Apport du laboratoire de Biologie Clinique dans le diagnostic des allergies








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Apport du laboratoire de Biologie Clinique dans le diagnostic des allergies :

Nouveaux outils --

Etude venin d’hyménoptères au CHU de Liège .

1. Introduction
Le système immunitaire est un ensemble coordonné d'éléments qui permet de discriminer le « soi » du « non soi ». Il agit comme un mécanisme de défense qui reconnaît et détruit les pathogènes auxquels nous sommes confrontés. A la différence des bactéries, virus ou parasites, les allergènes ne constituent pas un danger pour l'organisme. Le système immunitaire a donc développé des mécanismes de tolérance périphériques afin de prévenir des réponses inappropriées contre ces antigènes non pathogènes. On parle de phénomène d’hypersensibilité lorsque le système de défense de l’organisme déclenche une réponse aberrante, exagérée, contre un antigène innocent (Goldsby et al, 2003).


    1. La classification de Gell et Coombs


Les réactions d’hypersensibilité sont, selon la classification de Gell et Coombs, de quatre types:

  • I : Immédiate : médiée par les IgE. L’antigène induit la formation de liaisons croisées entre les IgE liées aux mastocytes ou aux basophiles avec libération de médiateurs vasoactifs.

  • II : Cytotoxique : médiée par les IgG. L’anticorps dirigé contre les antigènes de surface d’une cellule médie la destruction de cette cellule grâce à des lymphocytes T cytotoxiques ou par l’activation du complément.

  • III : À complexes immuns : également liée aux IgG formant des complexes immuns. Les complexes antigènes anticorps déposés dans divers tissus induisent l’activation du complément, puis une réponse inflammatoire médiée par l’infiltration massive de neutrophiles.

  • IV : Retardée : médiée par les cellules T. Les cellules Th sensibilisées libèrent des cytokines qui activent les macrophages ou les cellules T cytotoxiques qui médient une lésion cellulaire directe qui se traduit par une réaction locale (cutanée) qui apparaît généralement entre 48 à 72 heures après contact avec l'allergène d'où le nom d'hypersensibilité retardée.


La plupart du temps, quand on parle d’allergie, on parle d’hypersensibilité de type 1 dans laquelle les IgE sont produites en réponse à un antigène appelé allergène (Goldsby et al, 2003).
1.2 Le mécanisme de l’allergie
Lorsqu’un antigène non pathogène pénètre dans l’organisme, il est reconnu par les lymphocytes B, les cellules dendritiques ou les macrophage qui le présentent aux cellules T. Selon Akdis et al (2004), si ces cellules sont des lymphocytes T CD4+CD25+, appelés régulateurs, ils empêcheraient l’activation périphérique des cellules Th2 conventionnelles et donc la réponse immunitaire. Cette inhibition se ferait soit directement, par interaction cellulaire, soit indirectement grâce à la sécrétion d’interleukine-10 et de TGF-β par les cellules T régulatrices. C’est ce qu’il se passe chez un individu sain.

L’élimination de ces cellules T CD4+CD25+ mène au développement de réponses aberrantes des mécanismes de défense. Si la cellule présentatrice d’antigène contacte une cellule Th2, elle déclenchera une réponse immunitaire non désirée, c’est la réaction allergique. Les cellules effectrices (Th2) et les cellules inhibitrices (Tr1) sont présentes chez les individus sains et les individus allergiques. C’est leur rapport qui déterminerait le développement d’une réponse saine ou allergique (Mamessier et al, 2006).

L’hypersensibilité de type 1 est associée à la production d’IgE par les lymphocytes B et à une réponse de type Th2 à des allergènes environnants. Elle se déroule en deux temps:
1. La phase de sensibilisation (Larché, 2006 ; Jutel et al, 2005)

Lors de la première exposition à l’allergène, le système immunitaire est activé. L’antigène est reconnu par les immunoglobulines membranaires des cellules présentatrices d’antigènes (Fig. 1). Il est endocyté puis dégradé en fragments peptidiques. Les peptides antigéniques produits sont ensuite liés aux molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de type II et sont exportés vers la surface cellulaire. Sous l’influence de l’IL-4, les cellules Th CD4+ naïves activées par la cellule présentatrice d’antigène se différentient en cellules Th2. Une fois générées, les cellules Th2 produisent l’IL-4, l’IL-5 et IL-13 et médient différentes fonctions régulatrices et effectrices Ces cytokines sont responsables de l’initiation du switch1 isotopique de la chaîne lourde des immunoglobulines en chaîne epsilon et de la stimulation subséquente de la différenciation des cellules B en plasmocytes sécréteurs d’IgE spécifiques de l’allergène présenté. La fraction constante de ces anticorps se lie avec une forte affinité aux récepteurs FcεRI2 des mastocytes tissulaires et des basophiles du sang. Les mastocytes et basophiles recouverts d’IgE sont dit « sensibilisés ». Cette phase est dite silencieuse car elle n’entraîne pas de signes cliniques.

