Résumé IL est crucial de développer des outils pour identifier les champignons mycorhiziens formant des symbioses avec les racines des plantes.








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AGROCAMPUS OUEST CENTRE ANGERS, Ingénieur en Horticulture (4ème année) 2009-2010


Vérification de la spécificité d’amorces de PCR du gène

mitochondrial Nad1 pour la détection et l’identification

de champignons mycorhiziens arbusculaires (MA)

Runfola Gabriel, Rim Ben Haj Sassi et Marc Saint-Arnaud








Maître de stage : Marc Saint-Arnaud Responsable des stages : Alain MEVEL

Encadrante : Rim Ben Haj Sassi Tuteur de stage : M.H MACHEREL





Institut de Recherche en Biologie Végétale, Montréal, Canada Remis le /10/2010

Remerciements
Je souhaite remercier le Professeur Marc Saint Arnaud, pour m’avoir accueilli au sein de son équipe de recherche, mais aussi pour m’avoir proposé ce stage et avoir su répondre à mes questions.

Je souhaite aussi remercier Rim Ben Haj Sassi (étudiant en doctorat) pour sa collaboration sur le sujet de stage ainsi que Maryam Nadimi (doctorante) pour son aide et ses réponses à mes différentes questions.
Je remercie enfin tout le personnel de l’Institut de Recherche en Biologie Végétale de Montréal pour son accueil et sa gentillesse.

Résumé
Il est crucial de développer des outils pour identifier les champignons mycorhiziens formant des symbioses avec les racines des plantes. Des amorces optimales pour la PCR ont été choisies  dans les zones conservées  du genre Glomus (gène mitochondrial Nad1), puis alignées en utilisant les programmes Amplifx, Méga4 et Primer Test. Des expériences de PCR sur des isolats de champignons (mycorhiziens ou non) ont permis de vérifier et de montrer la spécificité de ces amorces afin de détecter les champignons du genre Glomus. Cependant, les conditions de PCR restent à optimiser afin d’améliorer la visualisation des bandes d’ADN amplifié.
Abstract
It is crucial to develop tools to identify mycorrhizae in symbioses with plant roots. Optimal onsets for the PCR were chosen from zones preferred by Glomus species (mitochondrial gene Nad1), then aligned by using Amplifx, Méga4 and Primer Test programs. PCR experiments on fungus isolates (mycorrhizal or not) allowed verification to take place and  showed the specificity of these onsets to detect Glomus fungi. However, the PCR conditions need to be optimised in order to improve the visualisation of the amplified DNA strips.

Mots-clés : champignons MA, spécificité, amorce, gène Nad1, PCR, détection, identification.

Liste des abréviations
ADN : acide désoxyribonucléique

ADNg : ADN génomique

ARNr : acide ribonucléique ribosomique

BET : Bromure d’éthidium

champignons MA : champignons Mycorhiziens Arbusculaires

champignons MVA : champignons mycorhiziens à Vésicules et Arbuscules

DGGE : Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (électrophorèse sur gel en gradient dénaturant)

dNTP : désoxynucleotide tri-phosphate (dATP, dTTP, dGTP et dCTP)

IRBV : Institut de Recherche en Biologie Végétale

ITS : Séquence Interne Transcrite

mtLSU : Large Subunit mitochondrial (grand sous unité mitochondriale)

Nad1 : Nicotinamide adenine dinucleotide 1

NCBI : National Center for Biotechnology Information

NuoH, NQO8, NdhA, ND1 : homologue de Nad1

PCR : Polymerase Chain Reaction (Amplification en chaîne par polymérase)

PDA : Potato Dextrose Agar

Primer Test : Test d’amorce

Q-PCR : PCR Quantitative (PCR en temps réel)

SSU : Small Subunit (petite sous unité)

Ta : annealing temperature (Température d’hybridation)

Tm : melting temperature (Température de fusion ou de dénaturation)

