Universite paris XI- aix-marseille II – lyon I nancy I








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UNIVERSITE PARIS XI- AIX-MARSEILLE II – LYON I - NANCY I -
PARIS V - PARIS VI - PARIS VII et TOULOUSE III



DIPLOME INTER- UNIVERSITAIRE D’ONCOLOGIE PEDIATRIQUE
Année Universitaire 2004 – 2005


RECONSTITUTION IMMUNITAIRE APRES GREFFE DE CELLULES SOUCHES DE SANG PLACENTAIRE NON APPARENTEES
(A propos d’une série de 56 cas)
Mémoire présenté le 13 octobre 2005
Par le Dr Maria EL KABABRI
Directeur de mémoire :

Dr Gérard MICHEL, Hôpital Timone Enfants, Marseille
REMERCIEMENTS
A Monsieur le Professeur Michel



Je vous remercie pour m’avoir accueilli au sein de votre service et pour avoir accepté de rapporter sur ce travail. Les six mois passés dans votre service ont été riches en enseignement et en rigueur médicale.
J’admire vos compétences et votre investissement dans les soins comme dans notre formation.
A Madame le Docteur Curtillet
Merci de m’avoir épaulée et soutenue dans la réalisation de ce travail
Je vous remercie pour vos nombreux coups de mains.
Je remercie enfin, tout le personnel du service d’hématologie pédiatrique pour l’ambiance chaleureuse à laquelle il contribue
PLAN


LISTE DES ABREVIATIONS p 3

I. INTRODUCTION p 4



II. GENERALITES SUR LES GREFFES DE SANG PLACENTAIRE p6

A/ DEFINITION p 6
B/ UTILISATION ACTUELLE p 6
1) Sélection des donneurs p 6

2) Richesse cellulaire du greffon p 7

3) Modalités de prélèvement p 7

4) Banques de sang de cordon p 7

5) Conservation des unités de sang placentaire p 8

6) Suivi des donneurs p 8

7) Décongélation p 8

8) La transplantation en elle-même p 8
C/ PRINCIPES DES GREFFES DE SANG PLACENTAIRE p9
1) Compatibilité HLA p 9

2) Prévention de la maladie du greffon contre l’hôte p 9

D/ INTERETS ET PARTICULARITES IMMUNOLOGIQUES DU p 10

SANG PLACENTAIRE



1) Intérêts p 10

2) Particularités du profil immunitaire des cellules du sang de cordon p 12


III. PATIENTS ET METHODES  p 13

A/ CARACTERISTIQUES DES PATIENTS ET DE LEURS MALADIES p 13


  1. Age p 13

  2. Sexe p 13

  3. Poids p 13

  4. Pathologies p 14

  5. Statut CMV du receveur p 14



B/ CARACTERISTIQUES DES GREFFONS p 15


  1. Richesse des greffons   p 15

  2. Compatibilité HLA p 15

  3. Compatibilité ABO p 16

  4. Statut CMV du greffon p 16

  5. Provenance des greffons p 16


C/ PROCEDURES DE GREFFE  p 17


  1. Préparations p 17

  2. Prévention GvH p 18

  3. Prévention des infections p 18


D/ LES METHODES D’EVALUATION DE LA RECONSTITUTION  p 20
E/ LES METHODES STATISTIQUES p 20

IV. RESULTATS p 22

A/ RESULTATS GLOBAUX  p 22

B/ RESULTATS DE RECONSTITUTION IMMUNITAIRE p 25



  1. Reconstitution spécifique aux lymphocytes T : CD 3, CD4, CD8 p 25

  2. Reconstitution des lymphocytes B : CD19 p 30

  3. Reconstitution de la population NK   p31



V. DISCUSSION p 35

A/ RECONSTITUTION DE LA POPULATION LYMPHOCYTAIRE T  p 36

A/ RECONSTITUTION DE LA POPULATION LYMPHOCYTAIRE B  p 37
A/ RECONSTITUTION DE LA POPULATION LYMPHOCYTAIRE NK p 38

VI. CONCLUSION p 39



REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES


LISTE DES ABREVIATIONS

GCS : Greffe de cellules souches
GSP ou GSC : Greffe de sang placentaire = Greffe de sang de cordon