Fig. 1 : Le mécanisme de l’allergie. A gauche : la phase de sensibilisation. A droite : la phase de réaction.



2. La phase de réaction (Larché, 2006)
Une exposition ultérieure au même allergène conduit à des liaisons croisées (pontage) entre l’allergène et les IgE fixés sur les membranes des basophiles ou mastocytes sensibilisés (Fig. 1). Ces pontages activent des tyrosines kinases3 associées aux domaines cytoplasmiques des récepteurs FcεRI. Il en résulte une cascade de phosphorylation qui induit la production de nombreux seconds messagers dont le calcium qui conduit d’une part, à partir de l’acide arachidonique, à la formation de prostaglandines et de leucotriènes et qui provoque d’autre part le processus de dégranulation. Ces médiateurs ainsi libérés vont entraîner la réaction allergique immédiate qui peut se traduire par l’urticaire, l’œdème de Quincke, ou le choc anaphylactique.

La liaison des IgE à leur récepteur spécifique FcεRI augmente l’expression de chemokines et de cytokines qui induit la survie des mastocytes et aide à l’activation des cellules T, ce qui amplifie le processus d’inflammation et facilite la présentation de l’antigène par les cellules présentatrices d’antigènes.

Les IgE peuvent aussi se lier aux récepteurs FcεRI des cellules dendritiques et des monocytes ou aux récepteurs de faible affinité FcεRII présents sur les monocytes, les macrophages et les cellules B (ce qui maintient l’inflammation) (Stern et al, 2007). La production d’IL-4, IL-5 et IL-13 par les cellules Th2 spécifiques de l’allergène, contribue aussi au développement, à la survie et au recrutement des éosinophiles, à la différentiation des mastocytes et à l’hypersécrétion de mucus. Selon Larché (2006), l’activité des cellules T régulatrices secrétant l’IL-10 est compromise chez les personnes allergiques.

Les cellules T ont donc un rôle essentiel dans le développement de l’allergie, ce qui explique pourquoi elles sont la cible privilégiée des thérapies (Goldsby et al, 2003).



    1. Les médiateurs


Les médiateurs peuvent être classés en primaires et secondaires. Les médiateurs primaires (comme l’histamine, les protéases, le facteur chimiotactique des éosinophiles, le facteur chimiotactique des neutrophiles, l’héparine) sont produits avant la dégranulation et mis en réserve dans les granules. Ils sont responsables de la réaction immédiate.

Les médiateurs secondaires (comme le facteur d’activation plaquettaire, les leucotriènes, les prostaglandines, les bradykinines, certaines cytokines comme l’IL-4) sont soit synthétisés après l’activation de la cellule cible, soit libérés lors du processus de dégranulation. Ils entraînent donc une réponse plus tardive.
L’histamine est le composant majeur des granules des mastocytes. Elle est préformée et mise en réserve dans les granules. Ses effets s’observent dans les minutes qui suivent l’activation du mastocyte. Une fois libérée, elle se fixe à des récepteurs spécifiques, H1, H2 et H3, répartis sur différentes cellules cibles. L’interaction de l’histamine avec le récepteur de type H1 présent sur les cellules des bronches, des vaisseaux sanguins, et de l’intestin va provoquer l’inflammation. Les récepteurs H2 sont présents à la surface des mastocytes et des basophiles, la liaison à son ligand provoque un effet feed-back négatif sur la libération des médiateurs (Goldsby et al, 2003).



Il existe d’autres médiateurs primaires comme les facteurs chimiotactiques pour les éosinophiles et les neutrophiles, qui en attirant ces cellules, prolongent la réaction allergique.

L
Β-Tryptase
es tryptases sont des sérines endoprotéases tétramériques d’un poids moléculaire de 134 kD. Elles sont constituées de 4 sous unités liées de façon non covalente. Il existe 3 formes de tryptases. L’α-tryptase et la proβ-tryptase sont les formes inactives qui sont secrétées en continus par les mastocytes. La β-tryptase est la forme active (Rossi et al, 1998). Elle est stockée dans les granules des mastocytes liée à l’héparine et n’est libérée qu’en cas de dégranulation extensive. Les tests qui sont actuellement disponibles mesurent l’α-tryptase, la pro-β-tryptase et la β-tryptase (Haeberli et al, 2003). Dans l’étude de Kucharewicz et al (2007), un taux sérique élevé de tryptases a été observé chez des patients avec une réaction anaphylactique sévère. Selon eux, le taux de tryptases serait corrélé de façon significative avec la sévérité de la réaction (Enrique et al, 1999). Un taux élevé de tryptases doit donc être considéré comme un facteur de risque de présenter une réaction anaphylactique grave à une piqûre (Lang et al, 2006 ; Haeberli et al, 2003).

