaire



S = 10-13 sec
2) Détermination de la masse molaire ou moléculaire
Cela sert à la détermination de la masse molaire des ADNs. En étudiant l'évolution de la frontière en fonction du temps, on démontre que :



R : Constante des gaz parfaits, nombre avogadro * K avec K constante de Bolzmann

T : Température en degré calvin.

: représente l'augmentation de l'accroissement du volume de la molécule quand on la met en solution.

 : représente la densité du milieu

= S

D : Coefficient de diffusion


Avec des molécules pures, on préfère déterminer la masse molaire avec l'électrophorèse.
II) L'électrophorèse

A) Théorie de la migration électrophorétique

1) Définition
L'électrophorèse est une méthode d'analyse qualitative et quantitative, de séparation et préparative basée sur la différence de migration de particules chargées électriquement et qui se déplacent sous l'action d'un champ électrique continu et constant.
2) Les particules chargées

a) Les électrolytes
Exemple :
Ils se dissocient dans l'eau en un nombre égal d'anions et de cations.
b) Les ampholytes
C'est une catégorie particulière d'électrolytes, ils sont capables de porter simultanément ou non des charges de signes contraires selon le pH du milieu. Exemple : acides aminés, protéines, bases puriques et pyrimidiques, les nucléosides, les nucléotides, les acides nucléiques.

Dans tous ces cas, on peut faire une électrophorèse out les analyser en les plaçant dans un champ électrique.


3) Les différents types d'électrophorèse

a) L'électrophorèse en veine liquide à frontière mobile
On a une réaction fondamentale de référence qui met directement en application le principe de l'électrophorèse. La migration s'effectue au sein d'un liquide de composition bien déterminée, un tampon : le support.

Le principe de séparation se fait par la mesure de migration.



Ce type d'électrophorèse est utilisé dans l'étude de la mobilité des protéines et pour vérifier leur pureté.


Problème : on n’aboutit jamais à la séparation parfaite des molécules dans un mélange.

Expérience et schéma expérimental : 1e type page 3.


On choisit le pH du tampon tel que le pH du milieu soit inférieur au pHi.

- Veine liquide car dans un liquide ;

- Frontière mobile car à temps x on a quatre frontières (déplacement.) Ces quatre frontières sont mises en évidence par méthode optique par UV (ou fluorescence) ou par mesure de l'indice de réfraction.

On mesure la vitesse moyenne de migration (d)

On a d, et t on en déduit u, la mobilité.


Ce type d'électrophorèse n'aboutit jamais à une séparation parfaite.
b) L'électrophorèse de zone, électrophorèse de support
Dans ce type d'électrophorèse, la migration s'effectue au sein d'une phase liquide imprégnant un solide poreux ou un gel.


Principe de la séparation : il n'y a pas de proportionnalité entre le champ électrique, la mobilité et le temps.




Domaine d'application : Cela sera utilisé pour les acides aminés, les protéines, les bases, les nucléosides, les nucléotides, les acides nucléiques.

Pour mesurer le poids moléculaire, pour des analyses quantitative et qualitative, pour mesurer leur degré de pureté et pour les séparer.


Expérience et schéma expérimental : 2e type page 3

Le but est d'avoir la meilleure séparation possible et quelque soit le mélange de protéines ou d'acides nucléiques.

On essaye toujours d'avoir la meilleure séparation.
4) La migration

a) La migration en veine liquide

b) La migration en phase liquide imprégnant un support solide

1-Les différents facteurs dont dépend la migration
La mobilité : u dépend de plusieurs facteurs :

  • La charge de la particule qui dépend du pH. La référence est le pHi. Quand le pH est inférieur à son pHi, la charge est positive, si le pH est supérieur, alors la charge est négative. La mobilité est d'autant plus grande que la charge nette de la molécule est importante ;

  • De la force ionique du tampon : la force ionique µ se définie comme la demi-somme des produits des concentrations molaires des ions Ci par le carré de leur valence Vi.




Exemple : Tampon d'acétate de sodium de concentration 1M et de valence 1.
Na+CH3COO- µ = 1


En électrophorèse, on utilise des tampons dont la force ionique varie entre µ = 0,05 à 0,1. La force ionique est proportionnelle à la résistance et inversement proportionnelle à sa conductivité. Par conséquent, le déplacement d'une particule augmente lorsque la force ionique diminue. La mobilité u augmente quand la force ionique diminue.


  • Les forces de frottements de la molécule, c'est-à-dire que cela varie suivant la géométrie de la molécule, sa taille et sa forme. La mobilité u augmente quand la taille et la forme diminuent.



Le champ électrique :

Le champ électrique doit être uniforme. Ce déplacement dépend essentiellement de l'intensité du champ électrique dont la valeur est égale à la ddp appliquée entre les électrodes au quotient de la distance entre les électrodes :



Le temps de migration :

La migration d n'est plus proportionnelle au temps de migration ; ceci est du au fait que les molécules sont soumises à un certain nombre de forces qu'on appelle les « courants liquidiens. » Et lorsque le bilan des vitesses de déplacement est nul, la molécule ne se déplace plus quelque soit la durée d'application du champ électrique.
2-Les trois courants liquidiens
Le premier courant liquidien est le courant d'électro-endosmose :

Le support est un solide ayant une certaine épaisseur.


