Bulletin des BioTechnologies Septembre 2002








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Les Productions Microbiennes


81. Le pilotage des flux au sein d'une bactérie est une tâche ardue. En effet, une surproduction souhaitée par l'homme n'a pas été sélectionnée par l'évolution. On travaille usuellement du côté alimentation en intermédiaires, mais sans trop essayer de piloter la demande. La cellule maintient les flux constants, et tout est orienté dans ce sens. Des chercheurs de Lyngby montrent que l'on peut piloter la glycolyse en manipulant la demande en ATP par hydrolyse grâce à la surexpression de la partie F1 de la proton-ATPase F1F0 membranaire, ce qui la libère. On augmente le flux de la glycolyse, avec seulement une faible diminution de la croissance des populations d'E.coli. Ceci explique que les essais antérieurs de surexpression des enzymes de cette voie aient été infructueux, la commande du flux ne résidant pas dans la glycolyse elle-même, mais à partir d'un capteur extérieur, la quantité d'ATP. Côté croissance, c'est l'anabolisme qui est limitant, les synthèses étant limité par les ressources carbonées. Le flux accru dans la glycolyse se traduit par un accroissement dela production du pyruvate (en fait d'acétate) BJ Koebmann et al.; Journal of Bacteriology 184,n°14 (JUL02) 3909-3916. Voir également le commentaire de S Oliver; Nature 418 (04JUL02) 33-34.

Cette technique a été utilisée, en liaison avec Christian Hansen, chez Lactococcus lactis pour montrer que le découplage de la glycolyse (augmentée) et de la croissance explique la baisse de cette dernière. BJ Koebmann et al.; Applied & Environmental Microbiology 68 (SEP02) 4274-4282.

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82. On trouvera dans RD Hancock et al.; Trends in Biotechnology 20 (JUL02) 299-305, une revue sur la bioproduction d'acide ascorbique (la vitamine C) à la place du procédé Reichstein de synthèse chimique à partir du glucose et en sept étapes, qui est très largement utilisé actuellement pour une production annuelle mondiale de 80 000 tonnes, en croissance de 3-4% par an. Le procédé Reichstein (résumé dans un schéma clair) est relativement efficace (rendement de 50%) après plus de 60 ans de développements continus, mais consomme beaucoup d'énergie, dégagent des effluents ennuyeux car on utilise acétone, acides sulfurique et chlorhydrique ainsi que la soude. Un quart de la production est utilisé dans les aliments et 15% dans les boissons, tandis que 10% sont consommés dans les aliments pour animaux, bien que ces derniers, sauf les salmonidés, soient capables d'en produire.

Les premières tentatives ont consisté à fournir des intermédiaires du procédé Reichstein par voie biologique. Les techniques commerciales les plus avancées sont l'oxydation du D-glucose en 2-céto-L-gulonate (2-KLG, qui est la dernière étape avant l'acide ascorbique obtenu par estérification et lactonisation) via le D-gluconate, le 2-céto-D-gluconate et le 2,5-dicéto-D-gluconate (voie du 2,5-DKG) ou l'oxydation du D-sorbitol produit par hydrogénation du D-glucose, ou du L-sorbose dérivant du sorbitol en 2-KLG (voie du sorbitol) via la L-sorbosone. La phase finale qui consiste en une estérification et en une lactonisation est effectuée chimiquement. On ne possède pas de souches réalisant la totalité de la séquence. On a donc commencé par utiliser des fermentations mixtes ou successives, mais l'ingéniérie génétique a rendu ces approches désuètes.

La voie du sorbitol a été améliorée. Gluconobacter oxydans est un bactérie de choix pour cela, mais elle a un défaut majeur : les trois déshydrogénases nécessaires ne sont pas localisées au même endroit dans les différentes souches. Ainsi la souche OX4 de G.oxydans, présente bien des sorbitol et sorbose déshydrogénases membranaires, mais une sorbosone déshydrogénase cytosolique. Or quand elles sont cytoplasmiques, des réductases cytosoliques envoyent le sorbitol vers la voie des pentoses, et pas là où on le souhaite. On les a donc ciblées vers la membrane, qu'elles proviennent de Gluconobacter ou d'autres bactéries comme des Acetobacter IFO 12258 qui peut fournir une sorbosone déshydrogénase membranaire. Des transplantations de déshydrogénases entre souches de Gluconobacter oxydans ont été décrites.

Enfin une voie périplasmique du sorbose faisant intervenir une L-sorbose/L-sorbosone déshydrogénase bifonctionnelle vient d'être décrite.

Des procédés en continu, tous basés sur la voie du 2-KLG, ont été développés indépendamment par des groupes chinois et américains. Un consortium mené par Genencor International avec Eastman Chemical, Argonne National Laboratory, Electrosynthesis Company et MicroGenomics a mutagénisé Pantoea citrea pour inactiver la glucose déshydrogénase membranaire, et perméabilisé les cellules avec un solvant organique. Ces cellules constituent une source des deux activités enzymatiques menant du D-gluconate au 2,5-DKG. Moyennant un pilotage de la réaction, on arrive à une conversion à 100% du glucose, sans perte d'activité des deux enzymes pendant la durée de l'expérience (18 heures). Les chinois utilisent une souche de G.oxydans en phase stationnaire comme source de D-gluconate et de 2-céto-D-gluconate déshydrogénase. Le rendement en 2-KLG à partir du glucose n'est pas merveilleux avec 16,8%.

