Synthèse in vitro








télécharger 151.67 Kb.
titreSynthèse in vitro
page3/6
date de publication06.01.2017
taille151.67 Kb.
typeThèse
b.21-bal.com > loi > Thèse
1   2   3   4   5   6

Détection, caractérisation et identification des acides nucléique

I.1.7.Marquage et suivi des acides nucléiques


Le marquage est principalement employé dans toutes les techniques qui utilisent une sonde (hybridation, northern, …..). On distingue le marquage dit « chaud » utilisant des isotopes radioactifs, et les marquages « froids » qui utilisent des molécules aux propriétés fluorescentes, luminescentes. Ces dernières sont de plus en plus employées car plus pratiques.

Marquage radioactif


On distingue plusieurs méthodes selon la localisation du marquage (extrémités ou interne à la molécule) et selon la nature de la séquence marquée (simple ou double brin).

Le Phosphore 32 est le radioisotope le plus utilisé. Incorporé dans la sonde enzymatiquement au moyen d'un ou plusieurs nucléotides triP radiomarqués Il existe des sondes mono ou double brins Soufre 35, H 3 utilisés plutôt pour le séquençage et hybridation in situ. On peut aussi réaliser un marquage en 5' : avec la T4 polynucléotide kinase. La radioactivité est aussi utile pour le marquage des oligonucléotides de synthèse.
Les sondes double brins


Marquage par amorçage au hasard (Random Printing) :
Très employé dans les laboratoires pour par exemple les Southern et Northern Blot, il permet d'obtenir des activités spécifiques plus élevées, nécessaires pour détecter un gène sur quelques mG d'ADN génomique.

Dans cette technique de marquage, les deux brins d’ADN de la sonde sont préalablement séparés par chauffage suivi d’un refroidissement brutal. Puis, on ajoute un mélange d’oligonucléotides (hexanucléotides) de synthèse correspondant à toutes les combinaisons mathématiquement possibles (soit 46 = 4096 nucléotides). Ces oligonucléotides vont s’hybrider avec le sonde pour une partie d’entre eux. Ces oligonucléotides fixés vont servir d’amorces au fragment de Klenow de l’ADN polymérase I qui va reconstituer l’intégrité des deux fragments en présence de désoxynucléosides triphosphates marqués au 32P. Des ADN polymérases par exemple dérivée du phage T7 sont actuellement les plus utilisées.

Marquage en 3' :
*avec une ADN pol. : fragment de Klenow, T4 ADN pol., Taq pol., transcriptase reverse.

*avec une exonucléase
*avec une terminal transférase

L’ADN peut être marqué à son extrémité 5’ à l’aide d’une kinase, par exemple, la T4 polynucléotide kinase extraite d’E. coli infecté par le bactériophage T4. En présence d’ATP avec du 32P en position g ou [32P]g-ATP, il est possible d’échanger le groupement 5’-phosphate présent sur le fragment d’ADN avec le phosphate radio-actif en position g sur l’ATP. Cette méthode est générale. Elle est plus efficace si les extrémités 5’- sont préalablement déphosphorylées, par exemple par l’action d’une phosphatase alcaline.


Marquage par translation de coupure (Nick Translation) :
utilise 2 enzymes :

*DNAseI dans des conditions ménagées pour générer quelques coupures simple brin dans le fragment d'intérêt

*DNA pol.I pour dégrader l'ADN dans sens 5'-3' au niveau de ces coupures et repolymériser en présence d'un nucléotide chaud.

Nous avons vu dans les outils enzymatiques utilisés en biologie moléculaire que l’ADN double brin traité par la Dnase I était clivé au hasard. La réparation des coupures réalisées par la Dnase I nécessite l’action de l’ADN polymérase I en présence de désoxynucléosides triphosphates marqués au phosphore radioactif (32P). Les désoxynucléosides triphosphates utilisés sont marqués en position alpha au 32P. Cette technique est appelée "technique de nick translation ". Cette technique est actuellement en retrait par rapport à la technique suivante.

Les sondes simple brin

- d'ADN :
*sondes à activité spécifique importante (Southern, Northern Blot)

*protection contre la nucléase S1, hybridation in situ. Avantage : ne se renature pas sur elle-même lors de l'hybridation.

- d'ARN : ribosondes.
*rendements d'hybridation meilleurs par rapport aux hybrides ADN-ADN, plus stables
*pour hybridation in situ

*cartographie des ARN
Attention : Les sondes radioactives présentent de nombreux inconvénients :

  • nécessité de se protéger du rayonnement émis, un maniement des sondes inconfortables.

  • Décroissance rapide du P32, d’ou un besoin de marquer les sondes fréquemment.

Pour pallier à ces inconvénients, on peut utiliser les sondes« froides ».