En tant que seconds médiateurs, les leucotriènes et prostaglandines ne sont pas formés tant que le mastocyte n’a pas subi la dégranulation et la dégradation enzymatique de l’acide arachidonique des phospholipides membranaires. Cette cascade enzymatique se déroule suivant deux voies principales : la voie de la cyclo-oxygénase et celle de la lipoxygénase où la cascade enzymatique, à partir de l’acide arachidonique, va générer les prostaglandines et les leucotriènes, respectivement. Par conséquent, il s’écoule un temps plus long pour que les effets biologiques de ces médiateurs deviennent apparents. Les leucotriènes médient une bronchoconstriction, augmentent la perméabilité vasculaire et la production de mucus. La prostaglandine D2 provoque un bronchoconstriction et le facteur d’activation plaquettaire active les leucocytes. En fait, les seconds médiateurs prolongent les effets de l’histamine (Goldsby et al, 2003).
Toute une variété de cytokines, libérées des mastocytes et des éosinophiles, pourrait aussi contribuer aux manifestations cliniques de l’hypersensibilité de type I. Les mastocytes humains secrètent de IL-4, IL-5 et du TNF α. L’IL-4 active la synthèse d’éosinophiles dans la mœlle et augmente la production d’IgE. L’IL-5 est particulièrement importante dans l’activation et l’accumulation des éosinophiles. Ces derniers libérant aussi des médiateurs, ils maintiennent ou aggravent la réaction allergique. Quant au TNF α, il augmente l’expression de molécules d’adhésion sur l’endothélium vasculaire pour aider l’extravasation des leucocytes sur le site de réaction et, s’il est présent en grande quantité, il pourrait contribuer au choc anaphylactique (Goldsby et al, 2003).


    1. Les manifestations cliniques


Les médiateurs relargués suite à la rencontre du système immunitaire avec l’allergène vont provoquer des manifestations cliniques de deux types : locale (restreinte au site de contact de l’allergène) ou systémique (réaction généralisée à l’organisme entier).

1. Réaction locale

Si la réaction a lieu au niveau de la peau, comme c’est le cas pour les piqûres d’insectes, elle entraînera dans les minutes qui suivent un eczéma de contact, des démangeaisons et un gonflement qui peut se généraliser par une urticaire4. Les réactions locales sont gênantes mais ne mettent pas la vie de l’individu en danger, à l’inverse des réactions systémiques. Ces réactions peuvent être dangereuses si elles se situent au niveau de l’oropharynx.

Une réaction large locale dépend de la phase retardée médiée par les IgE. Elle se développe après 12 à 48 heures et peut durer de 5 à 10 jours. (Golden et al, 2005).

2. Réaction systémique

Lorsque les symptômes ou les signes apparaissent à un ou à plusieurs systèmes de l’organisme distant de l’endroit de la piqûre, c’est une réaction dite généralisée (Franklin Adkinson et al, 2003). Les réactions systémiques sont classées en 4 types en fonction de leur sévérité selon Mueller :

  • GRADE 1 : démangeaisons, urticaire généralisée, malaise, anxiété ;

  • GRADE 2 : n’importe quel symptôme du grade 1 plus au moins deux des suivants : œdème de Quincke, constriction de la poitrine, nausées, vomissements, douleurs abdominales, diarrhées, vertige ;

  • GRADE 3 : n’importe quel symptôme du grade 2 plus au moins deux des suivants : dyspnée, respiration bruyante, stridor, dysenterie, enrouement, faiblesse, confusion ;

  • GRADE 4 : n’importe quel symptôme du grade 3 plus au moins deux des suivants : diminution de la pression artérielle, collapsus, perte de connaissance, choc, incontinence, cyanose (Bilò et al, 2005).

L'œdème de Quincke est une réaction allergique caractérisée par une éruption oedèmateuse sous la peau et sous les muqueuses (en particulier celles du larynx). Il est lié à une hypersensibilité de type I. On observe, quelques minutes après le contact avec l'allergène (venin d'hyménoptère, etc.), une sensation de brûlure intense, un gonflement important du visage (lèvres, yeux), une coloration rose, des difficultés à respirer et au pire, une insuffisance de circulation sanguine (choc anaphylactique).
Le choc anaphylactique est une manifestation d’hypersensibilité immédiate due à la libération de médiateurs vasoactifs (comme l’histamine, les prostaglandines, les leucotriènes, les bradykinines) chez un sujet au préalable sensibilisé. Ils vont entraîner une chute des résistances vasculaires périphériques, une augmentation de la perméabilité des capillaires, une diminution du retour veineux, du débit cardiaque, de la pression systémique, ainsi que des troubles respiratoires et des troubles digestifs (Golden et al, 2005 ; Boumiza et al, 2003).

