Apport du laboratoire de Biologie Clinique dans le diagnostic des allergies








titreApport du laboratoire de Biologie Clinique dans le diagnostic des allergies
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date de publication18.05.2017
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Fig. 3 : Schéma du protocole de dosage des IgEs du patient.
’Immuno CAP est un test in vitro complètement automatisé. Son principe est simple ; il consiste à faire réagir le sérum du patient avec des allergènes standards. Les IgE spécifiques de l’allergène le reconnaissent et s’y lient. Ensuite, des anticorps secondaires couplés à une enzyme sont ajoutés. Ils reconnaissent la fraction constante des IgE qui sont spécifiquement liées à l’allergène. L’étape suivante consiste à ajouter le substrat enzymatique. L’enzyme, couplé à l’anticorps lié, va transformer le substrat en produit mesurable12. La quantité de produit formé sera proportionnelle à la quantité d’IgE spécifiques présente dans le sérum.



b) Matériel utilisé :

Le kit de réactifs pour l’Immuno CAP 250 est fourni par Phadia doit être maintenu à 2-8°C. Il contient :

Le conjugué IgE spécifique : anticorps monoclonaux de souris anti IgE liés à la β-galactosidase : 1 μg/ml. Un flacon de 5.3 ml contenant de l’azide de sodium 0.06%. Prêt à l’emploi.

Les calibrateurs IgE spécifique: (pour la courbe de calibration) 5 strips d’IgE humaine en milieu tampon de différentes concentrations (0 ; 0.35 ; 0.7 ; 3.5 ; 17.5 ; 100 KU/L). Contenant du Kathon CG 0.15% et de l’albumine sérique bovine. Prêt à l’emploi.

Les curves contrôles : 5 strips d’IgE humaine en milieu tampon. Contenant du Kathon CG 0.15%. Prêt à l’emploi.

Les crayons calibrateurs IgE spécifique : Tubes de 16 immuno cap : IgE (monoclonaux de souris) anti IgE contenant du Kathon CG 0.15%. Prêt à l’emploi.

Solution de développement : 6 flacons (11ml) de 4-Méthylombélliféryl-β-D-galactoside 0.01% contenant du Kathon CG 0.05%. Prêt à l’emploi.

Solution stop : 6 flacons (120ml) de carbonate de sodium 4%. Prêt à l’emploi.

Solution de lavage




c) Interprétation des résultats :

P
Fig. 4 : Courbe de calibration pour le dosage des IgEs
our évaluer les résultats du test, les réponses obtenues pour les échantillons de patients sont converties en concentration par l’intermédiaire d’une courbe de calibration (Fig. 4). Les résultats sont donnés en KUA/l (Kilo Unité d’Allergène par litre). La limite de détection est de 0.01 KUA/l. Les résultats supérieurs à 0,10 KUA/l

sont considérés comme positifs.

2.3 Détermination des IgG4 spécifiques

2.3.1 Dosage des IgG4 spécifiques

La détermination des IgG4 spécifiques dans le sérum de chaque patient est réalisée par l’Immuno CAP 100 (Phadia, Uppsala, Suède).
a) Principe (Fig. 6) :

L’Immuno CAP est un test in vitro complètement automatisé. Il consiste à faire réagir le sérum du patient avec des allergènes standard. Les IgG4 spécifiques de l’allergène le reconnaissent et s’y lient. Ensuite, des anticorps secondaires couplés à une enzyme sont ajoutés. Ils reconnaissent la fraction constante des IgG4 qui est spécifiquement lié à l’allergène. L’étape suivante consiste à ajouter le substrat enzymatique. L’enzyme, couplé à l’anticorps lié, va transformer le substrat en produit mesurable13. La quantité de produit formé sera proportionnelle à la quantité d’IgG4 présente dans le sérum.