UV : Ultraviolet

Listes des tableaux et des figures

Tableau 1 : Les amorces utilisées lors du stage 
Tableau 2 : Les espèces et isolats de champignons MA utilisées lors du stage
Tableau 3 : Les espèces et souches des autres champignons utilisées lors du stage
Tableau 4 : Mélange réactionnel utilisé pour la PCR des isolats de champignons MA
Tableau 5 : Mélange réactionnel utilisé pour la PCR des extraits d’ADN des autres organismes
Tableau 6 : Vérification des amorces sens et inverse 1 et 2 sur Amplifx pour connaitre leur qualité.
Figure 1 : Programme PCR cycle 1 utilisé lors de l’amplification des isolats de champignons MA
Figure 2 : Programme PCR cycle 2 utilisé lors de l’amplification des extraits d’ADN des autres organismes
Figure 3 : Alignement multiple des séquences sur Mega4 montrant les régions spécifiques des trois amorces sens 1, inverse 1 et inverse 2 du gène mitochondrial Nad1
Figure 4 : Électrophorèse sur gel d’agarose (1) montrant les produits de PCR avec les amorces sens 1 et inverse 1
Figure 5 : Électrophorèse sur gel d’agarose montrant les produits de PCR avec les amorces sens 1 et inverse 1 des autres organismes
Liste des annexes :
Annexe 1 : Tableau des séquences trouvées sur NCBI ou dans la collection de l’IRBV
Sommaire
Remerciement

Résumé/Abstract

Avantages de cette symbiose 1

I. Matériels et Méthodes 4

Espèces et souches de champignons mycorhiziens arbusculaires (MA) utilisées 5

Espèces et souches des autres champignons et des bactéries utilisées, et mise en culture de ceux-ci sur milieu PDA (Potato Dextrose Agar) 5

II. Résultats 7

III. Discussion et Perspectives 10

Börstler, B. ; Raab, P.A. ; Thiéry, O. ; Morton, J.B. & Redecker, D. (2008) Genetic diversity of the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices as determined by mitochondrial large subunit rRNA gene sequences is considerably higher than previously expected. New Phytologist 180: 452–465. 12

Ekblad, A. ; Wallander, H. & Näsholm, T. (1998) Chitin and ergosterol combined to measure total and living biomass in ectomycorrhizae. New Phytologist 13: 143–149. 12

Lang, F.B. and M. Hijri. (2009) The complete Glomus intraradices mitochondrial genome sequence, a milestone in mycorrhizal research. New Phytologist 183: 3-6. 13

Petersen, C. A. ; Valentine, L. L. ; Fiedler, T. L. ; Hart, A. N. ; Berninghausen, H. K. & Southworth D. (2004) Diversity of ectomycorrhizas associated with Quercus garryana in southern Oregon. Can. J. Bot. 82:123-135. 13