Les symptômes les plus courants de l'anaphylaxie sont l'urticaire et l'œdème de Quincke. Les autres symptômes comprennent : l'enflure de la gorge, des lèvres, de la langue ou du contour des yeux, des difficultés à respirer ou à avaler, un goût métallique ou des démangeaisons dans la bouche, des bouffées de chaleur généralisées, des démangeaisons ou une rougeur de la peau, des crampes d'estomac, des nausées, des vomissements ou la diarrhée, une tachycardie, une diminution de la pression sanguine (et la pâleur qui l'accompagne), un sentiment d’anxiété, un collapsus et un évanouissement.

Des mécanismes d’adaptation vont alors se mettre en place via la stimulation des barorécepteurs qui provoque la sécrétion de catécholamines. Celles-ci activent le système rénine angiotensine qui transforme l’angiotensine I en angiotensine II, puissant vasoconstricteur, le but étant de réaugmenter le débit cardiaque.

Les venins d’hyménoptères sont parmi les inducteurs les plus fréquents de chocs anaphylactiques.



    1. L’allergie au venin d’hyménoptère


Les hyménoptères constituent, après les coléoptères, l’ordre d’insecte le plus diversifié. Il se divise en 3 sous ordres : les Symphytes, les Térébrants et les Aculéates. Les hyménoptères Aculéates comptent trois supers-familles : les Apidae (abeilles), les Vespidae (guêpes), et les Formicidae (fourmis). Cependant il faut savoir qu’il existe quatre autres familles d’aculéates capables de piquer, piqûres douloureuses mais sans conséquences graves.

Dans la famille des « Vespidae », on distingue les Vespinae et les polistes. Parmi les Vespinae, on rencontre des guêpes de 2 genres importants : les Vespula et les Vespa. Chez les Vespula, le genre Vespula vulgaris et Vespula germanica sont les deux espèces les plus fréquentes, les plus agressives, dénommées Yellow jacket (Bilò et al, 2005).

Dans le nord de l’Europe, ce sont les piqûres de guêpes et d’abeilles qui sont les plus fréquentes mais notre étude s’est concentrée avant tout sur l’allergie aux guêpes.

La connaissance de la structure et de la composition en allergène du venin est incontournable pour le diagnostic et le traitement de l’allergie aux hyménoptères. Les venins d’hyménoptères contiennent des protéines allergéniques (le plus souvent des enzymes) autant que des protéines non allergéniques (comme des amines vasoactives) (Golden et al, 2005).

Constituants du venin de guêpes Vespula :

La phospholipase A1 est la protéine allergisante principale et son poids moléculaire environne 35-37 kDa. 80% des personnes allergiques aux guêpes présentent des IgE contre la phospholipase A1. L’antigène 5 (peptide majeur du venin dont le poids moléculaire est de 23-25 kDa) et l’hyaluronidase (43-45 kDa) sont les deux autres protéines principales (Biló et al, 2005). Ce venin contient également des protéines non allergéniques comme : l’histamine, la dopamine, la noradrénaline, l’adrénaline et la sérotonine (Vervloet et al, 2003).
Facteurs de risque d’apparition d’une réaction systémique (Bilò et al, 2005 ; Golden et al, 2005) :

Alors que tous les insectes piqueurs peuvent causer un gonflement à l’endroit de la piqûre, ils ne causent que rarement l’anaphylaxie. L’injection de venin consécutive à une piqûre d’insecte hyménoptère chez un individu allergique peut conduire à l’apparition de réactions d’hypersensibilité généralisées.

Les mastocytes et les basophiles activés ont un rôle central dans l’anaphylaxie causée par une piqûre. On ne sait pas encore quelle serait la voie principale d’activation. Une possibilité serait qu’après la piqûre, le venin soit absorbé dans le sang et cause la dégranulation des mastocytes dans les organes distants. Une autre possibilité serait que l’activation locale des mastocytes initie une cascade de réaction dont le résultat serait un relargage de médiateurs de l’inflammation à distance.

Les facteurs de risques influençant la probabilité d’une réaction anaphylactique lors de la piqûre suivante sont :

le type d’insecte : les patients allergiques aux abeilles ont un risque plus élevé de faire une réaction systémique à la prochaine piqûre que les allergiques aux guêpes ;

le nombre de piqûre et la période de temps s’écoulant entre elles : un intervalle court entre 2 piqûres augmente le risque d’une réaction systémique. Plus l’intervalle de temps est long, plus le risque diminue. Au contraire, être piqué fréquemment semble induire une tolérance ;

la sévérité de la réaction précédente. Après une réaction systémique grave à une première piqûre, le risque de développer une réaction anaphylactique la prochaine fois est plus grand. 57 à 75% des patients avec une histoire de réaction systémique après une piqûre développent des symptômes systémiques lorsqu’ils sont repiqués ;

  • le taux de tryptases dans le sérum et les mastocytoses5. Selon plusieurs études, un taux élevé de tryptases dans le sang pourrait être directement corrélé avec le risque de réaction systémique à la piqûre suivante ;

  • l’âge : les personnes plus âgées sont plus à risque de présenter des symptômes cardiovasculaires et respiratoires alors que les plus jeunes ne présenteront qu’une réaction modérée après une piqûre d’insecte ;

  • la prise de médicaments ou de drogue ;

  • la présence de maladies cardio-vasculaire ou traitement avec β-bloquants sont associés à une réaction sévère après une piqûre (les β-bloquants inhibent la synthèse des catécholamines).