Fig. 6 : Schéma du protocole de dosage des IgG4s du patient.


b) Matériel utilisé :

b) Matériel utilisé :

Les crayons Gi3 pour doser les IgG4 spécifiques du venin de guêpe ainsi que le kit de réactifs pour l’Immuno CAP 100 sont fournis par la firme Phadia. Ils sont conservés à 2-8°C.

Le kit de réactifs contient :

Le diluant d’échantillon IgA/IgG4  spécifique: 5 flacons de 10 ml : solution tampon avec sérum de poulet contenant du Kathon CG 0.15%. Prêt à l’emploi.

Le conjugué IgG4  spécifique: anticorps monoclonaux de souris anti IgG4 liés à la β-galactosidase : 1.5 μg/ml. Un flacon de 2.8 ml contenant de l’azide de sodium 0.06% (et du BSA). Prêt à l’emploi.

Les calibrateurs IgG4 spécifique : (pour la courbe de calibration) 6 flacons de 0.2ml contenant des concentrations différentes d’IgG4 humaine en milieu tampon (0, 3, 15, 35, 35, 120 et 300 µg/l) contenant du Kathon CG 0.15%. Prêt à l’emploi.

Les crayons calibrateurs IgA/IgG4  spécifique : 1 tube de 16 immuno CAP de monoclonaux de souris contenant du Kathon CG 0.15%. Prêt à l’emploi.

Les curves contrôles 1 et 2 : 2x3flacons de 0.2ml contenant des IgG4 humaines en milieu tampon et du Kathon CG 0.15%. Prêt à l’emploi.

Solution de développement : 4-Méthyl-umbélliféryl-β-D-galactoside 0.01%. Quatre flacons (6ml) contenant du Kathon CG 0.05%. Prêt à l’emploi.

Solution stop : carbonate de sodium 4%. 4 flacons de 65 ml. Prêt à l’emploi.

Solution de lavage
c) Interprétation des résultats :

Pour évaluer les résultats du test, les réponses obtenues pour les échantillons de patients sont converties en concentration par l’intermédiaire d’une courbe de calibration (Fig. 7). Les résultats sont donnés en mgA/l (milligramme d’Allergène par litre)


Fig. 7 : Courbe de calibration pour le dosage des IgG4s


2.4 Dosage des tryptases

a) Principe :

L’immuno CAP 100 mesure les 3 formes de tryptases présentes dans le sérum. Un anti-tryptases, couplé par liaison covalente à l’immunoCAP reconnait un épitope présent sur la tryptase activée et inactivée présente dans le sérum. Après lavage, des anticorps anti tryptase marqués par une enzyme sont ajoutés pour former un complexe. Après incubation, les anti-tryptase-enzymes non liés sont éliminés par lavage et le complexe lié est mis en incubation avec un réactif de développement. Après inhibition de la réaction, la fluorescence de l’éluât est mesurée (Enrique et al, 1999).

b) Matériel utilisé :

Le kit de réactifs pour l’immunoCAP 100 (à conserver à 2-8°C), fourni par Phadia contient :

Les calibrateurs tryptase spécifique : (tryptase humaine en milieu tampon) 5 flacons de 0.2 ml de concentrations croissantes de 1 ; 5 ; 12,5 ; 50 et 200 µg/l contenant de l’azide de sodium 0,05% et un coloré en jaune. Solution prête à l’emploi.

Tryptase curve control : (tryptase humaine en milieu tampon) 4 flacons de 0.2 ml contenant de l’Azide de sodium 0,05% et un coloré en jaune. Prêt à l’emploi.

Le conjugué tryptase spécifique : un flacon de 2.8 ml de β-Galactosidase-anti-tryptase (anticorps monoclonaux de souris) contient de l’azide de sodium 0,06% et un coloré en bleu. Solution prête à l’emploi.

ImmunoCAP anti-tryptase : anticorps monoclonaux de souris contenant du Kathon CG 0,15%, conditionné en 3 tubes de 16 immunoCAP. Prêt à l’emploi.

Solution de développement : flacon de 6 ml de 4-Méthylombelliféryl-β-D-galactoside 0,01% et contenant kathon CG 0,05%. Solution prête à l’emploi.

