Synthèse in vitro








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LES OUTILS DE GENETIQUE MOLECULAIRE

4 modules

Module 1 : Les techniques liées aux acides nucléiques

Module 2 : La cartographie

Module 3 : Le séquençage

Module 4 : Les gènes et leur expression


  1. LES TECHNIQUES LIEES AUX ACIDES NUCLEIQUES




Sommaire


Préparation des acides nucléiques

Extraction/Purification

Les enzymes agissant sur les acides nucléiques

Dosage et conservation

Synthèse in vitro

Séparation des acides nucléiques

Electrophorèse

Ultracentrifugation

Détection, caractérisation et identification des acides nucléique

Marquage et suivi des acides nucléiques

Marquage radioactif

Marquages froids : colorimétrie, fluorescence ; chimioluminescence ;

Hybridation moléculaire

Southern Blot

Northern Blot

Dot Blot

Hybridation in situ (HIS)

Amplification et sélection d’acides nucléiques particuliers

PCR

RT-PCR

Clonage

Construction de banques

Criblage de banques

Utilisation des vecteurs recombinés

    1. Préparation des acides nucléiques

I.1.1.Extraction/Purification


L’ADN (ou l’ARN) doit impérativement être purifié à partir de matériels biologiques dans des conditions optimales de qualité et de quantité.

Dans la pratique, les acides nucléiques sont souvent extraits du sang total. Le procédé classique est l’extraction par le couple phénol-chloroforme. Le phénol est un excellent agent dénaturant des protéines et il permet de séparer efficacement les protéines et les acides nucléiques. Il est ensuite éliminé par l’extraction avec du chloroforme (non miscible avec l’eau). La séparation des phases aqueuse et organique peut se faire par centrifugation. La phase aqueuse contient les acides nucléiques. Des traitements par des agents clivant les protéines (protéolyse) peuvent être nécessaires. Les acides nucléiques peuvent être finalement récupérés sous forme solide à la suite de précipitation par l’alcool éthylique ou par l’alcool isopropylique. De nombreux réactifs sont disponibles, prêts à l’emploi, ce qui permet de simplifier les opérations de purification. Il est possible d’extraire les acides nucléiques à partir d’échantillons biologiques variés: cultures cellulaires, tissus divers etc... Les méthodes d’extraction doivent bien entendu être adaptées aux quantités disponibles de matériel biologique.
ANNEXE1

Extraction d’ADN à partir du sang

Faire éclater les globules rouges du sang par choc osmotique en le mélangeant à une solution hypotonique. Récupérer des globules blancs par centrifugation. Ajouter un mélange de détergent (SDS ou Sarcosyl) et de protéinase K ; le détergent détruira les membranes et la protéinase digérera les protéines associées à l'ADN. Extraire l'ADN des protéines par un mélange phénol-chloroforme. Ajouter des sels pour augmenter la force ionique puis précipitation de l'ADN par l'alcool éthylique absolu froid (-20°C).

L'ADN précipite sous forme de filaments, visibles à l’œil nu, qui sont récupérés par enroulement sur une baguette de verre. Re-dissoudre l'ADN dans une solution tamponnée. L'ADN peut être ainsi conservée à 4°C plus d'un an.

Remarque : la taille des fragments engendrés par les cassures mécaniques au cours de cette extraction est supérieure à 20kB. Le rendement de cette méthode est de quelques centaines de microgrammes d'ADN pour 10 à 20 ml de sang. Attention : éviter de congeler l'ADN génomique, la congélation provoquant de nombreuses cassures de la molécule.


Extraire des ARN
Extraction des ARN totaux

La méthode la plus sûre est la méthode de Chirgwin (extraction d'ARN à partir de pancréas, tissu très riche en RNAses). Broyer le tissu dans un homogénéisateur de Potter avec une solution adéquate (détergent SDS ou Sarcosyl + un agent dissociant + une solution tampon + un agent réducteur). Centrifuger l'homogénat pour éliminer les débris cellulaires.

L'extraction des ARN se fait : soit par précipitation différentielle de l'ARN et de l'ADN / soit par ultracentrifugation sur coussin de chlorure de césium (seul l'ARN peut, vue sa densité, traverser ce coussin et être récupéré dans le culot

Laver l'ARN dans l'acétate de sodium et précipiter à l'alcool. L'ARN peut être conservé plus d'un an soit sous forme précipitée dans l'éthanol, soit sous forme congelée à -80°C .