LA : Leucémie aigue

LAL : Leucémie aigue lymphoblastique

RC : Rémission complète

GvH : : Graft versus Host

GVHD : Graft versus host disease : maladie du greffon contre l’hôte

PCR : Polymerase Chain Reaction

CNT : Compte de cellules nucléées totales

PNN : Polynucléaires neutrophiles

GB : Globules blancs


NK : cellules Natural Killer

EFS : Event Free Survival : Probabilité de survie sans rechute

Effet GVL : effet graft-versus-leukemia : effet anti-leucémique du greffon

I. INTRODUCTION 



Les greffes des cellules souches hématopoïétiques (CSH) représentent le seul traitement curateur de nombreuses hémopathies malignes et non malignes de l’enfant. L’utilisation du sang de cordon est devenue une alternative intéressante à la greffe de moelle depuis la fin des années 80 en raison de sa richesse en progéniteurs et du caractère immature des cellules immunocompétentes. (1)
La greffe allogénique aussi appelée allogreffe, est effectuée avec des cellules issues d’un donneur. Il s’agit de remplacer la moelle malade ou dysfonctionnelle par un greffon qui va apporter à la fois une nouvelle hématopoïèse, un nouveau système immunitaire et une fonction intacte dans le cadre de la prise en charge de pathologies congénitales. Ces caractéristiques confèrent à la greffe allogénique son caractère thérapeutique et non plus de simple support hématopoïétique.
Les greffes allogéniques peuvent se faire à partir de CSH médullaires, périphériques ou placentaires provenant d’un membre de la fratrie (greffe apparentée) ou d’un donneur anonyme inscrit dans l’un des fichiers internationaux existants (greffe non apparentée).
Depuis plus de quarante ans, les greffes de cellules souches hématopoïétiques provenant d’une moelle de donneur HLA identique apparenté sont réalisées avec succès chez l’enfant.

Or trop souvent, ces greffes médullaires dites génoidentiques ne peuvent être réalisées devant l’absence de donneur HLA-identique dans la fratrie.
L’unique alternative était jusqu’alors aux greffes médullaires phénoidentiques à partir de donneurs anonymes inscrits sur fichiers.
En 1988, l’utilisation du sang du cordon placentaire comme issue curative à certaines pathologies hématologiques a pris un plein essor depuis les travaux de Gluckman et son équipe (2). Sa simplicité d'obtention, les possibilités de conservation par congélation, et surtout les premiers succès de transplantation en 1988 pour un enfant atteint d'une maladie de Fanconi à partir du sang de cordon de sa sœur HLA identique, ont permis au sang placentaire d'être considéré comme un substitut au don de moelle, au moins pour l'enfant.
La première greffe de sang placentaire non apparenté a été effectue en 1993 par l’équipe américaine de Kurtzberg (3). Depuis, environ 4000 greffes de sang placentaire ont été réalisées. L’immense majorité de celle-ci a été réalisée en situation non apparentée, à partir de banques de sang placentaire (4).
A de très rares exceptions près (un seul cas de greffe autologue rapporté dans la littérature), l’utilisation du sang placentaire en greffe est exclusivement allogénique (5). Les pathologies concernées sont les mêmes que celles prises en charge par les greffes de moelle ou de cellules souches périphériques, à savoir hémopathies malignes (6.7), aplasies médullaires idiopathiques ou congénitales (8.9), déficits immunitaires sévères (10-13), hémoglobinopathies (drépanocytose, thalassémie) (14-16) et maladies de surcharge (maladie de Hunter, de Hurler) (17,18).
Un des avantages majeurs de la greffe de sang placentaire est la diminution de l’incidence et de la sévérité de la GvH. En revanche il existe un inconvénient majeur  qui est le risque de survenue d’infections opportunistes du fait de l’immunodépression T globale dans les six premiers mois post-greffe de sang placentaire, c’est la raison pour laquelle on doit comprendre la reconstitution immunitaire et en dégager les facteurs déterminants.

Notre étude porte sur l’exploration de la reconstitution immunitaire de 56 enfants qui ont bénéficié d’une greffe de sang placentaire non apparenté dans le service du Pr MICHEL, Hôpital  de la Timone à Marseille entre 1997 et 2004.
L’objectif de cette étude est de définir quels peuvent être les corrélations entre certains paramètres clinico-biologiques des patients et la qualité de leur reconstitution immunitaire.

II. GENERALITES SUR LES GREFFES DE SANG PLACENTAIRE



A/ DEFINITION
On entend par sang du cordon placentaire, le sang contenu dans la partie fœtale du placenta après la naissance de l’enfant et le clampage du cordon. Biologiquement, il s’agit de sang fœtal, identique en qualité au sang qui circule chez le nouveau né.