Marquages froids : fluorescence ; colorimétrie ;chimioluminescence ;


Fluorescence :


  • Absorption d'énergie lumineuse par une molécule (fluorochrome)

  • Passage à l'état de Molécule excitée

  • Relaxation partielle avec perte de chaleur par échange avec le milieu ambiant

  • Retour à l'état fondamental par émission lumineuse ( de plus grande longueur d'onde que l'onde de stimulation) = spectre de fluorescence



Colorimétrie :

Colorants : biotine, digoxygénine, fluoresceine

Exemple : l’ADN cible est fixé sur une membrane et les sondes sont biotinylées. La détection est réalisée par ajout d’un complexe streptavidine-HRP (HorseRadish peroxidase ou Peroxydase de Raifort), l’enzyme permettant l’oxydation d’un chromogène. La mesure du signal est réalisée par colorimétrie
Chimioluminescence

La chimioluminescence se produit au cours d'une réaction chimique lorsque l'excès d'énergie est libérée sous forme de lumière.
De nombreuses réactions produisent ce phénomène et chacune émet une lumière de longueur d'onde spécifique, et d'intensité proportionnelle à la quantité de molécules réactives présentes.
Attention : ces sondes « froides » présentent un problème de sensibilité et leur utilisation ne fait pas toujours l'unanimité.

I.1.8.Hybridation moléculaire


L’hybridation moléculaire désigne l’association qui peut avoir lieu entre deux acides nucléiques simples brins de séquences complémentaires et qui conduit à la formation d’un double brin ou duplex. Cette association s’effectue par l’établissement de liaisons hydrogènes spécifiques : deux liaisons entre l’adénine (A) et la thymine (T) (ou l’uracile U) et trois entre la cytosine (C) et la guanine (G). La formation et la stabilité des duplex dépendent de nombreux facteurs en plus de la composition en bases : longueur des duplex, complexité de la séquence.

L’hybridation est à la base de nombreuses techniques de biologie moléculaire impliquant la mise en présence d’ au moins deux brins simples d’acides nucléiques dans des conditions physico chimiques précises. Le brin, dont on connaît au moins une partie de la séquence, est une sonde, l’autre brin, celui que l’on souhaite caractériser constitue la cible. L’un des deux brins est marqué par couplage chimique avec une molécule pouvant générer un signal.

Les sondes nucléotidiques



Définition

Une sonde nucléotidique est un segment de nucléotides qui permet de rechercher de manière spécifique un fragment d’acide nucléique que l’on désire étudier. Cette réaction sonde-fragment correspond à une réaction d’hybridation moléculaire.
Caractéristiques générales

Une sonde nucléotidique peut être soit une séquence d’ADN ou d’ARN, mais obligatoirement monobrin. Sa taille est très variable: oligonucléotide de 20-30 nucléotides ou à l’opposé de plusieurs centaines de nucléotides. La sonde est complémentaire et antiparallèle du fragment recherché. Dans un mélange complexe où s’effectue l’hybridation moléculaire, la sonde doit être facilement repérable grâce à un marquage avec un radioisotope (marquage chaud), mais il existe également des sondes appelées sondes froides sans marquage par un radioisotope.
Obtention d’une sonde

Il existe plusieurs possibilités pour obtenir une sonde nucléotidique:

- Une sonde oligonucléotidique peut être fabriquée par synthèse chimique, si la séquence de l’ADN à repérer est connue. Si elle est inconnue, on peut étudier la protéine correspondante et remonter grâce au code génétique à la séquence d’ADN. Dans ce dernier cas, le travail est particulièrement laborieux (nombre de codons élevé pour un même acide aminé).

- Une sonde peut être un ADNc. Une partie seulement du ADNc est utilisée (après action d’enzymes de restriction et clonage des fragments obtenus).

- Une sonde peut être théoriquement du mARN.
L’hybridation moléculaire avec la sonde

L’hybridation moléculaire sonde-fragment d’ADN à repérer nécessite des conditions physico-chimiques parfaites (tampon, pH, température, etc..). Ces conditions sont appelées la stringence. Plusieurs facteurs peuvent également intervenir comme la longueur de la sonde et la complémentarité sonde-fragment avec possibilité de mauvais appariements.




I.1.9.Southern Blot



Cette méthode a été initialement décrite par E.M. SOUTHERN en 1975. Elle consiste à détecter spécifiquement des fragments d’ADN transférés sur filtre par leur hybridation à des séquences complémentaires marquées par un radioisotope. Les étapes successives de cette technique sont les suivantes:

-Extraction de l’ADN génomique.

Cette extraction s’effectue à partir des leucocytes circulants par exemple obtenus à partir de sang total.
-Digestion par des enzymes de restriction différentes du même ADN génomique.

