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Octobre 2004 n°222

Une version plus complète de ce bulletin est accessible sur le site de l'INRA www.inra.fr. sous son nom dans : Information Scientifique et Technique puis Publications INRA en ligne.

Le signe ### dans cette version papier indique quelques développements supplémentaires ou des commentaires additionnels consultables dans la version électronique. André BERKALOFF

e-mail : andre.berkaloff@igmors.u-psud.fr
Concepts et Techniques

1. La chronologie de l'assemblage du fuseau au sein du cycle cellulaire est critique, si on veut que tout se passe bien.

Les microtubules du fuseau polymérisent à partir d'amorces situées aux pôles (centrosomes des cellules animales, par exemple). Les sous-unités de tubulines sont ajoutées à l'extrémité (+) qui est celle qui s'allonge. Au passage, certains de ces microtubules capturent une paire de chromatides disposées symétriquement par rapport aux pôles. La "colle" des cohésines qui associe les chromatides est alors détruite, et les chromatides migrent en sens opposé. (voir le §2)

On a une interdigitation des microtubules qui n'ont pas pas réussi à harponner de chromatides et présentant une orientation opposée au niveau du fuseau central. C'est à ce niveau que va avoir lieu la cytodiérèse séparant les deux cellules-filles; Cette interdigitation est assurée par le complexe à deux protéines centralspindlin. L'une de ces protéines fait partie de la famille de porotéines motrices appelées kinésines. Ce sont des dimères avec deux têtes en sens opposés qui sont capables de capturer les microtubules et de crapahuter le long de ceux-ci (grâce à une hydrolyse de l'ATP). Elle est dénommée ZEN-4 chez C.elegans et MKLP1 chez l'homme. L'autre est une protéine de signalisation de la famille Rho. On vient de montrer que c'est par une déphosphorylation que le complexe ne s'assemble qu'à l'anaphase. La phosphorylation du complexe empêche l'assemblage du fuseau central, la déphosphorylation l'autorise. Elle a lieu au niveau du cou de la protéine et ne peut avoir lieu qu'en l'absence de Cdk1–cycline B, ce qui synchronise le processus avec le déroulement du cycle.

La phosphatase CDC14 déphosphoryle ZEN-4/MKLP et permet la formation du fuseau central. M Mishima et al.; Nature 430 (19AUG04) 908-913. Voir également le commentaire de B Bowerman; p.840-842.

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2. Les cohésines constituent la "colle" maintenant les chromatides sœurs associées jusqu'à l'anaphase. C'est la séparase qui s'en charge, mais il faut, pour celà que son inhibiteur associé, la sécurine soit dégradé (la protéine porte d'ailleurs des marqueurs de destruction préétablis).

On vient de montrer que ces ciseaux moléculaires interviennent dans une autre circonstances: lors de la réparation de l'ADN à l'interphase, . Il faut, en effet, que la cohésine soit éliminée pour que la réparation puisse avoir lieu. K Nagao et al.; Nature 430 (26AUG04) 1044-1048.

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3. MN Stojanovic et al.; Journal of the American. Chemical Society 126 (04AUG04) 9266–9270 décrivent le montage de capteurs devenant fluorescents lorsqu'ils rencontrent et fixe une cible prédéterminée. Ils utilisent des d'équivalents nucléïques des protéines fluorescentes (verte pour la GFP au départ) bien connues. Ces marqueurs sont usuellement basés sur des aptamères comportant la GFP couplée à une séquence nucléotidique. Ici c'est la recherche de n'importe quelle petite molécules qui est recherchée. L'aptamère fait également intervenir un petit ARN qui est un capteur qui est couplée au vert malachite non fluorescent par lui-même, mais qui le devient quand il est rigidifié. Pour obtenir cet effet, un second aptamère est utilisé qui reconnait un substrat préétabli. Ce dernier assure la configuration active du système. Il existe des tas de système de détection, mais il doivent être introduit dans la cellule au grand risque de tout perturber. Comme les ARNs des deux aptamères, ils peuvent être codés par la cellule. C'est un système à module comme pour l'immunodétection indirecte et il est donc polyvalent. Le système marche avec des aptamères connus comme ceux reconnaissant ATP, théophylline ou flavine mononucléotide, mais doit certainement être amélioré. Voir le commentaire de M Famulok; p.976-977.