Quantitativement, selon la technique utilisée pour le prélèvement et l’habileté de l’équipe qui prélève, 80 à 140 ml peuvent être récupérés à des fins de conservation. (19)
Le sang de nouveau-né à terme contient un pourcentage de cellules précurseurs comparable voire supérieure à celle de la moelle adulte (20,21)

De plus, les cellules souches de sang placentaire sont dotées d’un potentiel de prolifération plus important que les cellules souches adultes, lié en partie à la taille des télomères (22-24).

Le caractère immature des cellules de nouveau-né leur confère par ailleurs une relative tolérance immune.

Ces démonstrations ont permis d’envisager la possibilité de greffes de sang placentaire à partir de donneur non apparenté partiellement compatible.
B/ UTILISATION ACTUELLE
1) Sélection des donneurs 
Le sang du cordon peut être recueilli soit dans le but d’une greffe allogénique familiale (en cas d’enfant atteint dans la fratrie), soit dans le but de contribuer à la constitution de banque de sang de cordon.

Les critères de sélection sont :

- la signature du consentement éclairé : la mère est informée en cours de grossesse sur l’utilité du don, son innocuité, son caractère bénévole et anonyme, et sur la nécessité d’un suivi post-natal (consultation à trois mois).

- les antécédents médicaux et chirurgicaux : les critères d’exclusion sont les mêmes que pour le don de sang en ajoutant les antécédents de maladies génétiques chez la mère, le père ou la fratrie.

- obstétricaux : les grossesses pathologiques, les contextes infectieux au moment de l’accouchement, la prématurité mais aussi l’hypotrophie sont des critères d’exclusion.


2) Richesse cellulaire du greffon
Du fait du faible volume de sang placentaire disponible, les techniques de recueil et de conservation des greffons visent à optimiser et préserver la richesse cellulaire du greffon. Le volume moyen recueilli varie entre 80 et 140 ml suivant les centres.

Il est reconnu par toutes les équipes que la richesse cellulaire du greffon influence significativement la prise de greffe. (25)
3) Modalités de prélèvement
Le recueil doit être réalisé par un personnel entraîné dans le but d’optimiser le volume collecté et doit être fait de façon stérile avec des contrôles sérologiques (VIH1 et 2, Hépatite B et C, HTLV 1 et 2, CMV, Syphilis) ainsi que des cultures bactériologiques.

Deux techniques de collection sont couramment employées :

  • le sang de cordon est prélevé par les sages-femmes alors que le placenta est encore in

utero, juste après le clampage (26,27).

  • Le sang placentaire est prélevé après la délivrance dans une pièce adjacente à la salle de

travail par un technicien de la banque (28). Cette technique a comme inconvénient un moindre volume collecté et un risque de contamination bactérienne plus important de 14% contre 4% selon l’étude de Bertolini (29).

Un clampage précoce du cordon a pu être recommandé par de nombreux auteurs pour majorer le volume collecté. Actuellement, l’intérêt d’un court délai de clampage est discuté ; les auteurs privilégient la classique position du nouveau-né sur l’abdomen de la mère dès sa naissance pour optimiser le volume recueilli (30).
4/ Banques de sang de cordon 
Après avoir obtenu la confirmation que le sang de cordon était une source alternative de CSH, de nombreuses banques de sang de cordon se sont développées, notamment aux Etats-Unis et en Europe, dans le but de pallier l’absence de donneur HLA compatibles. Fin 2002, le Bone Marrow Donors Worldwide rapportait l’existence de 29 banques de sang de cordon de part le monde (Amérique du nord, Argentine, Australie, Chine, Europe de l’Ouest et l’Europe de l’Est) et la conservation d’environ 130 000 unité de sang placentaire. Trente à 40 000 unités supplémentaires sont recrutées chaque année (19).
Actuellement les banques européennes sont réunies dans le cadre du groupe Eurocord (31). Il regroupe les différents centres européens dans le but de :

  • standardiser les méthodes de recueil et de congélation.

  • étudier les propriétés des cellules précurseurs et des lymphocytes du sang de cordon.

  • faciliter les possibilités de greffes entre les différents pays européens.

  • centraliser les résultats et les comparer à ceux des greffes de moelle allogéniques phénoidentiques.

La création en 1998 de Netcord a permis de centraliser par Internet les données de chacune des unités de sang placentaire localisées dans les différentes banques à travers le monde. Ce registre permet d’évaluer rapidement les possibilités de donneur dans le monde entier, en fonction du typage HLA, de la richesse cellulaire du greffon (32).
5/ Conservation des unités de sang placentaire
Dans les heures qui suivent le prélèvement, le sang doit être congelé et conservé dans de l’azote liquide après une éventuelle erythrodéplétion permettant ainsi des conservations très prolongées (33).
6/ Suivi des donneurs
Pour éviter le risque d’un prélèvement pendant une éventuelle fenêtre sérologique, il convient de vérifier à 3 mois les sérologies maternelles à l’occasion d’une consultation post-natale. Le prélèvement cryopréservé est mis en quarantaine jusqu’à l’obtention des résultats.