L’ADN génomique est digéré par des enzymes de restriction différentes: dans le tube 1, on réalisera une digestion par l’enzyme 1; dans le tube 2, une digestion par l’enzyme 2; etc....). On peut bien entendu réaliser des digestions par deux enzymes dans un même tube. Dans ces conditions, on obtient un très grand nombre de fragments, mais seuls quelques fragments correspondent à une partie ou à la totalité du gène étudié.
-Séparation électrophorétique des fragments d’ADN par électrophorèse dans un gel d’agarose.

Après séparation électrophorétique en gel d’agarose des fragments d’ADN bicaténaires obtenus par digestion enzymatique, on réalise une dénaturation des fragments par un traitement alcalin du gel d’électrophorèse. Ce traitement transforme les fragments d’ADN double brin (ou bicaténaires) en fragments d’ADN monobrin (ou monocaténaires).
-Transfert des fragments monocaténaires du gel d’agarose à un support souple (feuille de nylon par exemple).

Le transfert des fragments monocaténataires du gel d’agarose à un support type nylon s’effectue par simple capillarité.
-Fixation des fragments monocaténaires d’ADN sur le support souple et hybridation dans des conditions optimales de stringence avec une sonde complémentaire marquée à un radioisotope.
Les fragments monocaténaires d’ADN transférés sur un support solide souple (nylon) sont mis en présence d’une sonde qui va s’hybrider dans des conditions physico-chimiques bien définies. on parle de conditions optimales de stringence. La sonde s’apparie avec les fragments d’ADN monocaténaire selon les règles de complémentarité. De plus, elle est marquée avec un radioisotope (soit à son extrémité 5’, soit à l’intérieur de la chaîne polynucléotidique).
-Lavages et révélation (dans ce cas par autoradiographie).

Après de nombreux lavages, le support solide est mis en contact avec un film photographique pendant plusieurs jours. Le film est ensuite révélé. Les bandes d’ADN monocaténaires hybridées avec la sonde radioactive sont visibles sous forme de bandes noires sur un fond blanc. La position de ces bandes par rapport à des témoins de poids moléculaire permet de déterminer la taille de ces fragments.

Pour vous aider à mieux visualiser les différentes étapes de la technique du southern blot , nous vous proposons une animation. Pour démarrez, il vous suffit de cliquer sur http://vector.cshl.org/Shockwave/southan.html


Nous citerons parmi les applications de la technique de SOUTHERN:

Ex1 :Carte de restriction de l’ADN.


Les enzymes de restriction coupent l’ADN au niveau de séquences parfaitement définies. Il est donc possible d’établir une véritable carte d’un gène donné par la technique de Southern Cette carte porte le nom de carte de restriction.

En pratique, l’ADN à étudier est réparti en différentes fractions. Chaque fraction est traitée par une enzyme de restriction ou un couple d’enzymes de restriction. Ainsi dans l’illustration ci-dessous. Dans le puits 1, on dépose l’ADN digéré par Eco RI seule; dans le puits 2, on dépose l’ADN digéré par Hind III seule et dans le puits 3, l’ADN digéré par Eco RI et Hind III. La détection des différents fragments est réalisée à l’aide d’une sonde marquée du gène étudié (voir illustration).

Illustration des fragments après migration



Illustration des positions sur l’ADN

Légende :

(1): Position des coupures par Eco RI.

(2): Position des coupures par Hind III.

(3): Position des coupures par Hind III + Eco RI.

Ex2 : Si on dispose de sondes spécifiques du gène à explorer. Mise en évidence des délétions dans un gène ou une zone juxta-génique. L’étendue de la délétion peut être estimée par la détermination de la taille des fragments d’ADN.

Ex3 : Comparaison de l’ADN de différents individus avec mise en évidence des polymorphismes de restriction.

En présence de mutation(s) ponctuelle(s) dans des sites de restriction, des variations dans la taille de certains fragments seront observées et ceci par exemple à l’intérieur d’une même population. Ces petites différences entre des individus dans une même population sont appelées de polymorphisme de taille des fragments de restriction (ou RFLP pour « restriction fragment length polymorphism »).

Ex4 : Mise en évidence des recombinaisons entre des gènes.

I.1.10.Northern Blot


Le principe est le même que pour le Southern Blot mais ici ce sont les ARN qui sont étudiés.
donc plus besoin de digérer par enzyme de restriction.

La visualisation d'un ARN par une sonde permet de :

  • apprécier sa distribution dans les tissus, étudier son abondance relative

  • déterminer sa taille

  • détecter les intermédiaires de maturation et les différentes formes d'épissage de l'ARN.


I.1.11.Dot Blot


Cette technique permet de quantifier un ARN ou fragment d'ADN donné sans séparation préalable sur gel d'électrophorèse.