Extraire de l’ARN à partir de tissus ou cellules en culture

Les sources cellulaires : des biopsies (ex : de villosités choriales lors d'un diagnostic prénatal) ou cultures de cellules. Les cellules doivent préalablement être dissociées et homogénéisées lors du passage du tissu dans un homogénéisateur de Potter en présence de détergent. Le protocole est ensuite identique à celui mentionné ci-dessus.
Purification des ARNm à partir de ARN totaux

La majorité des ARNm eucaryotes possèdent une queue polyadénylée (polyA) à son extrémité 3', utilisée pour purifier les ARNm par affinité.

Passer la solution d'ARN sur une colonne d'affinité dont les sites de fixation sont des oligonucléotides polydT ou polyU. Les ARN polyA sont retenus alors que les ARNt et ARNr non. Eluer les ARNm et les récupérer par précipitation par l'alcool éthylique absolu froid. On obtient ~50%d'ARN non polyA. Pour enrichir en ARN polyA, repasser sur la colonne.
Pour d’autres informations sur les protocoles d’extraction / purification de l’ADN, cliquez sur http://www.john-libbey-eurotext.fr/articles/abc/57/1/77-84/

I.1.2.Les enzymes agissant sur les acides nucléiques

Les enzymes de restriction




Généralités

Découvertes à partir de 1973. Les enzymes de restriction sont capables de reconnaître spécifiquement une courte séquence, de 4 à 10pb, et de cliver l'ADN au site reconnu. Ils permettent de fragmenter l'ADN en segments de taille réduite, ou de le couper à tel ou tel site désiré. Certains enzymes coupent le site en son milieu et produisent deux fragments dont les extrémités sont franches. Cependant, la plupart réalisent une coupure dissymétrique : on parle dans ce cas d'extrémités cohésives (chaque fragment possède une chaîne qui dépasse l'autre de quelques bases). Plusieurs centaines de ces enzymes ont été caractérisés : ils reconnaissent une grande variété de sites de coupure.
Les enzymes de restriction sont utilisés pour établir une carte de restriction de toute molécule d'ADN que l'on souhaite caractériser. Cela consiste à déterminer l'ordre des sites de restriction le long de cette molécule, qui vont produire, après "digestion enzymatique" de cette molécule, des fragments de tailles différentes dont la taille pourra être définie par électrophorèse.

Les enzymes de restriction appartiennent à la classe des endonucléases, c’est-à-dire des enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nucléotides à l’intérieur d’un acide nucléique. Les endonucléases se différencient des exonucléases qui dégradent la molécule d’ADN à partir de l’une de ses extrémités (3’ ou 5’).


Séquences d’adn reconnues par les enzymes de restriction.

Les séquences de nucléotides reconnues par les enzymes de restriction sont habituellement des séquences dites palindromiques. Les séquences palindromiques sont des séquences où la succession des nucléotides lue dans le sens 5’à3’ (gauche-droite) pour le premier brin est identique à la séquence lue dans le sens droite-gauche pour le second brin (sens 5’à3’). Ces séquences palindromiques sont le plus souvent constituées de 4, 5 ou 6 paires de bases. Il faut remarquer que dans les ADN, on rencontre statistiquement des séquences reconnues par des enzymes de restriction. Ainsi, la séquence GATC reconnue par l’enzyme Mbo I est présente avec une fréquence statistique de 1 / 256 paires de bases (1/ 44). En effet, la fréquence de coupure d’un ADN par une enzyme de restriction donnée peut être approchée statistiquement en considérant le nombre de nucléotides de la séquence spécifique reconnue par l’enzyme. Ainsi, par exemple, dans la séquence de six nucléotides: GGATCC reconnue par l’enzyme Bam HI, on aura donc une fréquence de coupure statistique de 1 / 46, soit 1 coupure tous les 4096 nucléotides.

Origine des enzymes de restriction.

Les enzymes de restriction sont extraites de micro-organismes, le plus souvent des bactéries. Les bactéries peuvent être parasitées par des virus à ADN. Les bactéries fabriquent des enzymes de restriction qui sont capables de cliver les ADN étrangers. Pour éviter une auto-destruction de leur propre ADN, elles se protègent contre leurs propres enzymes de restriction par une modification des sites de restriction correspondants.