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4. On trouvera dans VL Chandler et al.; Nature Reviews Genetics 5 (AUG04) 532-544, une revue sur les paramutations. Celles-ci sont des mécanismes épigénétiques découverts, il y a une cinquantaine d'années chez les plantes, où deux allèles précis provoquent une expression héréditaire de l'un d'entre eux, sans modification des séquences. Ceci a été surtout étudié chez le maïs.

Ceci peut avoir lieu dans de nombreuses situations où, par exemple, entre transgènes et gènes autochtones homologues, allélique ou pas. Ce sont des manifestations homologie-dépendantes qui entraînent une modification de la structure chromatinienne.

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5. On trouvera dans LS Kaguni; Annual Review of Biochemistry 73 (JUL04) 293-320, une revue sur l'ADN polymérase mitochondriale. C'est la seule présente dans la mitochondrie et elle est donc également responsable des vérifications, réparations et recombinaisons. Pol est un hétérodimère associé à une sous-unité accessoire. La revue analyse ses fonctions.

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6. Alors que l'élucidation du code universel de l'ADN a permis de lancer la biologie moléculaire, on n'en connaît pas tout. On vient de caractériser une tARN synthétase supplémentaire (il y une tARN synthétase pour chaque acide aminé, et c'est sur ces enzymes adaptatrices que repose la spécificité du codage) permettant de coder un acide aminé naturel inusuel; la pyrrolysine (pLys) SK Blight et al. Nature 431 (16SEP04) 333–335. On la retrouve dans certaines des méthyltransférases corrinoïde-dépendantes des archées où elles jouent un rôle dans le transfert de méthyles lors de la méthanogenèse à partir de la triméthylamine, diméthylamine ou monométhylamine (voir JA Krzycki; Current Opinion in Chemical Biology 8 (OCT04) 484-491).

La pyrrolysine est une lysine dont le NH2 en position est remplacé par une cycle pyrroline.

On sait qu'il existe trois codons stop, UAA, UAG et UGA, et comme c'est un luxe, on a pensé utiliser les moins fréquents des trois pour lui faire coder autre chose (source de mutations systématiques) en modifiant l'extrémité anticodon des aminoacyl tARN synthétases existantes. Mais la nature a déjà utilisé l'astuce. Dans le cas, naturel, de la sélénocystéine, c'est UGA qui est utilisé. Ici c'est le codon UAG qui est utilisé. Ces auteurs montrent, in vitro comme in vivo, cette capacité (ce que C Polycarpo et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101, 12450–12454 (2004) avaient montré in vitro au début de l'année.

De plus Blight et al. ont montré que le système marche chez une Escherichia coli exprimant le gène d'une méthyltransférase d'une archée, Methanosarcina barkeri, et celui du tARNpLys et que la pyrrolysine est bien incorporée au bon endroit quand on la fournit dans le milieu, bien qu'E.coli ne possède, naturellement, aucun des deux gènes et n'utilise donc pas la pyrrolysine.

L'efficacité d'incorporation est bien meilleure (75%) que dans toutes les tentatives humaines pour utiliser UAG comme codon codant (jamais plus de 20%, ce qui est d'ailleurs suffisant pour certains usages).

Le fait que, dans ces conditions la pyrrolysine ne soit pas létale indique quand même une certaine spécificité bien que les auteurs n'aient pas vérifié l'insertion dans d'autres protéines que la méthyltransférase hétérologue archéenne.

Dans le cas de la sélénocystéine, il y a modification de la cystéine quand elle est captée par un tARN spécial qui reconnaît UAG dans un contexte conformationnel spécial du messager au voisinage de ce codon. Il est alors reconnu par un facteur d'élongation de la traduction particulier, SelB qui se lie au tARNpLys chargé et reconnaît, par ailleurs, une boucle de l'ARN qui lui indique grossièrement où se situe l'UGA destinataire. Il semble qu'il en soit de même dans le cas de la pyrrolysine et de la méthyltransférase utilisée. Il y aurait donc, chez E.coli, des éléments SeB-like.

