Les enzymes de dégradation des principaux polysaccharides pariétaux








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Interactions protéine-protéine et cellulosomes

Sandrine Pagès-Bruno - Stéphanie Perret
Les polymères végétaux représentent une part majeure de la biomasse terrestre, et parmi ces polymères la cellulose est le plus abondant et le plus récalcitrant à la dégradation biologique du fait de sa structuration cristalline et de son intrication avec d’autres polymères dans les parois. La dégradation de ces polymères constitue donc un phénomène clé du cycle du carbone. De plus l’utilisation de la biomasse végétale comme ressource renouvelable pour la production d’énergie présente un intérêt croissant face à la réduction des ressources énergétiques fossiles et à l’augmentation des gaz à effet de serre.

L’étude des mécanismes de dégradation des polymères végétaux mis en place par les microorganismes cellulolytiques constitue donc un enjeu de recherche fondamentale doublé d’un potentiel d’application très important en développement durable.

La cellulose est un polymère linéaire de glucoses liés par des liaisons de type -1,4 (Figure 1). Ce substrat est très récalcitrant à la dégradation du fait de sa structure compacte. Les molécules sont associées entre elles par l’intermédiaire de liaisons hydrogène pour constituer de véritables réseaux cristallins aux seins de microfibrilles de cellulose.


Figure 1 : molécule de cellulose
Dans les parois végétales les fibres de celluloses sont en étroite association avec d'autres polymères et notamment des molécules d'hémicellulose. Les hémicelluloses constituent une classe hétérogène de polysaccharides, souvent ramifiés et constituant une matrice liée étroitement, de manière non covalente à la surface de chaque microfibrille de cellulose.
Deux exemples de constituants de l’hémicellulose :

  • Le xylane ou arabinoxylane : son squelette est composé de sous-unités D-xylopyranose liées par des liaisons béta-1,4. Les molécules de xylose peuvent être acetylées et/ou substituées par des groupements saccharidiques de type acide méthylglucuronique ou arabinose. Les molécules d’arabinose peuvent être elle-même substituées par des molécules d’acide phénolique (acides férulique ou coumarique).

  • Le mannane : constitué de sous-unités D-mannopyranose reliées par des liaisons béta-1,4 . Le mannane peut être ramifié par des résidus D-galactose en alpha-1,6 avec des ratios mannose/galactose variables, on parle alors de galactomannane.



Les enzymes de dégradation des principaux polysaccharides pariétaux
Cette biodégradation est essentiellement accomplie par des microorganismes. Ceux-ci ont développé des systèmes de dégradation très performants formés d’un grand nombre d’enzymes de spécificités différentes. Ces systèmes comportent à la fois des cellulases, mannanases, xylanases, pectinases… Ils peuvent être constitués soit de protéines indépendantes et sont désignés comme systèmes non complexés soit de protéines liées autour d’une protéine d’assemblage pour former des complexes extrêmement stables appelés cellulosomes.

Les enzymes impliquées dans la dégradation des polysaccharides des parois végétales sont répertoriées dans la classification internationalement reconnue, établie par P. Couthino et B. Henrissat à l’AFMB à Luminy (classification établie sur la base d’homologie de séquence) qui regroupe 125 familles de glycosyl-hydrolases (GH), 22 familles de polysaccharide-lyases (PL) et 16 familles de carbohydrate-estérases (CE). (http://www.cazy.org/).
Les modules catalytiques
Les modules catalytiques des cellulases appartiennent aux familles GH 5, 6, 7, 8, 9, 12, 44, 45, 48, 51, 61 et 74. On distingue deux types de cellulases : les endocellulases et les cellulases processives. Les endocellulases hydrolysent des liaisons glycosidiques à l’intérieur des chaînes de cellulose de façon aléatoire. Les cellulases processives, après hydrolyse de la première liaison glycosidique, vont glisser le long de la chaîne et cliver le substrat à intervalle régulier, libérant ainsi principalement du cellobiose. L’attaque initiale peut se faire sur l’extrémité d’une chaîne, on parle alors d’exocellulase ou à l’intérieur d’une chaîne, on parle d’endocellulase processive. Les modules catalytiques des xylanases sont principalement classés dans les familles 10 et 11.