Nomenclature des enzymes de restriction.

Les enzymes de restriction présentent une nomenclature bien précise. Leur nom comporte plusieurs lettres (3 ou 4). La première lettre de dénomination de l’enzyme est écrite en majuscule, elle correspond au genre de la bactérie d’où a été extraite l’enzyme. La seconde lettre et la troisième lettre (en minuscules) correspondent à l’espèce de la bactérie d’où l’enzyme est extraite. On peut avoir une quatrième lettre écrite en majuscule correspondant à la souche bactérienne. Enfin pour terminer, un chiffre romain indique l’ordre de caractérisation de ces enzymes.

Exemples:

Eco RI Extraite de Escherichia coli RYB site reconnu: G / AATTC

Sma I Extraite de Serratia marcescens site reconnu: CCC / GGG

Pst I Extraite de Providencia stuartii site reconnu: CTGCA / G

Notion d’isoschizomères

Des enzymes de restriction différentes peuvent reconnaître des mêmes sites spécifiques, on les appelle isoschizomères. Les isoschizomères fournissent souvent après clivage enzymatique des fragments dont les extrémités sont différentes.
Exemple :

Soit la séquence suivante: GGTACC, cette séquence est coupée par l’enzyme Kpn I et l’enzyme Acc65 I:

Kpn I:

5’-G-G-T-A-C/C-3’
3’-C/ C-A-T-G-G-5’

Acc65 I:

5’-G/G-T-A-C-C-3’
3’-C-C-A-T-G/G-5’

Ces enzymes sont des isoschizomères, elles reconnaissent en effet la même séquence nucléotidique GGTACC. On voit tout de suite que les extrémités des fragments obtenus diffèrent.

Types de coupures realisées par les enzymes de restriction.

Les enzymes de restriction peuvent donner deux types de coupures: la coupure à bouts francs et la coupure à bouts collants.

La coupure à bouts francs aboutit à une coupure au milieu de la séquence palindromique. La coupure à bouts collants (ou à extrémités adhésives) correspond à une coupure qui se fait de part et d’autre du centre de symétrie.

Les sites de restriction sont repérés dans l’ADN par l’enzyme de restriction qui coupe l’ADN en principe autant que fois qu’il y a de sites de restriction. Ceci est valable pour une enzyme de restriction donnée, pour une autre enzyme, la coupure se fera en une position différente sur l’ADN. On voit tout de suite les possibilités considérables de ce type d’outils enzymatiques. L’ADN est découpé en fragments variables et ceci aussi bien l’ADN circulaire des bactéries ou des plasmides que l’ADN linéaire.
Les classes d’enzymes de restriction.

La plupart des enzymes de restriction utilisées au laboratoire présentent un site de reconnaissance (souvent palindromique) et un site de coupure identique ou proche du site de reconnaissance, ce sont des enzymes de type II. Certaines bactéries possèdent d’autres types d’enzymes de restriction.

Les enzymes de type I reconnaissent des séquences sur l’ADN sans aucune symétrie. Ces enzymes coupent non pas au niveau de la séquence de reconnaissance mais 1000 à 5000 paires de bases plus loin. Les enzymes de type III présentent également un site de reconnaissance mais coupent une vingtaine de nucléotides plus loin.
Méthylation des sites de restriction et inactivation des enzymes de restriction.

L’ADN bactérien présente des sites de restriction susceptibles d’être repérés par les enzymes de restriction que possèdent la bactérie. Pour éviter une auto-destruction, les enzymes de modification de l’ADN bactérien interviennent. Ces enzymes de modification sont des méthylases bactériennes (ou enzymes de méthylation). La méthylation de la cytosine (sur le carbone 5) ou de l’adénine (sur l’azote 6) appartenant à des sites de restriction aboutit à une inactivation de l’enzyme de restriction correspondante. Cette méthylation peut se réaliser sur une base ou sur plusieurs bases appartenant au site de restriction. Les méthylases bactériennes sont très spécifiques.

Utilisations des enzymes de restriction.

Les utilisations des enzymes de restriction sont très nombreuses en biologie moléculaire. Par exemple, elles permettent de fractionner l’ADN en multiples fragments susceptibles d’être séparés par les techniques d’électrophorèse. Les enzymes de restriction peuvent être utilisées pour préparer un fragment d’ADN d’un gène donné (insert) à être inséré dans un vecteur comme un plasmide. Les enzymes de restriction sont utilisées couramment pour rechercher des mutations dans le génome.

