Partie 1: Une théorie de l'hérédité déjà ancienne








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partie 2: Des biotechnologies génétiques surévaluées


Les techniques de ce qu'il convient d'appeler le génie génétique permettent de manipuler les gènes et dans une certaine mesure le vivant. Les succès obtenus sur les Procaryotes et sur quelques organismes-modèles eucaryotes ont pu faire penser à certains qu'ils détenaient les clés du vivant. On est loin du compte.

1. Les outils des biotechnologies génétiques


On désigne par "technologie de l'ADN recombinant" les techniques de manipulation de l'ADN mises au point à partir des années 1970 et l'on réserve habituellement le terme de génie génétique aux manipulations génomiques appliquées. (On notera que le terme "génie génétique" est nettement moins péjoratif que "manipulation génétique" qui fût le premier terme employé). Le génie génétique est un ensemble de techniques permettant de former de nouvelles combinaisons d'ADN susceptibles d'être insérées dans une cellule vivante et y être exprimées.
Maintenant on parle souvent de génomique, qui désigne la science des gènes et des techniques de la génomique pour désigner la technologie.

Voici un aperçu très simplifié des principales techniques regroupées sous le terme de technologie de l'ADN recombinant :

Technologie de l'ADN recombinant... quelques techniques

couper l'ADN

les endonucléases ou endonucléases de restriction ou enzymes de restriction peuvent in vitro couper spécifiquement une séquence d'ADN (double brin)

Les enzymes de restriction ou endonucléases de restriction :

on nomme ainsi toute molécule capable de dégrader de façon spécifique tout ADN étranger. Elles ont été isolées chez les bactéries qui dégradaient rapidement les ADN des virus (bactériophages) qui leur injectaient leur ADN : ces bactéries résistantes aux virus, restreignant la croissance de ceux-ci, furent isolées et cultivées. On pu alors extraire de leur cytoplasme des enzymes dites de restriction (qui provoquaient une restriction de croissance du virus). Il semblerait que les cellules bactériennes se protègent contre leur propres enzymes de restriction en modifiant chimiquement leur ADN par méthylation. Actuellement les biologistes moléculaires pensent que la méthylation est un moyen pour la cellule procaryote de reconnaître son propre ADN. Chez les eucaryotes la méthylation est interprétée comme un marqueur de l'activité des gènes... voir à ce sujet par exemple les Ch 415 et 27 de Gènes de B. Lewin).

nom

organisme

* = sites de coupure

commentaires

AluI

Arthrobacter luteus

5'-----A G*C T-----
--------T C*G A-----5'

F

C - donnent deux "bouts collants" (extrémités cohésives) puisqu'elle ne coupe pas les deux brins de la chaîne d'ADN au même endroit (c'est un avantage car en traitant avec la même nucléase l'ADN à insérer et le vecteur on prépare leur recombinaison, mais c'est aussi un inconvénient car des fragments peuvent se réassocier...)

F - coupure "franche" sans "bouts collants"

5' désigne l'extrémité dite 5' du brin d'ADN; ce sont les carbones du désoxyribose qui sont ainsi numérotés; à l'extrémité 5' du brin d'ADN il y a un groupement phosphate dont une des liaisons est disponible. Le phosphate du nucléotide de l'extrémité 3' est engagé dans une liaison avec le nucléotide suivant.