I.1.12.Hybridation in situ (HIS)


On appelle hybridation in situ (HIS) l'utilisation de sondes d'acides nucléiques pour mettre en évidence et localiser, dans des cellules ou des tissus, des séquences d'acides nucléiques, complémentaires de la sonde par leurs bases. L'HIS est un outil incomparable pour étudier l'expression des gènes. Elle est très proche, dans son principe, des Southern et des Northern blots et repose, comme eux, sur l'hybridation d'une sonde d'acide nucléique (ADN ou ARN) marquée avec une séquence complémentaire d'acides nucléiques que l'on cherche à identifier et à localiser. Mais les Southern et Northern blot se font sur des broyats de tissus, alors que l'HIS s'effectue sur une coupe histologique de tissu, apportant ainsi des informations précises sur la localisation des acides nucléiques étudiés. Les sondes utilisées sont le plus souvent de l'ADN (double brin ou plus rarement monobrin) ou un ARN-messager (riboprobes) ou des oligonucléotides synthétiques (de 20 à 50 nucléotides). Le marquage des sondes peut être réalisé par des isotopes radio-actifs («sondes chaudes» : tritium H3, phosphore P32 ou P33, soufre S35) ou par des produits non radio-actifs (sondes dites «froides») soit fluorescents (FISH) soit non-fluorescents comme la biotine («sondes biotynilées»), la digoxigénine ou des enzymes (phosphatase alcaline par exemple). Le mode de révélation varie en fonction de la nature du marquage, autoradiographies en cas de sondes radioactives, microscopie à fluorescence en cas de FISH, avidine ou streptavidine pour la biotine, anticorps marqués par un enzyme et/ou par l'or colloïdal pour la digoxigénine, anticorps ou chromogènes pour les enzymes. Le comptage des grains d'argent sur les autoradiographies permet une étude quantitative (ou plutôt semi-quantitative).

Primitivement décrite pour la microscopie optique, l'HIS est actuellement tout à fait réalisable en microscopie électronique grâce en particulier à l'introduction de milieux d'inclusion hydrosolubles comme le Lowicryl. L'or colloïdal est considéré comme le marqueur de choix pour les méthodes d'HIS en ME. Plusieurs tailles de grains (permettant des doubles marquages) peuvent être utilisées (0.8 à 20 nm) ; la taille des grains peut être augmentée par des méthodes à l'argent

Hybridation sur colonies


Transfert de colonies de cellules d'une boite de Petri sur un filtre ou une membrane avant de procéder à une hybridation moléculaire de leur matériel génétique avec une sonde marquée.

Hybridation sur chromosomes (FISH)



La FISH (Fluorescence in Situ Hybridization) repose sur la capacité d'hybridation de deux brins d'ADN complémentaires. La région à étudier (située sur un chromosome préalablement légèrement dénaturé par traitement chimique pour le débarrasser des protéines associées) est repéré grâce à une sonde oligonucléotidique complémentaire. Certains de ces nucléotides de cette sonde sont couplés à une molécule antigénique reconnue par un anticorps fluorescent. En utilisant diverses sondes, greffées à des antigènes différents, on peut ainsi visualiser simultanément plusieurs séquences sur un ou plusieurs chromosomes. Technique permettant de déterminer la position d'un fragment d'ADN dans le génome : le repérage se fait par rapport au bras du chromosome (p:bras court et q:bras long) et par rapport aux bandes (mises en évidence par la coloration Giemsa) du chromosome.


1   2   3   4   5   6

similaire:

Synthèse in vitro iconSynthèse : organisation du génome
«Collier de perles» à cause de son aspect caractéristique en microscopie électronique. Cette fibre correspond au simple agencement...

Synthèse in vitro iconSynthèse et propositions
«valorisation» en synthèse de ses travaux, plus susceptible de se transformer en propositions, pouvant nourrir la réflexion concernant...

Synthèse in vitro iconIii. Les différents besoins pour une culture cellulaire in vitro

Synthèse in vitro iconTaxonomy of actinobacterial strains isolated from Saharan soils and...

Synthèse in vitro iconL’évaluation biologique des hémopathies malignes
«cytogénétique conventionnelle» = caryotype (si la cellule peut se diviser in vitro)

Synthèse in vitro iconAcheteur senior cdi
«in vitro», fort de 5000 collaborateurs présents dans 150 pays, bio-rad recrute un

Synthèse in vitro iconPrologue Savants et policiers
«substances explosives». – Alexis Pharmaque. – Les paroles s’envolent, les écrits se volent. – La piste. – Encore Monsieur Synthèse....

Synthèse in vitro iconRapport final oecd org/pdf/M00025000/M00025632. pdf Juillet 2001...
«Synthèse des questions liées à la façon dont les adultes apprennent pédagogie et motivations»

Synthèse in vitro iconSynthèse sympathie

Synthèse in vitro iconSynthèse bibliographique








Tous droits réservés. Copyright © 2016
contacts
b.21-bal.com