Les enzymes de restriction sont utilisées pour rechercher dans l’ADN des cellules eucaryotes les méthylations de bases. Ces méthylations ont une signification complètement différente des méthylations de bases observées chez les procaryotes. Elles sont en relation directe avec des modifications de l’expression des gènes des eucaryotes. La méthylation provoque le verrouillage de l’expression de tel ou tel gène dans un tissu. Les méthylations dans le génome des eucaryotes concerne les cytosines impliquées dans les doublets dinucléotidiques CG. La recherche de ces doublets et de la présence ou non d’une méthylation sur les cytosines est réalisée à l’aide de deux enzymes de restriction, une enzyme insensible à la méthylation des cytosines et une autre enzyme sensible à la méthylation des cytosines.


Notion d’enzymes compatibles

Deux enzymes de restriction sont dites compatibles quand elles génèrent après digestion des fractions aux extrémités cohésives complémentaires. Ces fragments peuvent être facilement ligaturés.
Exemple: Les enzymes Bam HI (G / GATCC) et Mbo I ( / GATC):

Après action de Bam HI:

Après action de Mbo I:


Ligatures possibles : 1+4 et 2+3.


Les outils enzymatiques autres que les enzymes de restriction



Les enzymes coupant l’adn.

La DNase

La DNase utilisée au laboratoire est extraite du pancréas de bovin. Il s’agit d’une endonucléase qui coupe l’ADN double brin (mais aussi l’ADN simple brin). Elle conduit à des coupures ou « nicks » tout à fait au hasard, sans reconnaissance d’un site spécifique (ce qui la distingue des enzymes de restriction). On obtient des fragments de tailles variées (ou oligonucléotides) qui possèdent en leur extrémité 5’ un groupement phosphate. Cette enzyme est sensible à des ions bivalents (Mg2+ et Mn2+). Elle est utilisée pour des marquages de sondes avec des radioisotopes.
La nucléase S1

Cette enzyme extraite d’un champignon, n’attaque que l’ADN simple brin. Elle n’attaque pas en principe les ADN doubles brins et les hybrides ADN-ARN.
Les enzymes assurant la ligature.
Les ligases

Les ligases sont capables de lier par une liaison ester un fragment avec un groupement phosphate en 5’ et un groupement OH en 3’ et ceci en présence d’ATP. Elles peuvent effectuer des ligatures sur des fragments d’ADN avec bouts francs ou des bouts collants (ou extrémités cohésives). Elles sont extraites de bactéries. Il existe ADN et ARN ligases.
Les enzymes enlevant ou ajoutant des groupes phosphates.
Enzymes enlevant des groupes phosphates

Ces enzymes sont appelées phosphatases. Les phosphatases alcalines sont actives à pH alcalin. Elles permettent d’enlever le groupement phosphate situé en 5’ d’une chaîne d’ADN. Elles sont extraites de bactéries ou d’origine animale (intestins). Elles sont utilisées pour préparer de l’ADN recombinant.
Enzymes ajoutant des groupements phosphates

Les kinases permettent de fixer un groupement phosphate en présence d’ATP. Dans cette molécule d’ATP, le phosphate fixé est celui situé en position gamma (position la plus externe) de la molécule d’ATP. Le groupement phosphate est fixé à l’extrémité 5’ d’un ADN préalablement déphosphorylé. Ces kinases sont extraites de bactéries.

Les enzymes recopiant les acides nucléiques.
Propriétes générales

Les enzymes recopiant aussi bien une chaîne d’ADN ou d’ARN ont les propriétés générales suivantes:

- Elles synthétisent le nouveau brin dans le sens 5’à3’.

- Cette synthèse s’effectue de manière complémentaire et antiparallèle.

- Elles nécessitent la présence de nucléosides triphosphates (NTPs) ou de désoxynucléosides triphosphates (dNTPs).

Les enzymes recopiant un adn en adn

Ces enzymes sont des ADN polymérases ADN dépendantes. Elles ne sont pas capables de synthétiser le brin nouveau d’ADN sans la présence d’une amorce d’acide nucléique. Les ADN polymérases catalysent la réaction générale suivante:

(dNMP)n + dNTP à (dNMP)n+1 + PPi

avec N = A, C, T ou G. (PPi = groupe pyrophosphate).