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7. L'ADN polymérase est la seule ADN polymérase mitochondriale jusqu'à nouvel ordre, et elle doit donc tout faire: réplication, vérification, réparation recombinaison (même si on admettait jusqu'il n'y a pas si longtemps que réparation et recombinaisons étaient absentes des mitochondries animales). C'est un complexe hétérodimérique avec une sous-unité catalytique associée à une autre sous-unité (accessoire dit-on?). La revue de LS Kaguni; Annual Review of Biochemistry 73 (JUL04) 293-320 lui est consacrée.

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8. La variabilité génétique d'une espèce dépend d'éléments génétiques de fond, on peut en convenir, et géographiques correspondant à une pression de sélection opérant sur une base constituée de variants neutres (au sens de Kimura 1983). Une revue est consacrée aux aspects géographiques (B Charlesworth et al.; Annual Review of Ecology, Evolution & Systematics 34 (NOV03) 99-125). Les auteurs focalisent leur attention sur les modèles de migration qui entraînent un écart par rapport à une situation stable. Les auteurs décrivent les effets de différents types de structures, traitant simultanément des aspects démographiques géographiques et génétiques en parallèle, et en examinant leurs effets conjoints.

Ils utilisent, évidemment, l'accumulation rapide des données sur les variations dans les séquences (microsatellites et SNPs ou single nucleotide polymorphisms) qui, au départ, peuvent être considérées comme neutres, la sélection subséquente ne l'étant pas. Le problème est de savoir quelle sélection est alors en jeu, ce qui n'est pas simple à déterminer.

Il y a toujours un danger à construire des scénarios compatibles avec ce que l'on observe problème de tous les modèles empiriques), sans se préoccuper d'explications alternatives. L'exploitation des méthodes statistiques est également dangereuse, dans la mesure où elle dépend terriblement des hypothèses de départ.

La lecture de cette revue est intéressante mais il faut "se cramponner" un peu pour suivre les auteurs.

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9. L'utilisation des siRNAs synthétiques dans des cellules en culture, démontrée en 2001, se généralise (même si cela est moins glorieux, in vivo dans les organismes). En fait, les siRNAs ont bénéficié des années de recherches sur l'utilisation des oligonucléotides antisens. C'est le cas pour la capture et l'incorporation des acides nucléiques par les cellules et de la conception de témoins solides permettant de convaincre de l'efficacité de la modulation de l'expression génique. Mais la nature double-brin des siRNAs pose quand même des problèmes qu'il faudra bien résoudre. Z Paroo et al.; Trends in Biotechnology 22 (AUG04) 390-394 discutent l'état de l'art dans ce domaine.

L'un des problèmes majeurs est le conflit actuel spécificité/efficacité, voir §. Les seuls exemples prouvés d'inactivation de gènes autochtones de cette technique in vivo l'ont été sur le foie, bien que la co-injection d'un plasmide codant une protéine marqueur et de siRNAs correspondants ait donné une réponse dans d'autres organes. Les auteurs ont suivi le sort d'un siRNA injecté pour voir ce qui se passe. Ils confirment beaucoup de données acquises avec les antisens qui posent les mêmes problèmes. En ce qui concerne les vecteurs plusieurs solutions sont possibles car les duplex de siRNAs sont plus stables que les antisens monobrins et des modifications chimiques, comme celles du ribose, peuvent l'augmenter comme pour les antisens et, parfois, éliminer certains effets non souhaités.

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10. La protéine DDP1 de Drosophila melanogaster est très conservée chez de nombreux organismes comme les protéines Scp160p de la levure et la vigiline humaine, comportant 15 répétitions en tandem du domaine KH. Le domaine KH a été caractérisé, pour la première fois chez la protéine K humaine qui est une hnRNP (heterogeneous nuclear RiboNucleoProtein) d'où son noim de domaiine KH (K Homology). Il est très fréquemment organisé en répétitions en tandem. Ce domaine est associé à une reconnaissance des acides nucléiques simple brin comme les ARNs et les ssDNAs.