La phase finale de la conversion du 2-KLG en acide ascorbique est un peu scabreuse, car elle comporte plusieurs étapes où on fait intervenir de l'acide chlorhydrique gazeux. Il faut ensuite une purification très poussée du produit.

Des hydrolases diverses ont été essayées et des lactonases de Zymomonas mobilis, Escherichia coli et Fusarium oxysporum sont capables de convertir le 2-KLG en acide ascorbique mais l'efficacité du procédé reste à démontrer. Deux levures, Candida blankii et Cryptococcus dimennae sont capables d'une conversion directe, mais le rendement est ridicule, probablement à cause du fait qu'elles sont capable d'utiliser l'acide ascorbique comme substrat de croissance.

La production en fermenteur et à partir de glucose par l'algue verte unicellulaire Chlorella pyrenoidosa est décrite dans l'US Patent n°5 521 090 du 28 Mai 1996 de Bio-Technical Resources où la production reste intracellulaire, la biomasse pouvant être utilisée dans les aliments pour bétail. Une production extracellulaire par Prototheca, une Chlorococcale voisine de Chlorella, mais incolore et acidophile, est décrite dans l'US Patent n°5 900 370 du 4 Mai 1999 octroyé à la même firme. Aucun des deux procédés n'a donné lieu à une utilisation concrète.

La voie de synthèse chez les plantes vient d'être récemment élucidée, et ouvre des voies nouvelles pour une bioproduction dans des hôtes alternatifs qui est également étudiée par Bio-Technical Resources.

La voie des plantes comporte 10 étapes et fait intervenir un sucre rare, le L-galactose, dont la production devrait être facilitée par le clonage du gène de la GDP-mannose-3,5-épimérase. Là aussi la manipulation des enzymes de la voie n'a pas donné grand chose (mais voir le §81). Le seul succès notable a fait intervenir l'expression d'une L-gulono-1,4-lactone oxydase de rat (dernière étape de la synthèse chez les animaux) chez la laitue qui a permis un accroissement de sept fois de la production. On peut également essayer une production chez les levures.

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83. La production annuelle mondiale de glycérol tourne autour de 600 000 tonnes. Elle est possible de trois façons : la récupération du glycérol sous-produit des industries des oléagineux (la production du savon laisse 10-15% de glycérol dans les eaux usées), des synthèses diverses à partir du propylène et la bioproduction.

On trouvera une revue sur la bioproduction de glycérol par des équipes suédoises dans MJ Taherzadeh et al.; Enzyme and Microbial Technology 31 (JUL02) 53–66. Elle analyse les bases métaboliques de cette production.

L'essentiel de la bioproduction est réalisé par Saccharomyces cerevisiae, mais elle est possible chez d'autres levures et d'autres microorganismes. On a tenté de nombreuses façons d'améliorer cette production. Les premières méthodes ont été basées sur une régulation physiologique (comme le piégeage du NADH par addition de bisulfite), l'ingéniérie de la voie glycolytique (voir le §81), en modulant, par exemple, la triose phosphate isomérase, la phosphoglycérate mutase ou l'alcool déshydrogénase, ou l'intervention directe sur la voie du glycérol (G3P déshydrogénase) ont été tentées. Les stratégies utilisées ont été la désactivation ou la répression de l'oxydation du NADH autres que la G3P déshydrogénase, l'accroissement de la production de NADH ou la redirection du flux de carbone vers le glycérol.

KM Overkamp et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (JUN02) 2814-2821 montrent que l'on peut utiliser la suppression de la triose phosphate isomérase TPI1 de Saccharomyces cerevisiae qui empêche la croissance sur glucose (c'est l'enzyme qui permet d'utiliser les deux moitiés d'un glucose, l'une sous la forme de dihydroxyacétone phosphate et l'autre sous celle de glycéraldéhyde-3-phosphate. De ces deux moitiés, l'une oxyde l'autre en anaérobiose au cours de la glycolyse. L'absence de l'interconversion est fâcheuse. Des mutants dépourvus d'un gène TPI1 fonctionnel sont soumis à cette difficulté. Ces mutants accumulent le dihydroxyacétone phosphate qu'on pourrait bien utiliser pour produire du glycérol. L'oxydation du glycéraldéhyde-3-phosphate par la G3P déshydrogénase réduit le NAD+ en NADH. On pourrait utiliser ce NADH pour réduire le dihydroxyacétone phosphate en glycérol. Encore faut-il que les mutants tpi1- ne gaspillent pas le NADH à autre chose, comme dans une réoxydation mitochondriale. Un groupe néerlando-germanique a donc décidé d'inactiver les enzymes pouvant être impliquée dans cette réoxydation non souhaitable : NDE1 et NDE2 codant des isoenzymes mitochondriales de NADH déshydrogénase, GUT2 impliquée dans les navettes du glycérol-3-phosphate. Le quadruple mutant peut, de nouveau, pousser sur glucose et produit du glycérol. Mais les fortes concentrations de glucose inhibent les enzymes respiratoires du fait que la dissimilation respiratoire du pyruvate est indispensable à la synthèse d'ATP. Une sélection sur fortes concentrations de glucose a permis d'isoler un mutant qui convertit complètement le glucose en glycérol.

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