Il a été démontré que le repliement général de l’enzyme et le mécanisme catalytique (rétention ou inversion de la configuration de carbone anomérique) sont conservés pour tous les membres d’une même famille. Cependant, au sein d’une même famille, l’architecture structurale du site actif n’est pas forcément la même et des spécificités de substrat différentes peuvent être rencontrées. La famille GH5 regroupe par exemple des cellulases, mannanases, lichenases, galactanases …

Les CE catalysent la dé-acétylation des chaînes principales de certaines hémicelluloses et pectines. On trouve par exemple des acétyl-xylane-estérases, féruloyl-estérase, chitine-déacétylase, pectine-méthyl-estérase … .

Les PL constituent un groupe d’enzymes qui catalyse le clivage des polysaccharides, principalement la pectine, via un mécanisme de béta-élimination. Le sucre de l’extrémité non réductrice nouvellement généré est alors insaturé. On trouve par exemple des pectate ou pectine-lyases et rhamnogalacturonane-lyases.
Les modules d’interaction au substrat



64 familles de CBM (« Carbohydrate Binding Module ») ont été décrites (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/). Ces CBM sont affins pour un ou plusieurs sucres, solubles ou insolubles. Ceux ayant une forte affinité pour la cellulose cristalline sont rangés dans un nombre limité de familles. Certains CBM (CBM6 et 22 par exemple) affins pour le xylane ou certains composés spécifiques des hémicelluloses (comme des béta-glucanes) se retrouvent systématiquement associés à des modules catalytiques de type xylanase ou mannanase.

L’interaction d’une enzyme avec son substrat est une des premières étapes du processus d’hydrolyse. Les enzymes des systèmes cellulolytiques non complexés possèdent toutes au moins un CBM. Beaucoup d’enzymes cellulosomales (systèmes cellulolytiques complexés) n’en n’ont pas. Leur adressage au substrat est assuré par le CBM3 du facteur d’assemblage qui possède une très forte affinité pour la cellulose cristalline. Certaines possèdent toute fois leur propre CBM.

Les modules dockérine



Les enzymes incorporées dans les cellulosomes contiennent un module dockérine qui est impliqué dans l’édification de ces complexes. Ce module interagit avec un module de la protéine d’assemblage qui est appelé module cohésine. Tous les modules dockérine mis en évidence à ce jour sont constitués de deux segments (1 et 2) de 22 résidus chacun, conservés et séparés par une séquence de jonction de 5 à 11 résidus non conservés.

Les micro-organismes cellulolytiques
Les micro-organismes cellulolytiques ont développés des systèmes enzymatiques sophistiqués pour dégrader la cellulose et les polymères associés. Parmi, ces organismes, certains champignons et bactéries anaérobies stricts produisent des complexes multi-enzymatiques appelés « cellulosomes ».
C. cellulolyticum est une bactérie mésophile, anaérobie stricte, à Gram positif et mobile grâce à des flagelles péritriches. Elle a été isolée à partir d’herbe en décomposition (Petitdemange et coll., 1984). Cette bactérie est capable d’utiliser différents sucres simples tels que l’arabinose, le cellobiose et le glucose, et des sucres complexes tels que la cellulose et le xylane comme source unique de carbone et d’énergie.
C. cellulolyticum synthétise des complexes multi-enzymatiques de 600 kDa appelés cellulosome. Des complexes similaires sont produits par d’autres clostridies comme par exemple C. thermocellum, C. cellulovorans et C. josui. Les sous-unités catalytiques du cellulosome sont attachées à une protéine d’assemblage de 160 kDa, dépourvue d’activité enzymatique, appelée CipC (Figure 2). L’attachement de chaque enzyme au facteur d’assemblage se fait par l’interaction des modules dockérines des enzymes, aux modules cohésines de CipC (Pagès et al, 1996). Le séquençage du génome a montré l’existence d’une soixantaine de gènes codant pour des enzymes à dockérines. (Blouzard et al 2010a).



Figure 2 : représentation schématique d’un cellulosome

III But de l’atelier :


  • Produire ET purifier une enzyme du système cellulolytique de C. cellulolyticum : la mannanase Man5K et une miniprotéine d’assemblage : mini CipC1 chez E. coli.