Les réactions croisées

La réactivité croisée des IgE spécifiques aux épitopes d’hydrates de carbone des allergènes du venin avec des épitopes d’hydrates de carbone d’allergènes communs peut causer des faux positifs. C’est un problème majeur dans le diagnostic de ce type d’allergie.

La double positivité des tests diagnostics aux guêpes et aux abeilles peut être due à une double sensibilisation ou à une réaction croisée entre les épitopes des hyaluronidases des deux venins (Bilò et al, 2005). Il existe 50% d’homologie entre l’hyaluronidase du venin d’abeille et l’hyaluronidase du venin de guêpe (Hemmer et al, 2004).

Nous utiliserons donc dans notre étude la bromélaïne (k202 et Ro214), enzyme protéolytique qui contient de nombreux épitopes d’hydrate de carbone. Cela nous permettra de savoir si le patient présente des IgE positives pour le venin de guêpe, si ces anticorps sont dirigés contre les protéines du venin ou contre des déterminants CCD (Jappe et al, 2006).

1.6 Le diagnostic

Il repose sur un interrogatoire avec recherche des antécédents personnels, évocation des allergènes à l’origine des troubles et examen des signes cliniques. Différentes informations doivent être collectées : nombre, date et sorte(s) de réaction(s) après piqûre(s), sévérité des symptômes, intervalles entre les piqûres, traitement, site de la piqûre, insecte impliqué, facteurs de risques pour une réaction sévère, autres allergies,… L’interrogatoire est important car il permet d’orienter le choix des tests à effectuer (Bilò et al, 2005).
Les tests cutanés représentent le test le plus utilisé dans le diagnostic des maladies médiées par les IgE (Demoly et al, 2003). Ils consistent à injecter sous la peau de l’avant bras une faible dose de concentration croissante (de 0.0001 µg/ml à 1 µg/ml) d’extraits de protéines de venin. Après quinze minutes, on observe le diamètre de la réaction. S’il excède 5 millimètres à une concentration de 1 μg/ml, le test est considéré positif. S’il est négatif6 et que les signes persistent, il doit être répété. Le test est validé en utilisant l’histamine comme contrôle positif et le NaCl 0.9% comme contrôle négatif (Roll et al, 2006).
Vu le rôle déterminant des IgE dans l’hypersensibilité de type 1, le dosage des IgE spécifiques représente un outil de choix pour le diagnostic de l’allergie (Hamilton et al, 2004). Il consiste à doser dans le sérum du patient les IgE spécifiques pour plusieurs allergènes. Si le taux d’IgE spécifiques est supérieur à 0.10 KUA/L7, le patient est dit sensibilisé8. Mais ce dosage ne permet pas de prédire comment le patient réagira lors de l’exposition à l’allergène.

Dans la pratique clinique, la mesure du taux d’IgE spécifiques circulantes et les tests cutanés sont mis en parallèle. Malheureusement, certaines fois, les résultats ne concordent pas entre eux ou avec l’histoire clinique du patient (Demoly et al, 2003).

Depuis de nombreuses années, des tests de diagnostic in vitro de l’allergie basés sur la réaction des basophiles en présence de l’allergène ont été suggérés. Ils consistent à mimer in vitro ce qu’il se passe dans l’organisme lorsque les basophiles rencontrent l’allergène, mais sans les risques liés à la provocation in vivo. Certains sont basés sur l’analyse des médiateurs relargués par les basophiles comme l’histamine ou les sLT (Demoly et al, 2003 ; de Weck et al, 2002).

Les leucotriènes, l’histamine, etc., sont les médiateurs sécrétés lorsque l’allergène entre en contact avec les IgE spécifiques fixés sur les basophiles. A l’inverse de l’histamine qui est préformée et libérée lors de l’activation par l’allergène, les leucotriènes ne sont produits et relargués qu’après l’activation des basophiles par l’allergène. Les leucotriènes (LTC4, et ses métabolites LTD4 et LTE4) sont aussi produits dans les pseudo allergies9 (Szépfalusi et al, 1999).