Solution stop : 65ml de Carbonate de sodium 4%. Prêt à l’emploi.

Solution de lavage
d) Interprétation des résultats (Fig. 9) :

L
Fig. 9 : Courbe de calibration pour doser le taux de tryptases dans le sérum
es tryptases sont stables un mois dans le sérum conservé à -20°C. Pour évaluer les résultats du test, les réponses obtenues pour les échantillons de patients sont converties en concentration par l’intermédiaire d’une courbe de calibration. La limite de détection est de 1 µg/l. La moyenne est de 3,8 µg/l de tryptase dans le sang chez des individus sains. Si les tryptases sont inférieures à 11,4 µg/l, le test est négatif.

Si leur taux est supérieur à 13,5 µg/l, il indique un risque élevé de choc anaphylactique (Lang, 2006 ; Haeberli, 2003). Selon Biló et al (2005), chez les patients allergiques au venin d’hyménoptère, une concentration élevée de tryptase dans le sérum est associée à une réaction anaphylactique sévère en réponse à une piqûre.
2.5 CAST ®– 2000 ELISA

a) Principe :

Au cours du CAST®-2000 ELISA, les leucocytes, ayant préalablement été isolés, sont activés par l’IL-3 et simultanément stimulés par des allergènes. Les basophiles, entre autre, produisent des médiateurs de l’allergie comme les sulfidoleucotriènes LTC4 ainsi que leurs métabolites LTD4 et LTE4. Ces sLT fraîchement synthétisés sont ensuite mesurés par ELISA.

b) Matériel utilisé :

* La trousse CAST-2000 ELISA a été fournie par les laboratoires BÜHLMANN (Allschwil, Suisse), et contient :

Solution de dextrane : un flacon de 20 ml prêt à l’emploi, à conserver à 2-8°C.

Tampon de stimulation : flacon lyophilisé à reconstituer avec 50 ml d’eau ultra pure, apyrogène. A conserver à -20°C.

Contrôle de stimulation : anticorps monoclonal anti-FcRI; flacon lyophilisé à reconstituer avec 3,5 ml d’eau ultra pure apyrogène, à conserver à 2-8°C.

Microplaques : plaques coatées avec des IgG de lapin anti-souris. Conserver à 2-8°C.

Tampon de lavage concentré 20x : un flacon de 50ml à reconstituer avec 950ml d’eau désionisée. A conserver à 2-8°C.

Tampon ELISA : un flacon de 30ml prêt à l’emploi, à conserver à 2-8°C.

Calibrateurs : 5 flacons de concentrations croissantes de LTD4 (0, 50, 200, 800, 3200 pg/ml). A reconstituer avec 1ml d’eau déionisée. Maintenus lyophilisés à -20°C.

Contrôle bas : 2 flacons contenant une faible concentration de LTD4 tamponné lyophilisé à reconstituer avec 1 ml d’eau déionisée. Maintenus lyophylisés à -20°C.

Contrôle élevé : 2 flacons contenant une forte concentration de LTD4 tamponné lyophilisé à reconstituer avec 1 ml d’eau déionisée. Maintenus lyophylisés à -20°C.

Réactif blanc : un flacon de LTD4 tamponné lyophilisé à reconstituer avec 2ml d’eau déionisée. Maintenus à -20°C.

Marqueur enzymatique : LTD4 conjugué à la phosphatase alcaline, flacon lyophilisé à reconstituer avec 5.5 ml de tampon ELISA, à conserver à 2-8°C.

Anticorps de souris : anticorps anti leucotriènes (LTC4, LTD4, LTE4) en milieu tampon : un flacon de 11 ml prêt à l’emploi, à conserver à 2-8°C.

Substrat pNPP : un flacon de 42ml contient du para-nitrophénylphosphate et des granules stabilisants, solution prête à l’emploi, à conserver à 2-8°C.

