Synthèse in vitro








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Séparation des acides nucléiques

I.1.5.Electrophorèse


Technique qui permet de séparer des molécules en fonction de leur taille et de leur charge en utilisant un courant électrique. On peut ainsi analyser et purifier dans un milieu gélifié (gel d'agarose, gel de polyacrylamide...) l'ADN, l'ARN, les protéines.

Migration électrophorétique des fragments d’adn.

Les fragments d’ADN après digestion par les enzymes de restriction peuvent être séparés par électrophorèse sur un gel d’agarose. Dans ce type de gel, les migrations des fragments d’ADN dépendent de la taille du fragment plus que de la charge de celui-ci. Plus le fragment a une taille élevée, moins la migration électrophorétique par rapport au puits d’inclusion sera importante. A l’opposé les fragments de petite taille auront une distance de migration la plus élevée. La détermination précise des tailles des fragments séparés par électrophorèse est effectuée en faisant migrer des marqueurs de poids moléculaire en parallèle avec les échantillons à analyser. La détection de l’ADN sur ce type de gel est réalisée par exposition aux rayons UV après réaction avec un réactif spécifique (bromure d’éthidium par exemple, agent s’intercalant entre les brins d’ADN).

L’électrophorèse des fragments d’ADN en gel d’agarose permet des séparations jusqu’à 20-25 kb (20000-25000 pb). Le tampon utilisé pour la migration électrophorétique a un pH basique (par exemple: 8,3 dans le cas du tampon appelé TBE = Tris-Borate-EDTA).

Des fragments d’ADN de taille restreinte (inférieure à 1000 paires de bases) peuvent être séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.

D’autres techniques électrophorétiques existent comme l’électrophorèse en champ pulsé qui permet de séparer des grands fragments d’ADN (taille supérieure à 50 kb). Le support d’électrophorèse est constitué par de l’agarose et on applique au gel un champ électrique de nature variable. Ainsi, le champ électrique peut être appliqué dans une direction donnée pendant 1 minute puis dans une direction perpendiculaire au champ précédent pendant une minute et ainsi de suite. Le processus de réorientation des macromolécules dans le champ électrique dépend de leur taille.
Illustration d’une électrophorèse en gel d’agarose après migration et coloration par le bromure d’ethidium.


Légendes des figures :
FIGURE DE GAUCHE

- PISTE 1: Marqueurs de taille (en paires de bases).

- PISTE 2: Echantillon d’ADN dont la taille est à déterminer.

FIGURE DE DROITE

-Courbe d’étalonnage en abscisses, les distances par rapport au puits d’inclusion:
et en ordonnées les poids moléculaires (échelle logarithmique).


I.1.6.Ultracentrifugation



La centrifugation est une technique de séparation rapide des particules solides (les plus lourdes) des substances en solution (moins lourdes).

Une suspension de macromolécules peut éventuellement laisser sédimenter celles-ci sous l'effet du champ de pesanteur. Cependant, l'agitation thermique met en œuvre des énergies bien supérieures à l'énergie potentielle de gravitation, pour une macromolécule se déplaçant sur quelques centimètres.

Pour rendre possible la séparation, il faut travailler avec de très grandes accélérations. Ceci est possible avec des centrifugeuses ou ultracentrifugeuses. Ces appareils, sont composés des éléments suivants:

- un moteur capable de tourner à plusieurs dizaine de milliers de tours par minute

- un rotor, capable de supporter des rotations aussi rapides (en titane généralement pour les rotors des ultracentrifugeuses)

- une enceinte dans laquelle est disposé le rotor, qui est réfrigérée et sous vide. En effet, pour les vitesses de rotation les plus rapides, le déplacement des extrémités du rotor (diamètre de l'ordre de 20-40 cm) est supersonique. Ceci entraînerait un échauffement insupportable dans l'air.

- cette enceinte est de plus blindée pour éviter des accidents en cas d'explosion du rotor.
Cette technique de centrifugation a été mise au point par Svedberg (1923), qui l'utilisa pour déterminer des masse moléculaires. Elle fut appliquée à la biologie par le physiologiste belge Albert Claude (Prix Nobel 1974), qui isola grâce à elle les microsomes, c'est-à-dire ce qui reste de la cellule lorsque l'on sépare les mitochondries et les réticulums. A des vitesses de l'ordre de 20 000 tours/minute, il est possible de :
- séparer les constituants cellulaires (membranes/cytosol) sous un champ supérieur à 100 000 g entre des couches de saccharose de différentes densités.

- séparer différents types A.D.N. (chromosomique et plasmidique) dans un gradient de chlorure de césium. La vitesse de déplacement des molécules est exprimée en Svedberg. S=10-13 secondes.

Note : L'ADN satellite peut être séparé du reste de l'ADN génomique par centrifugation en gradient de densité.

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