La technique du CAST, Cellular Allergen Stimulation Test, est considérée comme une méthode de provocation in vitro. Les leucocytes sont d’abord isolés puis stimulés par l’IL-3 et l’allergène. Après 40 minutes d’incubation à 37°C, les leucocytes activés libèrent le LTC4 et ses métabolites. Ces sulfidoleucotriènes fraîchement synthétisés sont ensuite mesurés grâce à un test ELISA (Van Rooyen et al, 2004 ; de Weck, 2003).
Stimuler des basophiles avec un allergène provoque la libération de médiateurs mais aussi l’augmentation de l’expression de différents marqueurs qui peuvent être détectés efficacement par la cytométrie de flux en utilisant un anticorps monoclonal spécifique marqué par un fluorochrome (Ebo et al, 2006). Ceux-ci sont excités par un laser et la fluorescence émise est quantifiée par des photomultiplicateurs (Ebo et al, 2004).

Ces dernières années, les tests basés sur la cytométrie de flux ont donc été décris pour diagnostiquer ou pour confirmer la sensibilisation de patients aux insectes (Bühring et al, 2004).
Le Western blot, selon Zollner et al. (2001), est une technique très sensible et très efficace pour le diagnostic de l’allergie au venin de guêpe. Les différentes protéines constituant le venin de guêpe peuvent être séparées grâce à leur poids moléculaire par SDS-PAGE. Les trois protéines principales sont ainsi facilement identifiées : l’antigène 5 (23-25 kDa), phospholipase A1 (35-37 kDa) et l’hyaluronidase (43-45 kDa). Après le transfert par électrophorèse des protéines séparées sur la membrane de nitrocellulose, l’incubation de ces matrices avec le sérum du patient révèle « la liste » des anticorps spécifiques des différentes protéines de venin. Donc, plus d’informations sur les anticorps spécifiques peuvent être obtenues en utilisant cette stratégie (malheureusement peu utilisée en routine parce que non remboursée par l’INAMI).
Les tests de provocation in vivo sont les mieux placés pour diagnostiquer l’allergie aux venins d’hyménoptères. Ils ne sont plus pratiqués depuis des années vu le risque potentiel pour le patient (Golden et al, 2005). De plus, selon Mosbech et al. (1997), ils ne permettent pas d’affirmer que le patient réagira encore de la même manière s’il est à nouveau piqué.
1.7 Les traitements 

Les études épidémiologiques à long terme sur l’histoire naturelle de l’allergie aux hyménoptères montrent que le risque de réaction diminue avec le temps mais ne disparaît pas entièrement, persistant dans une proportion de 20 à 30% après dix ans chez des sujets non traités. Par ailleurs, la perte de spontanéité de la sensibilité est plus fréquente en cas de réaction initiale légère que sévère (Vervloet et al, 2003).
1. Symptomatique (Bonifazi et al, 2005)

Les anti-histaminiques, comme leur nom l’indique, diminuent les effets de l’histamine en empêchant la liaison de ce médiateur à ses récepteurs. Ils sont effectifs dans les réactions modérées confinées à la peau.

Les corticoïdes sont utilisés dans toutes les manifestations allergiques. Ce sont des anti-inflammatoire stéroïdiens, une fois entrés dans la cellule, ils se fixent à l’ADN et réduisent la production des facteurs inflammatoires et immunitaires et donc ils diminuent l’inflammation.

Les corticoïdes et les anti-histaminiques sont utilisés généralement dans le cas d’urticaire ou d’angioedème mais si les symptômes progressent, l’adrénaline est conseillée.

Lors de choc anaphylactique, l’administration d’adrénaline est indispensable pour le rétablissement de la circulation sanguine. L'adrénaline, ou épinéphrine, est reconnue par les professionnels de la santé comme constituant le traitement d'urgence définitif pour les réactions allergiques graves. En se fixant sur les récepteurs β1 et β2, elle détend les muscles des poumons, améliore la respiration, stimule le rythme cardiaque, soulage l’urticaire et l’enflure du visage. Ses effets diminuent après 15 à 20 minutes.
2. L’immunothérapie spécifique

L’éviction totale de l’allergène étant incertaine, l’immunothérapie spécifique est actuellement le seul traitement reconnu efficace pour soigner l’allergie au venin d’hyménoptère.

L’immunothérapie spécifique (IT) a été introduite par Noon et Freeman en 1911 pour soigner la rhinite allergique. Depuis plus de 90 ans, elle est utilisée pour soigner les allergies causées par les allergènes inhalés et les venins d’hyménoptères (Bousquet et al, 1998).

L’immunothérapie au venin d’hyménoptère (VIT) est indiquée pour les patients ayant présenté une réaction systémique sévère suite à une piqûre de guêpe (avec syndromes cardiovasculaire et respiratoire) et ayant un test cutané positif ou un RAST positif (IgE spécifiques du venin supérieur à 0.10 KUA/L). La décision de commencer une VIT doit être faite en fonction de l’âge, du degré d’exposition, de la sévérité de la première réaction et de l’anxiété du patient (Bonifazi et al, 2005 ; Golden et al, 2005 ; Bousquet et al, 1998).
NB : Pour une réaction locale isolée, SIT n’est pas indiquée. En effet, le risque de réaction plus sévère lors d’une éventuelle future piqûre est de 5% à 10% et donc on considère que la désensibilisation spécifique n’est pas une indication formelle (Mamessier et al, 2006).
Principe :

L’immunothérapie est efficace dans 75 à 95% des cas pour prévenir la survenue d’une réaction systémique. Elle s'effectue par injection sous-cutanée de doses croissantes et rapprochées de l'allergène, le but étant d’induire la tolérance des cellules T à l’allergène (Larché et al, 2006).