Solution stop contenant du NaOH 2Normale, prête à l’emploi, à conserver à 2-8°C.

* Les allergènes protéiques CAST fournis par les laboratoires BÜHLMANN sont des extraits d’allergènes conditionnés sous forme liquide stable et concentrée. Il n’ont subit aucune modification covalente. Ils contiennent 25ng d’extrait protéique concentré par flacon. La dilution avec 250µl de tampon de stimulation permet d’obtenir une concentration de 50 ng/ml. Non dilués, ils sont conservés à 2-8°C.

c) Procédure:

Cellular Allergen Stimulation Test peut être séparé en trois étapes principales:

I) Isolation des leucocytes

L
Fig. 10 : Schéma récapitulatif de la procédure du CAST
e sang du patient est prélevé dans des tubes à ponction veineuse EDTA. Une solution de dextrane est ajoutée afin d’en augmenter la viscosité. Les érythrocytes sont sédimentés après une incubation de 90 minutes à 18-20°, alors que les leucocytes et les thrombocytes demeurent dans la fraction plasma. Le surnageant sanguin est ensuite soigneusement transféré dans un nouveau tube et les leucocytes sont sédimentés par une brève centrifugation.

Le surnageant plasmique contenant les thrombocytes est rejeté et le culot de leucocytes est resuspendu dans du tampon de stimulation contenant de l’IL-314 (Fig. 10).
II) Stimulation des leucocytes

Pour chaque échantillon cellulaire, trois tubes sont préparés :

- Blanc : l’expression des basophiles en l’absence d’allergène.

- Contrôle positif15 : l’expression des basophiles en présence d’un anticorps anti-récepteur IgE qui provoque leur dégranulation.

- L’expression des basophiles en présence de l’allergène.

De façon à mimer les conditions in vivo, les cellules sont incubées durant 40 minutes à 37°C. Elles sont ensuite brièvement centrifugées avant de les congeler à -80°C jusqu’à l’analyse par ELISA.

III) Dosage des leucotriènes par un ELISA

Le test ELISA est effectué sur microplaque pré-coatée,

16 puis par essai sont utilisés pour la courbe d’étalonnage et les contrôles en utilisant des échantillons de concentration en sulfidoleucotriènes connue.

Par patient, sont utilisés :

2 puits pour l’expression basale

2 puits pour le contrôle de stimulation

2 puits pour chaque allergène testé



Fig. 11 : Méthode par compétition
Le marqueur enzymatique (l’alcaline phosphatase liée covalentiellement au sLT) et de l’anticorps monoclonal spécifique des sLT sont ajoutés dans chaque puits (Fig. 11). Les sLT de chaque échantillon entrent en compétition avec sLT marqué et l’équilibre est atteint. Le taux de sLT marqué capturé par l’anticorps spécifique est inversement proportionnel au taux de sLT relargués par les basophiles du patients. Après incubation et lavage, la microplaque est incubée à l’abris de la lumière avec le substrat : le para-nitrophenyl-phosphate (pNPP)16. Finalement, la réaction est arrêtée par addition de solution stop (NaOH 2N) et l’absorbance est mesurée à 405 nm grâce à un photomètre d’absorbance.
d) Interprétation des résultats

La courbe d’étalonnage (Fig. 12) est calculée au moyen d’un algorithme à 4 paramètres. On reporte l’absorbance pour chaque échantillon, sur la courbe et on obtient la concentration en leucotriènes. Après déduction du blanc correspondant, on obtient la valeur corrigée du taux de leucotriènes. La valeur seuil clinique pour le venin d’abeille et de guêpe a été définie à 270 pg/ml.

Annexe 2 : Exemple typique des valeurs obtenues.