Lorsque le support est imprégné de solution, il va fixer, adsorber des ions OH- ; on parle de « couche fixe. » Les ions positifs de la solution vont former des liaisons avec les OH-. Si l’on applique une ddp, la couche d'ions positifs va se déplacer vers le pôle négatif, on parle de « couche mobile. »
Ces ions vont créer un courant d'électro-endosmose.


Si les molécules sont chargées positivement, elles vont être entraînées par le courant d'endosmose et donc à une migration supérieure à celle qu'elles devraient avoir s'il n'y avait pas de courant.
Si les molécules sont chargées négativement, elles vont être entraînées dans le sens inverse du courant d'endosmose et donc à une migration inférieure à celle qu'elles devraient avoir s'il n'y avait pas de courant.
Si les molécules sont nulles, elles vont être peu entraînées par le courant d'endosmose.

Le courant d'électrolyse :

Dans le tampon, on trouve des ions positifs et des ions négatifs.


Dans ce cas, il y modification de la composition du tampon, d'où du pH, d'où de la charge des molécules.


Le courant d'évaporation :

Dans un système d'électrophorèse, notre support est imprégné du tampon ; s'il y a évaporation du tampon, il va y avoir appel d'un liquide qui tend à compenser cette évaporation.

B) Les différentes électrophorèses et les applications pratiques

1) L'électrophorèse sur papier

a) La cellulose
La cellulose est un polyoside de structure des enveloppes et paroi cellulaire. La cellulose est un polymère du D-glucose qui est liée par une liaison -1,4-diosidique. ( : liaison du même coté que CH2OH.) Elle forme un réseau serré de polymères :

Les molécules vont migrer à la surface du support. Donc la séparation se fera suivant la charge des molécules à séparer. On utilise surtout la cuve horizontale pour le dispositif expérimental.
Domaine d'application : ce type d'électrophorèse va être utilisé pour la séparation des protéines :

 À basse tension : 100 à 200 volts par centimètre et de 20min à 1h ;

 À haute tension : 1000 à 3000 volts par centimètre et pendant 3h pour la séparation de petites molécules (acides aminés, peptides.)

b) Ester de cellulose
Ce type de support présente une matrice homogène qui permet des séparations rapides et une meilleure résolution ; elle est réservée aux protéines.

Inconvénient : on ne peut utiliser et déplacer que quelques micro-litres d'échantillon. D'où de simples analyses qualitatives.
2) L'électrophorèse sur gel

a) Sur gel d'agarose
Il est constitué de la même façon de polymère de D ou L-galactose.

L'intérêt : on va pouvoir séparer des molécules de poids moléculaires élevés et même des complexes supramoléculaires tel que les virus et des complexes enzymatiques et des acides nucléiques.

Le principe est que les molécules migrent à l'intérieur du réseau à l'intérieur du gel, dont la taille des pores est à peu prés constante. La séparation se fera donc selon la charge et suivant le poids moléculaire et la taille. Mais le facteur charge prédomine encore.
b) Sur gel d'amidon
L'amidon est un polyoside de réserve du monde végétal qui est formé de polymères de longues chaînes non-ramifiées de D-glucose (liaison  1 4.) Il est constitué d'amylose et d'amylopectine, ce qui forme des chaînes ramifiées en hélice. Cet amidon va donner au gel une porosité plus forte, la taille étant légèrement plus grande. La séparation va se faire suivant la charge mais, cette fois-ci, les facteurs "taille" et "forme" vont prédominer.
c) Sur gel de polyacrylamide
Sans agents dénaturants :

C'est une macromolécule qui est un co-polymère de l'acrylamide. C'est-à-dire qu’il va y avoir formation par enchaînement de cette molécule, ce qui permettra d'avoir des chaînes et, pour qu'il y ait des pontages entre les deux, on utilise le N-N-méthylène bis acrylamide.





Il faut un catalyseur pour faire la polymérisation : le persulfate d'ammonium. Et il faut le temed qui contrôle et induit la polymérisation.

On peut donc contrôler la porosité des pores en fonction du pourcentage d'acrylamide qui est utilisé.
Entre 15 à 20%, on va avoir beaucoup de chaînes :

 Pour un poids moléculaire de 10000 à 40000.

Entre 10 à 15%, on va avoir moins de chaînes :

 Pour un poids moléculaire de 40000 à 100000.

Entre 5 à 10%, il va y avoir encore moins de chaînes :

 Pour un poids moléculaire de 100000 à 300000.
Pour 5%, la quantité diminue encore :

 Pour un poids moléculaire de 300000 à 500000.

Entre 2 à 5%, toujours moins :

 Pour un poids moléculaire supérieur à 500000.