A plus long terme, les parents sont incités à signaler au centre de prélèvement l’apparition de pathologies congénitales ou génétiques chez l’enfant.
7/ Décongélation
Le greffon retenu pour le candidat à la greffe est acheminé vers le receveur dans l’azote liquide.

Le greffon est décongelé en milieu stérile dans un bain à 37°C. Il est alors centrifugé après addition d’un volume égal de dextran-albumine.
8) La transplantation en elle-même
Elle se fait par voie intraveineuse sur environ une heure. Par convention, le jour de la transplantation est appelé J0. Les cellules souches hématopoïétiques administrées par voie veineuse se dirigent spontanément vers les cavités médullaires et adhèrent au stroma médullaire grâce à des récepteurs cellulaires spécifiques.

Comme pour toute greffe de cellules souches hématopoïétiques, le patient doit être isolé en milieu protégé dans une chambre à flux d’air laminaire ou à pression positive afin de limiter les risques d’infection grave et en attendant la sortie d’aplasie.

C/ PRINCIPES DES GREFFES DE SANG DE CORDON PLACENTAIRE
1) Compatibilité HLA 

Le système HLA représente l’ensemble des gènes situés sur le bras court du chromosome 6, codant pour des glycoprotéines transmembranaires à la surface des cellules nucléées de l’organisme.Il se subdivise en classes I et II. Les gènes de classe I sont situés sur les locus A, B et C du chromosome 6, ceux de classe II sur les locus DR, DP, DQ du même chromosome.
Dans le cas des greffes de sang placentaire non apparenté, on recherche un phénotype HLA identique ou partiellement identique. En effet, une compatibilité HLA incomplète est tolérée du fait du caractère immature des lymphocytes T du nouveau-né (34).

Cette immaturité leur confère une relative « tolérance » immune, expliquant la moindre fréquence des réactions du greffon contre l’hôte dans les greffes de sang placentaire (35)

Pour chaque unité de sang placentaire, les données de compatibilité HLA disponibles sur fichiers concernent les locus HLA A et B de classe I en méthode sérologique et le locus DR de classe II par technique de biologie moléculaire. Les donneurs présentant au moins 4 antigènes identiques par rapport aux six du receveur sont ainsi sélectionnés. Un typage HLA plus complet du donneur et du receveur est secondairement réalisé en biologie moléculaire pour les antigènes HLA de classe I (locus A, B et C) et de classe II (locus DR et DP) permettant ainsi un compte sur 10.
2) Prévention de la maladie du greffon contre l’hôte
La maladie du greffon contre l’hôte ou « Graft Versus Host Disease » (GVHD) représente la complication la plus grave survenant dans 30 à 50 % des greffes de moelle allogénique (36). Si elle est responsable de 20 à 40 % de la mortalité après greffe de moelle, elle est en revanche moins fréquente et rarement sévère après greffe de sang placentaire du fait de l’immaturité des lymphocytes T.


  • La GVHD aiguë correspond à l’agression des lymphocytes T matures du donneur contre

les antigènes majeurs et mineurs d’histocompatibilité du receveur.

Elle se produit dans les 100 premiers jours qui suivent la greffe et se traduit par des atteintes cutanées, hépatiques et digestives. Dans les formes sévères, elle s’accompagne d’une immunodépression importante qui grève le pronostic vital.

  • La GVHD chronique correspond à l’échec de la tolérance immune du thymus vis à vis du

système immunitaire du receveur. En effet, les cellules souches hématopoïétiques du donneur vont se différencier dans la moelle osseuse puis se diriger vers le thymus pour « apprendre la mémoire immunitaire » du receveur. La GVHD chronique résulte d’un problème de reprogrammation des lymphocytes du donneur.
Elle a lieu après le 100ème jour post-greffe et peut se traduire par des atteintes pluriviscérales comparables à une maladie auto-immune. Elle est dite limitée lorsqu’il s’agit d’une atteinte cutanée localisée et/ou d’un dysfonctionnement hépatique. Elle est qualifiée d’extensive lorsqu’elle concerne une atteinte cutanée généralisée isolée, ou localisée mais associée à une atteinte sévère d’un autre organe.


  • La prophylaxie de la GVHD consiste en un traitement immunosuppresseur associant Ciclosporine A et corticothérapie.



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