Introduction


Définition des champignons mycorhiziens à arbuscules (MA)
Les champignons mycorhiziens à arbuscules (MA), connus aussi sous le nom de champignons mycorhiziens à vésicules et arbuscules (MVA) qui encore souvent utilisé par quelques auteurs (Smith and Read 1997), sont des organismes du sol que l’on retrouve dans tous les habitats de la planète. Ils font partis du phylum des Glomeromycota et sont présumés être d’anciens champignons asexués. Les plus anciens fossiles datent d’au moins 455 millions d’années (Redecker et al., 2000). Bien que certaines variations structurelles existent dans cette catégorie, la plupart des champignons mycorhiziens arbusculaires sont caractérisés par la présence d'hyphes intraradiculaires (localisation intercellulaire ou intracellulaire), d'arbuscules (hyphes ramifiés fins impliqués dans l’échange des nutriments), de mycélium extraradiculaire (hyphes reliant les racines au sol), et des spores formés dans le mycélium extraradiculaire (Peterson et al., 2004). Certaines espèces fongiques forment aussi des structures intraradiculaires faisant références aux vésicules (portions d’hyphes hypertrophiées qui se remplissent de substances ou corps lipidiques), donnant à ce groupe son nom original de champignons mycorhiziens à vésicules et arbuscules (Smith and Read 1997). Ces champignons sont également appelé endomycorhiziens car ils pénètrent à l’intérieur des cellules du cortex racinaire de la plante hôte, contrairement aux champignons ectomycorhiziens où le champignon forme un manteau entourant les racines et dont certains hyphes pénètrent dans la racine et prolifèrent entre les cellules corticales (Smith and Read 1997).
Symbiose mycorhizienne et espèces de plantes impliquées
La symbiose mycorhizienne (appelée aussi mycorhize) est une association mutualiste entre les racines de la plupart des plantes vasculaires et ce groupe de champignon faisant parti du nouveau phylum des Glomeromycota (Schüssler et al., 2001). Les champignons mycorhiziens à arbuscules (MA) ont été identifiés dans un large spectre de plantes incluant la majorité des familles angiospermes, mais aussi certaines plantes non vasculaires, des fougères, des plantes vasculaires sans graines, des groupes faisant partis des gymnospermes comme certains conifères (par exemple le Sequoia ou le Thuja), le Ginkgo biloba et les cycas (Peterson et al., 2004). De nos jours, des études intensives ont démontrées que ces champignons existent dans la plupart des écosystèmes du monde et ont été découvert dans beaucoup d’espèces de cultures importantes comme par exemple le maїs, le riz, le coton, l’asperge, les arbres fruitiers mais aussi dans beaucoup d’espèces horticoles comme les roses, les pétunias ou les œillets (Strullu et al., 1991). Ils vivent donc en relation avec la plupart des plantes terrestres (de 60 a 90%) (Fortin et al., 2008; Smith and Read 1997).
Avantages de cette symbiose
Par ailleurs, cette symbiose aide à la plante à acquérir du phosphore et du nitrate, tout en contribuant à augmenter la résistance de la plante à certains pathogènes présents dans le sol notamment grâce à une production plus importantes d’enzymes (flavonoïdes…) et de protéines de résistance induites par les arbuscules (Volpin et al.1994; Harrier et Watson 2004; St-Arnaud and Vujanovic, 2007). De plus, il a été démontré que les champignons MA peuvent jouer un rôle dans l’augmentation et le maintient de la biodiversité des plantes (Van der Heijden et al., 1998). Enfin le mycélium, de très fine dimension, augmente considérablement le volume de sol exploité par les racines, améliorant ainsi leur nutrition en sel minéraux et l’accès à l’eau (Smith and Read 1997).
Détection et identification des champignons MA
L’identification et la compréhension de la biologie des champignons MA est nécessaire pour leur utilisation de façon intelligente en agriculture afin de réduire l’emploi des fertilisants chimiques et de protéger l’environnement (Beauregard et al., 2008). Au début des années 1970, l’observation, la détection et l’identification des champignons MA était basée sur des caractères morphologiques des spores (Dalpé, 1995). Les techniques étaient assez simple et l’identification d’hyphes, de spores, d’arbuscules, de vésicules et même de racines inoculées était réalisée à la loupe binoculaire et sans coloration seulement avec de l’eau distillée (Trappe and Gerdemann, 1979; Morton and Benny, 1990).