L'expérimentateur va pouvoir créer le gel en fonction de ce qu'il veut faire. La séparation se fait toujours suivant la charge, mais le facteur "poids moléculaire" prédomine.


Dispositif vertical, la migration se fait de haut en bas.
La technique de Laemmli : une plaque sur laquelle on coule un gel intérieur dont le rôle est de séparer. Pour les protéines, on utilise entre 15 et 5%. Et au-dessus de ce gel, on a un gel de concentration de 2,5%.



 Avec agents dénaturants :
On ajoute au gel de polyacrylamide un agent dénaturant :

 L'urée :



Elle fait perdre la structure quaternaire des protéines. Dans le cas où une protéine aurait plusieurs sous-unités, cela nous permettrait de connaître leur nombre.




 Le SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) : CH3—(CH2)11—SO3-N+

C'est un détergent anionique qui modifie la structure tridimensionnelle des protéines sans les précipiter.


Le SDS se complexe aux protéines à un pH donné et va leur donner une charge négative proportionnelle à leur taille.


La technique de Laemmli permet de déterminer la masse molaire des protéines puisqu'il y a proportionnalité entre la masse molaire et la migration telle que :

log M = f(d)



avec d = Rf =




-------------------------------



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d) Sur gel de polyacrylamide avec des ampholytes : l'électrofocalisation
Méthode exclusivement utilisée pour les protéines, ce qui va permettre de séparer les protéines en fonction de leur pHi. Pour cela, on utilise un gradient de pH. Ce gradient de pH va être formé en utilisant des ampholytes, c'est-à-dire des molécules de faible masse molaire, très mobiles et comportant chacune plusieurs groupements acide carboxylique COO- et amine.



Deux types d'ampholytes :

- Type A :





- Type B :

Ce mélange est mis avec le gel.

Gel de polyacrylamide + ampholyte : pH = 3 à 10 et pH = 5 à 7.



On met un mélange de protéines à pH donné au départ, les protéines vont migrer vers l'anode ou la cathode en fonction de leur charge, mais au fur et à mesure de leur déplacement, le pH extérieur va varier, ainsi que leur pH, donc leur charge. Quand leur charge est nulle, elle focalise à l'endroit ou le pH est égal à leur propre pHi. Cette méthode est douée d'un grand pouvoir de séparation.
e) L'électrophorèse à deux dimensions
Ce type d'électrophorèse fait qu'on va utiliser un gel de polyacrylamide et on y ajoute des ampholytes (première dimension), et donc on va faire une séparation selon le pHi.

Le mélange 1 avait deux protéines ayant deux pHi différents et le mélange 2 avait 3 protéines de trois pHi différents.


On met la plaque dans une solution de SDS.

On retourne la plaque et on refait une électrophorèse (deuxième dimension.)



Dans le mélange 1 se trouvent des protéines qui ont des pHi différents et des protéines de pHi identiques. Dans la première dimension, on a séparé par pHi et dans la deuxième, par poids moléculaire.
f) L'électrophorèse en champs pulsés
Elle s'effectue avec un gel d'agarose ou de polyacrylamide mais le champ électrique qui va être appliqué va changer de sens de façon alternative et cela selon deux directions en diagonale.




Pour l'ADN 2, le trajet est plus petit car la molécule d'ADN est plus grosse.

Ce type d'électrophorèse permet la séparation de grosses molécules qui migrent négativement car elles passent la majorité du temps à se réorienter.
Cette méthode est utilisée pour des molécules d'ADN supérieures à 20 kilobases (20000b), car, avant, une molécule de 20kB était plus grande que la longueur des pores dans tous les supports.  On peut aller de 20 à 1000kB.
3) Mise en évidence des molécules séparées par électrophorèse

a) Les protéines
Les protéines sont incolores donc pour les voir sur le gel, on peut utiliser un colorant du fait de la présence de groupements azotés : le bleu d'aniline ou bleu de comassie.

Dans le cas de protéines douées de fonctions enzymatiques, présent sur une plaque d'électrophorèse, la mise en présence de son substrat permet d'obtenir un produit et l'enzyme ; ce qui permet d'avoir coloration au niveau de la protéine. La coloration peut être au niveau du produit ou du substrat. Il peut y avoir aussi fluorescence sous une lampe UV.
b) Cas de la séparation par électrophorèse de molécule d'ADN
Deux types de support sont utilisés en électrophorèse d'ADN :

- L'agarose, qui permet la résolution des fragments de 30000 paires de bases à 200pb et, pour un gel de polyacrylamide, des fragments de 2000pb à 50pb.
Dans le cas du gel d'agarose, cela permettra aussi de séparer des fragments d'ADN qui ont des conformations différentes. Pour le gel de polyacrylamide, cela permet de séparer les fragments en fonction de leur taille.
Pour révéler ses fragments, on utilise le bromure d'éthidium, qui a la particularité de pouvoir absorber à 300nm, qui est fluorescent à l'état excité (à 300nm) et émet à 590nm.

c) Cas des ARNs
Le bromure d'éthidium est aussi utilisé.

III) Les méthodes de marquage
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