Toutes les ADN polymérases possèdent les caractéristiques suivantes:

- Elles ont besoin d’une amorce avec une extrémité 3’-OH libre.

- La chaîne nouvelle d’ADN est synthétisée dans le sens 5’à3’.

- La chaîne nouvelle est complémentaire de la chaîne matrice d’ADN et antiparallèle.
Exemple1 L’adn polymérase I (extraite de E. Coli) et le fragment de klenow

Comme exemple-type d’ADN polymérase, nous citerons l’ADN polymérase I qui est extraite d’E..coli. Cette enzyme possède des propriétés polymérasiques, mais aussi des propriétés exonucléasiques. Il est important de préciser que les exonucléases peuvent couper les nucléotides un par un à partir d’une chaîne polynucléotidique avec une spécificité soit de l’extrémité 5’ (coupure 5’à3’), soit de l’extrémité 3’ (coupure 3’à5’). L’ADN polymérase I possède les deux activités exonucléasiques: 5’à3’ et 3’à5’. Cette enzyme est constituée par une seule chaîne polypeptidique.

Au laboratoire, on utilise souvent une enzyme préparée à partir de l’ADN polymérase I qui est appelée fragment de KLENOW. Cette enzyme ne possède plus d’activité exonucléasique 5’à3’, il reste les propriétés polymérasiques et les propriétés exonucléasiques 3’à5’. L’activité 3’à5’ permet à l’enzyme au cours d’une synthèse d’un fragment d’ADN de contrôler si l’appariement de la base qui vient d’être ajoutée est conforme aux règles de complémentarité. Cette remarquable activité exonucléasique 3’à5’ est encore appelée la fonction d’édition de l’enzyme.
Pour plus d’informations sur la DNA polymérase et sa mise en évidence voire le chapitre synthèse in vitro de ce cours.
Exemple2 La séquenase

Cette enzyme est d’origine bactérienne mais elle ne possède plus d’activité 3’à5’. Elle est utilisée dans le séquençage de l’ADN.
Exemple3 La Taq polymérase

La Taq polymérase est une ADN polymérase extraite de bactéries présentes dans les sources chaudes. Elle permet de travailler à des températures plus élevées que les températures usuelles (ambiante ou 37°C). Elle est très utilisée dans les réactions d’amplification génique et également dans les réactions de séquençage de l’ADN. En principe, elle est dépourvue de l’activité exonucléasique 3’à5’.


Les enzymes recopiant un arn en un adn


Exemple1 la rétrotranscriptase ou transcriptase inverse

Cette enzyme est surtout présente dans les rétrovirus (virus à ARN). Elle permet de fabriquer à partir d’un ARN messager (mARN) un ADNc (ou séquence d’ADN complémentaire d’un mARN).

Elle possède les propriétés suivantes:

- C’est une ADN polymérase qui synthétise le nouveau fragment dans le sens 5’à3’.

- Elle est ARN-dépendante.

- Elle est dépourvue d’activité exonucléasique 3’à5’, donc de fonction d’édition. Elle peut donc insérer des bases par erreur.

- Elle a une activité RNAse.

La technique classique pour préparer un ADNc à partir d’un mARN consiste tout d’abord à fournir une amorce à la rétrotranscriptase. Cette amorce peut être une séquence courte par exemple une séquence oligo(dT) capable de s’hybrider avec l’extrémité poly(A) du mARN. A partir de cette amorce, la rétrotranscriptase poursuit la copie en ADN du mARN (élongation). De plus à la fin de la copie, elle est capable de recopier son propre travail, donc elle réalise une boucle à l’extrémité 3’ de l’ADN copié. Un traitement chimique doux permet de détruire le mARN simple brin mais pas sa copie d’ADN simple brin. On ajoute ensuite de l’ADN polymérase pour réaliser une copie de l’ADN simple en ADN double brin. La nucléase S1 peut ensuite éliminer l’extrémité de l’épingle à cheveu. On a ainsi formé un ADNc double brin. D’autres techniques existent pour préparer du ADNc à partir du mARN.


Les enzymes recopiant un adn en un arn

Les ARN polymérases réalisent des transcriptions de l’un des deux brins d’ADN en un brin d’ARN. Elles sont extraites des bactéries. Ces ARN polymérases possèdent les propriétés suivantes:

- Elles synthétisent le brin nouveau dans le sens 5’à3’.