Fig. 12 : Courbe d’étalonnage qui relie [sLT] et B/B0


Facteurs influençant les résultats (de Weck et al, 2003) :

- la dose d’allergène : si elle n’est pas suffisamment élevée, elle peut mener à des faux négatifs et inversement ;

- le contrôle négatif peut être élevé : ceci peut être dû à une contamination in vivo ou in vitro par aéro-allergène ou par des endotoxines ;

- le contrôle positif peut être négatif : ce qui prouve la non viabilité des basophiles ;

- le critère de positivité est mal défini : le test sera positif pour la plupart des allergies si stimulation spécifique (après avoir déduit le blanc) est supérieure à 200 pg/ml ou supérieure à 100 pg/ml pour d’autres. Pour les hyménoptères, la concentration de sLT relarguée doit être supérieure à 270 pg/ml pour être positive. Pour les cas où le blanc est fort élevé, le test sera positif si le rapport entre la stimulation spécifique et le blanc est supérieur à 2 ;

- les sLT peuvent être relargués par basophiles, monocytes, éosinophiles ou plaquettes mais le relarguage est 100x plus petit pour les éosinophiles que pour les basophiles/monocytes.
2.6 CD63 BAT
Le « BASOTEST® Kit » a été fourni par Orpegen Pharma (Heidelberg, Allemagne). Cet kit permet d’identifier et de differencier, par cytometrie en flux, les basophiles activés des basophiles au repos chez des sujets sensibilisés.

Principe :

Le BASOTEST® est un test basé sur la Cytometrie en Flux, qui permet faire une détermination quantitative de la dégranulation des granulocytes basophiles dans le sang total humain hépariné. Il est destiné à déterminer l’activation et la degranulation des basophiles induites par des allergènes. On sélectionne les cellules sur base de l’expression de différents marqueurs exprimés à leur surface : CD45 et CD63.

Actuellement, la technique de BAT la plus utilisée et la plus validée cliniquement est realisee en identifiant les granulocytes basophiles par des anti-IgE qui détectent les basophiles activés par couplage au marqueur de surface CD63. Le CD63 est une protéine associé à la membrane des vésicules où les basophiles accumulent l’histamine. Le complexe antigène-anticorps à la surface cellulaire induit l’activation du CD63, les vésicules fusionnent avec la membrane plasmatique et le marqueur CD63 s’exprime sur le membrane cellulaire externe. Instantanement, il y a la libération de médiateurs comme l’histamine. Des anticorps monoclonaux couples à un fluorochrome sont utilisés pour detecter ces proteines sur la membrane. En resume, l’utilisation du BASOTEST® permet la quantification des granulocytes basophiles actives.

Le CD45 est une glicoproteine de haut poids moleculaire qui s’exprime seulement dans les cellules de la lignee leucocytaire. Ce marqueur ne s’exprime pas avec la meme intensité pour tous les leucocytes. Ainsi, il est capable de distinguer les granulocytes basophiles (qui sont de type CD45 low) des autres cellules de la lignée blanche (CD45 high).

La Cytometrie de flux (CMF) est une technique utilisee en routine dans la plupart des laboratoires d’analyse car elle permet d’identifier specifiquement une population cellulaire dans une échantillon où dominent des autres populations celulaires . Dans le cas des hypersensibilites de type I, où le basophile est la population recherchee, la cytometrie de flux est un outil de choix (les granulocytes basophiles constituent seulement le 0.5-1% de la population total des globules blancs). De plus, la CMF est un outil interessant car elle permet de caracteriser plusieurs parametres spécifiques de chaque cellule qu’elle analyse. La CMF analyse la diffusion de la lumière et la fluorescence des cellules.

Il s’agit d’une technique analytique qui consiste à injecter au centre d’une veine liquide une suspension de particules alignées, le but étant de les croiser avec un faisceau laser. Le rayon laser envoye ce faisceau pendant quelques microsecondes contre les cellules, une à une. Les cellules en traversant la trajectoire du rayon laser vont le diffracter, et il se produit simultanément un phenomene de diffusion d’une partie de la lumière incidente, et un phenomene d’emision d’une ou plusieurs  lumières de fluorescence, qui donnent différents signaux lumineux :

1.                  Signaux de dispersion : quand le faisceau laser change de direction apres l’impact avec la cellule et se propage dans toutes les directions de l’espace. Selon la grandeur cellulaire, les caractéristiques de la membrane, celles du noyau et du matériel nucléaire, les signaux sont captés sous forme de petits angles dans l’axe de propagation (Forward Scatter) ou sous forme de diffusion orthogonale (Side Scatter).