Puis ces techniques ont été considérablement améliorées grâce à l’utilisation de colorants comme le Blue de Trypan selon la méthode de Kormanik et McGraw (1982) (Karlinski et al., 2010). Celui-ci peut être mélangé soit avec du vinaigre (Vierheilig et al., 1998) ou du rouge neutre (Vierheilig et al., 2005). Enfin d’autres techniques de coloration ont été développées (avec du chlorazol black ou de l’acide fuchsine) pour l’identification des champignons MA sur des lames au microscope optique (Trappe and Gerdemann, 1979; Gange and Ayres, 1999; Vierheilig et al., 2005). Ce morphotypage a permis de décrire environ 200 espèces de champignons mycorhiziens arbusculaires (Walker and Trappe, 1993).
Cependant, les critères morphologiques (couleur, forme, épaisseur de la paroi, etc…) sont très limités, imprécis et nécessitent une grande expertise en microscopie et en cytologie. Ceci induit généralement de la confusion et mènent souvent à des identifications erronées (Koske, 1986). Par ailleurs, des auteurs ont supposés que le nombre de couches formant la paroi sporale dépendait de l’âge de la spore et de la méthode utilisée pour son extraction à partir du sol (Rosendahl, 2008). Par conséquent, plusieurs approches ont été développées afin de faciliter l’identification des différences significatives au niveau de l’espèce, de la population fongique et même par rapport à d’autres organismes (Giovannetti and Gianinazzi-Pearson, 1994). L’utilisation des microscopes électroniques à transmission et à balayage comme outil taxonomique a permis l’observation du processus biologique de la germination des spores, de l’ontogénie des parois (Maia et al., 1993), de l’architecture des composants des parois de la spore et de l’hyphe (Giovannetti and Gianinazzi-Pearson, 1994) mais aussi l’identification des arbuscules, spores, ou d’hyphes des champignons MA (Vierheilig et al., 2005). Des méthodes sensibles, telles que les techniques électrophorétiques, immunologiques, biochimiques ou sérologiques, utilisant des anticorps monoclonaux et polyclonaux ont permis la reconnaissance de différents symbiotes difficilement identifiables par leur morphologie (Giovannetti and Gianinazzi-Pearson, 1994) mais ont également permis de mettre en évidence une réponse spécifique chez les Glomaceae, différente de celle détectée chez les Gigasporaceae et les Acaulosporaceae grâce à l’utilisation de fluorochromes (Dalpé, 1995; Vierheilig et al., 2001; Vierheilig et al., 2005). D’autres auteurs ont permis de mieux définir et relier les taxa entre eux à l’intérieur de l’ordre des Glomales en utilisant les techniques de chromatographie HPLC, d’analyse en GC, d’ELISA, ou d’anticorps fluorescents (Simon et al., 1992; Schüßler et al., 2001; Schüßler et al., 2002). Ces techniques ont aussi permis à des auteurs d’observer et d’identifier la biomasse mycélienne dans le sol inoculé grâce à l’utilisation de biomarquers spécifiques comme l’ergostérol ou les acides gras phospholipides (Wallander, 1997; Ekblad et al., 1998). Malgré tous ces efforts, l’utilisation de ces techniques raffinées reste limitée puisqu’elles ne permettent pas bien d’identifier les espèces de champignons MA à partir d’autres espèces fongiques qui seraient mélangées aux champignons MA (Landeweert et al., 2001). De plus, elles ne permettent pas une application à grande échelle (Rosendahl et al., 1989).
Enfin avec le progrès de la biologie moléculaires, une alternative s’est présentée aux taxonomistes afin d’étudier de manière plus approfondie la variabilité génétique et les relations phylogénétiques au sein des Gloméromycota. Le développement de la biologie moléculaire a ainsi permis d’obtenir des marqueurs moléculaires spécifiques pour l’identification rapide des champignons MA dans le tissu de la plante hôte et dans le sol (Mullis and Falloona, 1987; Gardes et al., 1991; Henrion et al., 1992; Lanfranco et al., 2001; Renker et al., 2005; Redecker, 2002; Redecker et al., 2003). Ils sont devenus une technique très vite indispensable pour les taxonomistes (Lanfranco et al., 2001). Par exemple, des séquences transcrits internes (ITS) et des gènes de petites sous unités d’ARNr (SSU ARNr) ont été souvent utilisées pour l'identification et l’analyse phylogénétique des champignons MA (Sanders et al., 1995; Redecker, 2000). Cependant ceux-ci ont montrés une haute variabilité entre les copies de gènes, même à l’intérieur d’une même spore (Sanders et al., 1995; Lanfranco et al., 2001). De plus ces marqueurs peuvent conduire non seulement à des erreurs dans l'identification des espèces étroitement liées, mais complique aussi la différenciation entre les isolats d’une même espèce. Une analyse phylogénétique beaucoup plus récente basée sur les séquences nucléotidiques du gène 18S a montré que ces organismes possèdent une signature moléculaire et des caractéristiques morphologiques et écologiques différentes de celles des autres embranchements du règne fongique (Schüssler et al., 2001). Enfin, basées sur l’extraction totale de l’ADN du sol, d’autres techniques comme le DGGE (électrophorèse sur gel en gradient dénaturant), la PCR compétitive et les procédures de séquençage-clonage, ont été utilisées pour identifier du mycélium des champignons MA à partir du sol (Guidot et al., 2002; Landeweert et al., 2003).