Le vaccin est constitué de protéines de venin d’insecte (mixture de phospholipase A1, hyaluronidase, antigène 5, acide phosphatase, quinines, amines biogéniques, oligopeptides, sucres,…) lyophilisées à reconstituer avec du diluant d’albumine humaine (Franklin Adkinson et al, 2003).
Au début de l’immunothérapie, on injecte quelques microgrammes d’allergène (0.1 ml de la concentration de 0.1 μg/ml). Puis, la dose est graduellement augmentée (phase d'attaque) toutes les une ou deux semaines jusqu’à 1 ml d’une concentration de 100 μg/ml (dose de maintenance recommandée). Celle-ci est administrée toutes les 4 semaines la première année, toutes les 6 semaines la deuxième année et toutes les 8 semaines les dernières années jusqu’à ce que les IgE chutent et que les tests cutanés deviennent négatifs. La désensibilisation peut durer de trois à cinq ans (Bonifazi et al, 2005). Généralement la littérature suggère d’arrêter le traitement après 5 ans (Franklin Adkinson et al, 2003).
Beaucoup de régimes différents de VIT existent. La distinction se fait sur la rapidité de la phase d’attaque, le but étant d’atteindre dans les 8 à 15 semaines la dose habituelle de 100 μg de venin à injecter. Le régime utilisé dans notre étude (ainsi que dans d’autres études récentes) est décrit comme un rush modifié dans lequel la dose cible est obtenue en 7 à 10 semaines d’injection. C’est l’intermédiaire entre le rush (2 à 3 jours) et le régime traditionnel (15 à 20 semaines) (Golden et al, 2005).
Mécanisme (Fig. 2) :

Les caractéristiques d’une réaction allergique incluent la production d’IgE, le recrutement et l’activation des cellules effectrices (mastocytes, basophiles, éosinophiles). Ces événements sont sous la régulation des cellules Th2 helper qui produisent préférentiellement l’IL-4 (interleukine responsable de l’initiation du switch d’IgE et de l’augmentation de la dégranulation des mastocytes) et l’IL-5 (impliquée dans la maturation, l’activation et la survie des éosinophiles) (Jutel et al, 2005 ; Akdis et al, 2001 ; Akdis et al, 1999).

Les mécanismes exacts de la désensibilisation sont encore mal connus.

Il est bien établi que les cellules T CD4+CD25+ (Tr) peuvent prévenir le développement de l’auto-immunité indiquant que le système immunitaire normal contient une population de cellules T régulatrices professionnelles qui sont activement impliquées dans la suppression immunitaire et dans l’induction de la tolérance.

De récentes études indiquent que les cellules T CD4+CD25+ (Tr) sont déficientes chez les sujets allergiques. Selon Mamessier et al (2006), leur nombre augmenterait chez les patients désensibilisés. Les lymphocytes T CD4+CD25+ (Tr) sont les principales productrices de TGFβ et d’IL-10 et seraient responsables du succès de l’IT.

Chez un patient désensibilisé, le switch de la réponse Th2 (qui caractérise la réaction allergique) en une réponse type Th1 peut être attribué à la diminution de la prolifération et de l’activation des cellules T CD4+ spécifiques en réponse à une augmentation progressive de la cytokine immunosuppressive IL-10. De plus, ces cellules T anergiques ne secrètent plus de cytokines essentielles pour le priming, la survie et l’activité des cellules effectrices (de Weck et al, 2003). L’augmentation d’IFNγ, la diminution d’IL-4 et d’IL-13 illustre la déviation de la réponse immunitaire vers le profile Th1 (Lent et al, 2006 ; Mamessier et al, 2006).

Selon Mamessier et al (2006), chez les allergiques, le système immunitaire donne une réponse type Th2 car Th1 est déficitaire. Leur hypothèse est que l’IT induit une modulation de cytokines qui doit être considérée comme un retour à la normale plutôt qu’un réel switch de Th2 à Th1.

Après l’IT, la réponse des basophiles aux stimuli IgE dépendants ou non IgE dépendants diminue. En effet, il a été prouvé que de plus faible quantité de médiateurs d’anaphylaxie (histamine et leucotriènes) sont relargués in vitro après traitement. Chez des individus allergiques au venin d’hyménoptère, on observe à la fin du rush VIT une diminution du contenu en histamine des basophiles (de Weck et al, 2003). Le résultat étant une diminution de la sécrétion d’histamine lors de la prochaine stimulation. Ceci doit être attribué à l’effet suppressif direct de l’IL-10 sur les cellules effectrices (Bonifazi et al, 2005).