- Elles n’ont pas besoin d’amorce pour commencer la synthèse (à la différence des ADN polymérases).

- Elles nécessitent des ribonucléosides triphosphates (ou NTPs) et également (comme les autres polymérases) des ions Mg2+.

- Elles sont dénuées d’activité d’édition.

- Enfin, dans des conditions normales de transcription, les ARN polymérases ne peuvent démarrer la transcription que si l’ADN à transcrire possède le promoteur spécifique correspondant.


I.1.3.Dosage et conservation

Estimation des quantités d’adn.


Cette estimation est indispensable après extraction d’ADN à partir d’un matériel biologique.

Méthode basée sur la fluorescence

Le principe est un fluorochrome qui se fixe sur le DNA et dont le taux de fixation est directement lié a la quantité de DNA émettra une quantité de fluorescence qui sera proportionnelle a la quantité de DNA présente.

Les différents fluorochromes:
-
Se fixant spécifiquement sur des paires de bases:
Bases A-T: Hoechst 332 et DAPI
Bases G-C: mithramycine

-
Intercalants: Iodure de propidium, Bromure d'ethidium et Acridine orange ( qui ont l'avantage d'être moins chers )


Méthode basée sur la spectrophotométrie
Le dosage s’effectue par spectrophotométrie dans l’ultra-violet à 260 nm. Il est indispensable de mesurer également l’absorption à 280 nm. Cette dernière longueur d’onde permet d’estimer la contamination éventuelle de l’extrait par des protéines. L’absorption se définit par l’unité de densité optique mesurée à 260 nm. Une unité de densité optique correspond à l’absorption d’une solution d’ADN double brin à la concentration de 50 µg/ml ou à l’absorption d’une solution d’ADN simple brin (ou d’ARN) à la concentration de 25 µg/ml.

Conservation de l’adn



Le stockage des acides nucléiques se fait au froid :

Pour un stockage à court terme, l'ADN est gardé à +4°C
Pour un stockage à long terme, l'ADN est placé à -20°C


I.1.4.Synthèse in vitro


Première manipulation génétique

Les séries d'expériences réalisées par Kornberg et son groupe préfigurent la génétique moléculaire moderne et méritent que l'on s'y arrête.

Le mode semi-conservatif de la synthèse de l'ADN implique les éléments suivants :

  • - une molécule d'ADN double brin capable de servir de modèle,

  • - des désoxyribonucléotides précurseurs de la chaîne nouvelle,

  • - une enzyme : ADN-polymérase, capable de les relier, cette enzyme (hypothétique pour l'instant) est fondamentale car non seulement elle devra assurer la liaison covalente (3'-5' phosphodiester) entre les nucléotides mais elle devra aussi être capable de "choisir" ceux-ci en fonction du modèle présent selon la régle d'appariement des bases.

Polymerisation de desoxyribonucleotides in vitro

Pour purifier et étudier cette enzyme, Kornberg a mis au point un système de synthèse in vitro à partir d'extraits d'abord assez grossiers d'E. coli.


Comment évaluer de tels systèmes ? Comment prouver qu'une synthèse a bien lieu in vitro ? Comment distinguer l'ADN néosynthétisé de celui qui est obligatoirement présent dans l'extrait comme modèle ?
Kornberg va lui aussi faire appel à des marqueurs isotopiques : des nucléotides comportant des phosphores 32 radioactifs (32P), si une synthèse a lieu, elle fera appel à ces précurseurs radioactifs et le polymère résultant sera "marqué", sera radioactif et facilement repérable. D'après l'analyse des nucléotides libres présents dans le cytoplasme, Kornberg décide de choisir des nucléotides triphosphorylés en 5' alors que les constituants de l'ADN sont monophosphorylés et que bien souvent, l'hydrolyse de polynucléotides produit des mononucléotides phosphorylés en 3' ! On verra que sans cette décision, l'expérience était vouée à l'échec : la cellule utilise effectivement des nucléotides 5' triphosphorylés et l'énergie fournie par la libération du pyrophosphate.