Les données moléculaires ont changé considérablement la taxonomie des champignons MA, bien que la majorité des marqueurs moléculaires disponibles actuellement ne concernent que des gènes ribosomaux hautement polymorphes (Hijri et al., 1999). La structure multi génomique très particulière et unique chez ces champignons rend leur utilisation plus difficile et encore moins fiable (Kuhn et al., 2001; Hijri and Sanders, 2005). C’est pourquoi, l’hétérogénéité des séquences, rencontrée avec des gènes nucléaires, pourrait être évitée grâce à l'utilisation des gènes mitochondriaux (Börstler et al., 2008).
De ce fait, il semblerait que l’utilisation de gènes mitochondriaux pour l’identification moléculaire et la quantification des champignons MA serait meilleure que l’utilisation de gènes nucléaire (Croll et al., 2008; Lang and Hijri, 2009; Lee and Young, 2009). En effet, les gènes mitochondriaux seraient plus homogène que les gènes nucléaires (Croll et al., 2008; Lang and Hijri, 2009). Enfin des auteurs suggèrent que l’étude des séquences du gène codant pour la grande sous-unité mitochondriale (mtLSU) comprenant les gènes mitochondriaux Nad1 fournit des données permettant de distinguer des espèces de Glomus étroitement liées (Croll et al., 2008; Lang and Hijri, 2009; Lee and Young, 2009). A des fins d’identification moléculaire pour des espèces d’ectomycorhizes, une région du mtLSU a aussi été utilisée et les résultats ont montré qu'un grand nombre de données sont maintenant disponibles pour l'étude comparative (Bruns et al., 1998). Plus récemment, Raab et al. (2005) ont fourni les premières séquences du mtLSU des Glomeromycota et ont pu constater l'absence de variation substantielle dans cette région chez les espèces G. intraradices et G. proliferum.
Par ailleurs, l’ensemble de ces marqueurs moléculaires n’a pu être développé sans l’utilisation de la technique de PCR simple et ainsi que le développement d’amorces spécifiques (Mullis and Falloona, 1987; Gardes et al., 1991; Henrion et al., 1992; Simon et al., 1992; Lanfranco et al., 2001; Redecker, 2002; Redecker et al., 2003; Jaikoo et al., 2008). L’amplification par PCR dépend donc de la spécificité des amorces et durant ces dernières années différents auteurs ont essayer de concevoir des amorces spécifiques aux champignons MA (Simon et al., 1992; Helgason et al., 1999). Néanmoins, des études plus poussées ont révélées que ces amorces spécifiques, conçues ces dernières années, ne peuvent pas amplifier des séquences de la plupart des champignons MA qui ont été décrit plus récemment et qu’elles amplifient parfois des séquences d’autres organismes (Clapp et al., 1995, 1999 ; Helgason et al., 1999 ; Jaikoo et al., 2008). Les amorces de PCR pour les sous groupes ou certain taxon de champignons MA sont relativement facile à concevoir et ont été utilisées avec succès dans plusieurs études notamment pour la détection et l’identification de ces champignons (Sanders et al., 1995; Bago et al., 1998; Lanfranco et al., 1995; Kjøller & Rosendahl, 2000; Redecker, 2000; Gamper & Leuchtmann, 2007). Cependant de telles amorces n’ont pas été décrites et utilisées pour la quantification par Q-PCR de champignons MA jusqu'à présent. En effet, tout comme la PCR, la Q-PCR nécessite des amorces spécifiques aux séquences des organismes recherchées. Par ailleurs, la conception d’amorces est une technique souvent utilisée pour l’obtention de nouvelles séquences. De plus comme la phylogénie des groupes d’organismes est mieux comprise, il est plus facile de concevoir des amorces fiables (Jaikoo et al., 2008) qui pourront ainsi mieux distinguer les champignons MA des autres organismes du sol (Jaikoo et al., 2008) mais aussi mieux les quantifier par la suite.

Dans cette étude, nous allons décrire la conception et la vérification de la spécificité d’une série d'amorces de PCR du gène mitochondrial Nad1 pour la détection et l’identification de champignons mycorhiziens arbusculaires inoculés sur des plants d’Asperges. La spécificité des nouvelles amorces aux champignons MA à été testée en utilisant des extrait d’ADN génomique (ADNg) provenant de souches de champignons MA et contre testées en utilisant de l’ADN à partir de plusieurs autres organismes (champignons non AMF, bactéries, insectes, plantes…).




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