DDP1 est observée dans l'hétérochromatine des chromocentres (régions condensées) des chromosomes polytènes et joue probablement un rôle dans sa formation en association avec HP1. C'est ce que confirment D Huertas et al.; Current Biology 14 (21SEP04) 1611-1620 et ils ajoutent que cette protéine contribue au mutisme des centromères et intervient dans la ségrégation des chromosomes.

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11. Une revue sur le biais des codons selon les organismes de C Gustasson et al.; Trends in Biotechnology 22 (JUL04) 345-353 est parue.

L'expression des protéines est souvent rendue difficile hors de leur hôte d'origine par des difficulté de codage dues à la multiplicité fréquente des codons possibles pour un acide aminé (ce que l'appelle dégénérescence du code, 61 codons pour 22 acides aminés, avec un codon unique pour la méthionine et le tryptophane, et six différents pour arginine, leucine et sérine), et donc dépend de la présence, en quantités suffisantes, des tARNs et tARN synthétases adaptés. On peut donc penser à modifier le codage des acides aminés plutôt qu'à importer tout le bataclan pour faire comprendre à la cellule ce que l'on souhaite lors de la traduction. On a cependant introduit des gènes codant des tARNs rares et des souches ainsi modifiées sont disponibles dans le commerce.

On constate une sensibilité particulière à la présence de codons rares, surtout au début de la séquence codante et on peut donc être conduit à modifier les codons gênants, voir synthétiser complètement un gène .

En 1997 les chercheurs de Genentech avaient complètement construit le gène de la somatostatine humaine pour une lecture par une bactérie plutôt que de cloner le gène humain. C'était d'autant plus indiqué qu'il suffisait de 14 codons. C'était, à l'époque une situation encore difficile car on ne disposait pas encore du génome d'E.coli pour se faire une idée de l'ampleur du biais éventuel. Astucieusement, les chercheurs ont donc utilisé les habitudes du phage MS2 qui connaît E.coli depuis longtemps et a donc largement exploité ce biais pour en tirer parti. Ceci est devenu plus facile que reconstruire une séquence dans un langage adapté à la cellule de production et cela est devenue de moins en moins coûteux.

Cloner après amplification a paru plus facile qu'une synthèse complète d'un gène d'une certaine taille. Mais c'est sans compter les facéties des divers systèmes cellulaires quand aux codons utilisés et les pièges de la PCR. L'usage dans un même organisme peut être varié selon la protéine, son abondance et la prédiction du bon codon à utiliser est délicate. En effet, si on peut établir un catalogue des préférences en analysant tous les gènes exprimés sous forme de protéines (index des codons) on ne connaît pas la cause des préférences constatées.

Une question que l'on peut se poser est: pourquoi les organismes ont-ils recours à cette diversité des codons? On n'en sait trop rien, mais une des explications possible est que la réduction du nombre des tARNs isoaccepteurs pour un même aminoacide évite le gaspillage métabolique chez un organisme d'une population en pleine croissance.

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12. Z Zhang et al.; Current Opinion in Genetics & Development 14 (AUG04) 328-335 s'intéressent aux très nombreux pseudogènes du génome humain. Ceux-ci sont généralement considérés comme des fossiles, résidus de gènes autrefois fonctionnels, mais qui n'ont plus eu de justification évolutive suffisante pour que leur maintien fonctionnel soit sélectionné. Ils ont, en général perdu leurs promoteurs, subit des altérations qui s'accumulent, ce qui fait que quand ils récupèrent un promoteur ils ne donnent plus de messagers traductibles. Ils compliquent, dans une certaine mesure, les annotations des génomes, car leur séquence peut tromper et contamine les bases de données génomiques.

Toutes les anomalies permettent d'identifier ces pseudogènes et c'est l'exploitation de ces caractéristiques qui est décrite dans la revue.

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