Le fait qu’une réaction systémique peut se déclarer à tout moment du rush VIT et que les tests cutanés au venin ne sont pas différents avant et à la fin du rush suggère que la déplétion en médiateurs produits par les basophiles et les mastocytes réfractaires n’est pas le mécanisme principal de la désensibilisation.

L’IL-10 serait également responsable du switch isotypique d’IgE en IgG spécifiques de l’allergène et donc de la diminution du rapport IgE/IgG4. Le niveau élevé d’IgG4 a été associé au succès de l’immunothérapie10. Cependant la signification de cette augmentation n’est pas claire (Larché, 2007; Lent et al, 2006 ; Jutel et al, 2005 ; Hesselmar et al, 2003).
En conclusion, l’immunothérapie spécifique est associée à différentes formes d’immuno-régulation : l’induction de la réponse Th1, l’antagonisme de la réponse Th2, la production d’anticorps IgG4, ainsi que l’induction d’IL-10 et de TGFβ qui suppriment la réponse cellulaire à l’allergène (Larché, 2006).
1.8 But de l’étude
Le diagnostic des allergies aux venins d’insectes est basé sur l’histoire clinique, les tests cutanés et le dosage des IgEs. Cependant, il arrive que ces techniques soient en désaccord. En effet, 33% des patients allergiques aux insectes (prouvé par provocation) présentent un test cutané et/ou un taux d’IgEs négatif. Un diagnostic précis est particulièrement important pour confirmer l’indication de l’IT. Les risques, la longueur et le coût d’un tel traitement doivent être parfaitement évalués avant sa mise en place. Pour supprimer tout risque lié aux tests par provocation in vivo, le CAST et le CD203c BAT pourraient trouver leur place dans les techniques de diagnostic in vitro (de Weck et al, 2003).

De plus, il n’existe aucun moyen de prouver que la thérapie fonctionne et que le patient n’est plus allergique à l’allergène. La seule preuve (par l’absurde) est de dire que si celui-ci est piqué une nouvelle fois par l’hyménoptère et qu’il n’y a aucune réaction allergique c’est qu’il est devenu tolérant. La seule technique de laboratoire utilisée pour le moment pour suivre l’évolution de la thérapie est la diminution des IgE spécifiques. Si leur taux a très fortement diminué par rapport au taux de départ (le mieux étant inférieur à 0.35KUA/L mais c’est rare), le patient peut être considéré comme désensibilisé. Le CAST et le test d’activation des basophiles pourraient nous guider sur l’efficacité de IT.

D’après de récentes études, d’autres anticorps spécifiques, les IgG4s, pourraient induire une tolérance. Leur taux augmenterait durant l’IT alors que celui des IgEs chuterait. Le dosage de ces 2 types d’anticorps pourrait s’avérer utile dans le suivi de la désensibilisation et de l’allergie.
But de notre étude : chez des patients allergiques que nous avons sélectionné sur base d’un taux d’IgEs supérieur à 0,35KUA/L, non désensibilisés, en cours de désensibilisation ou en fin de désensibilisation, expérimenter la technique du CAST-2000 ELISA ainsi que le CD203c BAT, mettre en parallèle le taux d’IgEs vs IgG4s grâce au dosage par l’Immuno CAP. De plus, nous comparerons les IgG4s et les IgEs dirigés contre les différentes protéines de venin par la technique du Western blot. Nous évaluerons aussi la corrélation entre le taux de tryptases et la positivité du CAST.

Nous rechercherons une éventuelle relation entre la diminution du taux d’IgEs et l’élévation du taux d’IgG4 chez un individu désensibilisé et la négativité du CAST/CD203c BAT.

Nous tenterons de déterminer un profil que devrait avoir un patient désensibilisé.

2. Matériel et méthodes

2.1 Sélection des patients

Les patients ont été sélectionnés dans le logiciel du laboratoire sur base d’une prise de sang positive (>0.10 KUA/L11) pour les IgE spécifiques dirigés contre le venin de guêpe. Suite à l’accord du Comité d’Éthique du CHU de Liège, les patients ont été contactés afin de les soumettre à un prélèvement sanguin et à un petit questionnaire sur leur passé allergique.
2.2 Détermination des IgE spécifiques

2.2.1 Dosage des IgE spécifiques

Les IgE spécifiques au venin de guêpes (i3) sont dosées dans le sérum de 26 patients grâce à l’Immuno CAP 250 (Phadia, Uppsala, Suède). Pour la recherche des épitopes d’hydrates de carbone, nous avons également dosés les IgEs dirigées contre la broméline (k202 et Ro214) chez patients suspects.

a) Principe (Fig. 3) :

L
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