  • Démontrer le mode d’édification des complexes enzymatiques par l’interaction spécifique entre les modules « dockérines » de l’unité enzymatique Man5K et les modules « cohésines » de la protéine d’assemblage du complexe (protéine CipC).

  • Extraire et purifier des cellulosomes à partir une culture anaérobie sur cellulose de Clostridium cellulolyticum.


Programme de l'atelier:
1. Le clonage de gènes codant pour la mannanase 5K et MinicipC1 dans un vecteur d’expression.

2. La production par E. coli de ces protéines (surproduction de protéines hétérologues par le colibacille).

3. La purification des ces protéines recombinantes

4. Mettre en évidence les interactions protéines-protéines a l’origine de l’édification des cellulosomes.

Références
Blouzard JC, Coutinho PM, Fierobe HP, Henrissat B, Lignon S, Tardif C, Pagès S, de Philip P. Modulation of cellulosome composition in Clostridium cellulolyticum: adaptation to the polysaccharide environment revealed by proteomic and carbohydrate-active enzyme analyses. (2010a) Proteomics. 10(3):541-54.
Blouzard JC, Valette O, Tardif C, de Philip P. Random mutagenesis of Clostridium cellulolyticum using a Tn1545 derivative. (2010b) Appl Environ Microbiol. Apr 30. [Epub ahead of print]
Pagès S, Bélaich A, Tardif C, Reverbel-Leroy C, Gaudin C, Bélaich JP (1996). Interaction between the endoglucanase CelA and the scaffolding protein CipC of the Clostridium cellulolyticum cellulosome.. J Bacteriol.178 : 2279-86.
Perret S, Bélaïch A, Fierobe H-P, Bélaïch J-P et C Tardif. Towards designer cellulosomes in clostridia : mannanase enrichment of the cellulosomes produced by Clostridium cellulolyticum. (2004a) J Bacteriol 186:6544-6552.
Perret S, Maamar H, Bélaïch J-P et C Tardif. (2004b) Use of antisense RNA to modify the composition of cellulosomes produced by Clostridium cellulolyticum. Mol Microbiol 51: 599-607.


PLANNING TP M1-MBVB Atelier interaction protéine-protéine Octobre 2011





Matin

Après midi 14h

L 10/10

9h15

SPa

-Présentation atelier

- Amplification des gènes man5K et miniCipC1 ET contrôle sur gel des amplicons.

- Ensemencement culture pour préparation d’ADN plasmidiques (pET22b+ et 28b+)

- Préparation de boites de pétri

-Préparation de gels d’agarose

M 11/10 9h15

SPa/SPe


-Minipréparation d’ADN plasmidique Et estimation des concentrations.

- Purification des amplicons Et contrôle sur gel

- Digestion du fragment de PCR et de l’ADN plasmidique



TD Bioinformatique

Mc 12/10 9h15 SPa

-Purification des vecteurs et inserts après digestion enzymatique

-Contrôle sur gel d’agarose

-Mise en culture de DH5.

-Ensemencer des cultures de milieu anaérobie contenant de la cellulose avec C. cellulolyticum

J 13/10

9h15 SPa

-Préparation de cellules compétentes

-Ligature

-Transformation

V 15/10

Spa 9h15

-PCR sur colonies

- Discussion et analyse des résultats

L 17/10


SPe 9h


- Préculture, suivi de cultures

- TD production

- Préparation des solutions et du matériel pour la purification


M 18/10

SPe 9h

- Suivi de culture

- Induction

- Purification des cellulosomes


Mc 19/10

SPe 9h


- Centrifugation des cultures

- Casse et purification des protéines recombinantes

- Préparation des échantillons pour SDS-PAGE

- Préparation des gels d’acrylamide


J 20/10

SPe 9h


- Analyse des fractions de purification en gel SDS-PAGE

- Concentration des protéines

- Evaluation des concentrations des protéines recombinantes purifiées et cellulosomes

(DO 280)


V 21/10

SPe 9h

- Gel bilan dénaturant des protéines pures

- Evaluation des concentrations des protéines purifiées (Lowry)


L 2410

SPe 9h

- Etude des interactions entre protéines purifiées

- Gel natif

- Far western blot

M 25/10

SPe/SPa

- Far western blot (suite)


- TD Bilan


V 28/10



ORAUX

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