*Remarque concernant l'utilisation de précurseurs radioactifs

Dans son mélange réactionnel, Kornberg dispose d'ADN modèle, de précurseurs naturels, de l'ADN polymérase active (il l'espère), auquel il ajoute des précurseurs radioactifs. Après la réaction, la radioactivité se trouvera partagée entre l'ADN éventuellement synthétisé in vitro (en incorporant des monomères marqués) et l'excédent de précurseurs qui n'ont pas été incorporés. Il est donc essentiel d'éliminer tous ces précurseurs libres pour attribuer de la radioactivité à une macromolécule. En pratique, les macromolécules sont précipitées par adjonction d'un acide organique et les petites molécules "acido-solubles" (y compris les précurseurs radioactifs) sont éliminées par centrifugation. Le culot, après plusieurs lavages, contient les macromolécules (y compris l'ADN) débarrassées de tout précurseur non incorporé dans la chaîne.

En suivant la stratégie exposée et ses contraintes, Kornberg fut capable de trouver quelque radioactivité dans des fractions acido-précipitables. Radioactivité qui, à l'époque ne dépassait guère le seuil de confiance des compteurs, mais Kornberg y croyait !


Plusieurs équipes, partant de kilogrammes de pâte d'E.coli, à l'aide de méthodes d'analyse biochimique classiques de nos jours mais que l'on découvrait à l'époque, ont peu à peu concentré l'activité de l'ADN polymérase jusqu'à purifier cette enzyme qui fut nommée "polymérase de Kornberg".

Le bilan (provisoire) de ces expériences est le suivant :

Replication in vitro

L'expérience décrite ci dessus prouve qu'une synthèse de polydésoxyribonucléotide est réalisable in vitro mais ne prouve pas que l'ADN synthétisé est conforme au modèle ni que la synthèse soit une réplication semi-conservative.
La suite du travail va consister à tenter la synthèse in vitro d'un ADN "biologiquement actif", l'activité biologique la plus facile à détecter étant, à l'époque, la capacité d'infection d'un ADN de bactériophage.

Le modèle choisi est le phage ÞX 174 soit une molécule circulaire d'environ 5000 nucléotides seulement. Nucléotides et non pas paires de nucléotides car il s'agit, pour la particule phagique d'un ADN simple brin que nous appellerons le brin +. Le changement d'un seul de ces nucléotides rend la molécule inactive (non infectieuse). La réalisation d'une copie infectieuse in vitro va préfigurer la technologie de l'ADN recombinant.

  • - In vivo, la première étape de l'infection par ce bactériophage simple brin est la synthèse d'un brin complémentaire pour réaliser une forme circulaire double brin à partir de laquelle seront reproduits des brins + qui assureront la descendance phagique.

  • - Un premier problème se posa pour la synthèse in vitro d'un brin - : l'ADN polymérase purifiée ne peut qu'attacher l'extrémité 5' d'un nucléotide à l'extrémité 3' d'une chaîne en cours de synthèse, elle ne peut relier des polynucléotides et donc ne peut pas réaliser la liaison phosphodiester qui permet de circulariser un brin d'ADN. Le problème a été résolu par la purification d'une enzyme qui, in vivo, remplit cette fonction : l'ADN ligase dont nous aurons souvent l'occasion de parler.

  • Le système va donc comprendre :

  • des molécules d'ADN purifiées de ÞX 174 (brin +)

  • les 4 désoxyribonucléotides

  • l'ADN polymérase

  • la ligase

  • en principe, il doit assurer la synthèse de brins - complémentaires du brin plus et circulaires (Figure II.6 1 - 3).

  • - Deuxième problème : comment séparer les brins - des brins + ?

  • Ce deuxième problème a été surmonté par l'utilisation d'un précurseur particulier à la synthèse d'ADN : la 5-bromodésoxy uridine, cet analogue de nucléotide est utilisé par la cellule comme de la thymidine (sera apparié à l'adénine) mais le brome va "alourdir" la molécule d'ADN qui utilise ce précurseur. La différence de densitéest suffisante pour permettre la séparation de brins + (comportant de la thymidine) de brins - (comportant de la bromodésoxyuridine) par ultracentrifugation sur un gradient de densité de CsCl (Figure II.6 4 et 5).

  • - Troisième problème : le brin - synthétisé in vitro n'est pas infectieux, seul un brin + peut l'être. Il va donc falloir recommencer une synthèse in vitro en utilisant les brins - comme modèles.

Cette stratégie a permis de synthétiser des molécules qui vont s'avérer infectieuses : aucune erreur sur 5000 nucléotides assemblés in vitro !

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