I extraction de l’adn plasmidique et carte de restriction








titreI extraction de l’adn plasmidique et carte de restriction
date de publication01.04.2017
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COMPTE-RENDU DE TP MGG

Plasmides et PCR

I) Extraction de l’ADN Plasmidique et carte de restriction


1) But et principe du TP :
But: établir la carte de restriction de deux plasmides recombinants contenant un Insert et en tirer des conclusions sur le sens d’insertion du fragment .

Principe: extraction et purification de l'ADN plasmidique à partir de bactéries

transformées par ces plasmides. Puis digestion de ces ADNs par 3 enzymes

de restriction différentes; séparation des fragments obtenus sur gel d'agarose pour en déterminer la taille en comparant à une courbe standard établie avec des fragments de taille connue.

2) Expliquer brièvement le rôle des différentes étapes



1ère centrifugation: récupérer les bactéries en culot et éliminer le milieu de croissance

Tampon A: resuspendre les bactéries dans un tampon neutre (TrispH 7,5) qui

contient de l'EDTA (chélateur des ions divalents) qui va fragiliser les membranes bactériennes) et RNase (détruit l'ARN bactérien)

Tampon B: lyse des bactéries grâce au pH alcalin de la soude et au détergent

(SDS) qui dénature les protéines. En plus la soude dénature l'ADN bactérien et

génomique.

Acétate de potassium: permet de revenir à un pH neutre, ce qui entraîne la

précipitation des protéines et de l'ADN génomique (non renaturé); l'ADN

plasmidique reste en suspension car il est renaturé (petit et circulaire).

Isopropanol: en présence des sels contenus dans les solutions, l'isopropanol va

faire précipiter l'ADN

Ethanol 70%: permet de remettre les sels en suspension qui pourraient gêner les étapes ultérieures

Eau: resuspension de l'ADN à une concentration choisie


II) Digestion de l’ADN et analyse sur gel




  1. Décrire brièvement les étapes et leur rôle


Digestion par les enzymes de restriction: permet de digérer l'ADN à des sites

spécifiques et d'obtenir des fragments de différentes tailles. Pour cela on prépare 6 tubes, 3 pour chaque plasmide. Dans chacun de ces tubes on déposera l’ADN plasmidique pI ou pII, le tampon adéquat à l’enzyme de restriction, de la BSA qui protège l’activité enzymatique et l’enzyme choisie. Dans 2 autres tubes on dépose l’ADN avec de l’eau ; ces tubes serviront de contrôle et donneront des informations sur la quantité etla qualite des ADNs plasmidiques à l’état natif. Les tubes sont ensuite mis pendant la nuit à 37°C, température d’activité optimale des enzymes de restriction choisies

Gel d'agarose: permet de séparer les fragments d'ADN selon leur taille car ils

migrent dans un champ électrique grâce à la charge portée par les phosphates.

Bromure d'éthidium: agent mis dans le gel, qui s'intercale entre les bases d'ADN et qui en fluorescant aux UV permet de visualiser les fragments d'ADN

Bleu/glycérol: le glycérol ajouté aux échantillons permet d'alourdir l'ADN pour qu'il tombe au fond des puits; le bleu, qui selon le % d'agarose représente une taille précise permet de suivre la migration et d'arrêter la migration au bon moment.

Marqueur de taille: fragments d'ADN de taille connue qui permettent d'établir une courbe de référence de migration en fonction de la taille.


  1. Interprétation

  1. photo du gel :

coller la photo et ne pas oublier de la légender


  1. analyse


- courbe étalon sur papier semi-log; les Kb sur l’échelle log, la distance de migration sur l'échelle normale. .
- En déduire la taille des différents fragments obtenus :
- SacI: on obtient les 2 mêmes fragments pour pI et pII, il y a donc 2 sites de

restriction. La ligation de l'insert s'étant faite dans le site SacI du polylinker, un des fragments (environ 2,9 Kb)représente le plasmide, l'autre (environ 1,9 Kb) l'insert.

- PstI: pour PI, on obtient 3 fragments; sachant qu'il en existe 1 dans le polylinker, les 2 autres sont sur l'insert. Le grand fragment (3,1 Kb) comprend le plasmide et un morceau d'insert (environ 0,25 Kb). On peut donc placer un 1er site à 0,25 Kb d'un site SacI. Celui de 1,1 Kb qui est commun aux digestions PstI de PI et PII se trouve au milieu de l'insert et le 3ème (0,65 Kb) se trouve de l'autre côté, du côté polylinker; pour PII, en raisonnant de la même façon on détermine que l'insert est orienté dans le sens inverse

- KpnI: pour pI et pII on obtient 2 fragments donc il existe 2 sites, l'un dans le polylinker , l'autre dans l'insert. Pour PI, le grand fragment d'environ 3,6 Kb comprend le plasmide et un fragment d'insert d’ environ (0,7Kb). On peut donc placer le site dans l'insert à 0,7Kb d'un site SacI. La digestion de ce site et de celui du polylinker libère un fragment de 1,2 Kb. Pour pII, l'insert est orienté en sens inverse libérant un fragment de 0,7 Kb et un fragment de 2,9 + 1,2 Kb - les plasmides pI et pII représentent deux plasmides contenant le même insert cloné dans un sens ou dans l’autre

4)Critiques des résultats:

Critiques sur la photo donnée: trainées dans le haut du gel qui peuvent être dues à une contamination d'ADN génomique.

Mauvaise résolution de certains des fragments du standard (haut PM) , ce qui

donne des approximations grossières de la taille des fragments digérés. Ceci explique les différences de taille observées parfois dans la somme des fragments.

Mauvaise digestion : explications ? ? ? ? ?


II- Analyse de l’ADN par PCR



1) analyse de la PCR :
Photo du gel: avec la légende
2) interprétation des résultats;

Pour le plasmide PI, on a une amplification avec les amorces GP1 et Re qui sont donc des amorces se trouvant sur l’un et l’autre brin et en sens opposés. Comme l’amplification GP1/Re donne un fragment de 1,4 Kb et que le fragment entier mesure 2 Kb, il reste donc 0,6 Kb entre GP1 et l’autre extrémité de l’insert.

De même pour le plasmide PII, l’amplification GP2/Re donne un fragment de 0,9Kb ce qui montre que GP2 et Re sont sur 2 brins différents et en orientation opposées. Le fragment restant est donc de 1,1 Kb

On peut donc représenter le schéma final



  1. l’amplification GP1-GP2 donnerait le même fragment de 300 paires de bases avec pI ou pII




  1. ces résultats confirment bien que l’insert est intégré en sens opposé dans les plasmides 1 et 2.



3) Critiques des résultats

Pas d’amplification, pourquoi ?

Contamination : pourquoi ??

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