2.                  Signaux de fluorescence : à 90º de l’axe de la propagation laser.

Celles-ci seront captées pour des détecteurs photoélectriques. Un ordinateur capable de convertir ces signaux en signaux électroniques mémorise les paramètres de chaque cellule. L’information obtenue se rapporte aux caractéristiques intrinsèques (la grandeur et la complexité nucléaire et cytoplasmatique) autant que les caractéristiques antigeniques (immunophenotype).


b) Matériel utilisé :

Cet kit realise l’analyse sur sang total lysé. Il est maintenu dans l’obscurité à une temperature entre 2 à 8ºC et est amené à température ambiante avant utilisation.

Il contient :

Solution de lavage : 1 bouteille de Instamed-Salts à reconstituer dans 1 litre d’eau ultrapure, apyrogène, fournit 1 litre de solution de lavage. Contient du chloracétamide et l’EDTA. Cette solution sert de contrôle négatif de fond.

Tampon de stimulation (IL-3) : liophilisé à reconstituer par addition de 2 ml d’eau ultrapure, apyrogène.

Contrôle positif : 1 fiole (200 μl) contentant le peptide chimiotactique N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), a diluer dans la solution de lavage.

Anticorps monoclonaux : 1 bouteille (2 ml) de réactif anticorps bicolore de différent origine murine conjugués avec différents fluorochromes. L’anticorps monoclonal anti-IgE-PE est conjugué avec la phycoérythrine, qui reconnaît les granulocytes basophiles. L’anticorps monoclonal anti-CD63-FITC est conjugué avec le fluorochrome fluorescéine et détecte la glycoproteine gp53, exprimé exclusivement sur les basophiles activés.

Solution de lyse : 1 fiole (20 ml) à diluer 1/10 avec de l’eau doublement distillée pour éliminer les érythrocytes.
c) Procédure (Fig. 13a)

Pour chaque patient, sont réalises :

un controle positif : expression maximale du marqueur et prouve la viabilité des cellules.

un controle négatif : expression basale du marqueur en l’absence d’allergène.

une stimulation par l’allergène.
On utilise le peptid quimiotactique N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) pour realiser le control positif. La solution de netoyage sert comme à control negatif.

Les procédures de cytométrie en flux nécessitent des préparations de cellules mono dispersées et la suppression de l’interférence des érythrocytes. C’est pourquoi les échantillons destinés à un phénotypage immunitaire par cytométrie en flux doivent être préparés de manière appropriée pour le marquage et l’analyse.

Après avoir ajouté le tampon de stimulation (IL-3), les tubes avec 100μl de sang hépariné sont incubés 10 minutes à 37ºC, et après avec les différentes concentrations d’al·lergen pendant 20 minutes à 37ºC.

La réaction est arrêtée par incubation des échantillons dans un bain de glace. Ensuite les cellules sont marqués par ajout du réactif qui contient des anticorps monoclonaux de murine (anti-IgE-PE, anti-CD45 et anti-CD63-FITC) conjugués avec des fluorochromes.

La réaction est ensuite arrêtée par ajout de la solution fixe&lyse, qui permet de lyser les globules rouges et de figer les globules blancs pour l’analyse. Après la dernière étape de nettoyage, le pourcentage de granulocytes basophiles activés est déterminé par cytometrie en flux.

Avertissement : Le sang hépariné doit absolument être traité dans les 24 heures suivant le prélèvement. Les échantillons sanguins doivent rester à température ambiante avant le traitement. Le tampon de stimulation doit être conservé en aliquots à une température inférieure à -15 ºC après reconstitution. Le fMLP doit être jeté après l’usage
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