BamHI

Bacillus amyloliquefaciens H

5'-----G*GATC C-----
---------C CTAG*G---5'

C

BgIII

Bacillus globiggi

5'-----A*GATC T----
---------T CTAG*A---5'

C

EcoRI

Escherichia coli

5'-----G*AATT C-----
---------C TTAA*G---5'

C

EcoRII

5'-----*CCTGG ----
--------- GGACC*---5'

C

EcoRIII

5'-----G*CCTG C-----
---------C GACC*G---5'

C

HaeIII

Hæmophilus ægyptus

5'-----G G*C C-----
--------C C*G G-----5'

F

HindIII

Hæmophilus influenzæ b

5'-----A*AGCT T-----
---------T TCGA*A---5'

C

HpaI

Hæmophilus parainfluenzæ

5'-----GT T *A AC-----
--------CA A*T TG-----5'

F

PstI

Providencia stuartii

5'-----C*TGCA G----
---------G ACGT*C---5'

C

SalI

Streptomyces albus

5'-----G*TCGA C----
---------C AGCT*G---5'

C


On remarquera que les séquences reconnues sont généralement de 6 paires de bases.

Remarque: On connaît des endonucléases qui coupent les ARNm.

coller l'ADN

(recombiner)

les ligases sont des enzymes faisant intervenir l'énergie de l'ATP (molécule + ATP <==> ADP + molécule - P) ou d'un autre nucléoside triphosphate (GTP, UTP...). Certaines ligases sont capables in vitro de lier deux molécules d'ADN par liaisons covalentes (une sur chaque brin). Si leurs extrémités sont cohésives et complémentaires on peut ainsi former une molécule d'ADN hybride avec deux ADN provenant d'organismes différents (ADN chimère). C'est notamment le cas de l'insertion d'un ADN étranger, isolé par une enzyme de restriction ER, dans un plasmide coupé par cette même enzyme de restriction ER.
Dans le cas où les extrémités ne sont pas cohésives, on peut les rendre cohésives à l'aide d'une enzyme (transférase terminale) capable d'ajouter (en 3') une chaîne monospécifique de nucléotides (poly A ou poly T par exemple). Il existe aussi une ADNligase réalisant des ligatures entre molécules d'ADN à bouts francs (extraite du phage T4).

dupliquer (multiplier, cloner) l'ADN

* multiplication in vivo par l'ADN polymérase
la multiplication d'une séquence d'ADN était auparavant conditionnée par son insertion dans un vecteur d'insertion (virus ou plasmide) que l'on introduisait à son tour dans un vecteur de multiplication (bactérie ou cellule eucaryote comme la levure) qui, en se multipliant, reproduisait la séquence d'ADN insérée (génie génétique). Cette technique est connue sous le nom de clonage d'un gène (isolement, insertion, multiplication).
* multiplication in vitro par amplification enzymatique par l'ADN polymérase extraite d'une bactérie thermophile. C'est notamment la technique de l'APR (amplification en chaîne par polymérase: ce terme doit remplacer en français la PCR (polymérisation en chaîne de l'ADN): http://www.education.gouv.fr/bo/2007/1/CTNX0609645K.htm) qui permet de produire de grandes quantités d'un fragment d'ADN sans le cloner.

synthétiser de l'ADN

la synthèse se différencie de la multiplication par le fait que l'on procède à partir de nucléotides et non d'ADN. De plus cette synthèse d'ADN artificiel peut être contrôlée de façon à obtenir de l'ADN de séquence déterminée. Cette technique n'est au point que pour des oligonucléotides (quelques dizaines de nucléotides).
Les oligonucléotides peuvent servir d'amorce pour des synthèses dirigées d'ADN. Ainsi, on peut réaliser une synthèse dirigée d'ADN in vivo à la suite de l'insertion d'un oligonucléotide portant par exemple une modification que l'on souhaite conserver dans un gène. Par exemple dans le cadre de mutations dirigées (mutagenèse dirigée) on hybride un oligonucléotide spécifique (amorce) avec un ADN monocaténaire comportant le gène que l'on désire modifier. Par l'ADN polymérase on synthétise in vitro un ADN bicatéanaire comportant la mutation souhaitée (sur un seul des brins).

dénaturer l'ADN

la dénaturation de l'ADN est la séparation des deux brins (par rupture des liaisons hydrogène) ; elle s'obtient par simple chauffage modéré (vers 60°C) et est alors réversible. A plus haute température il peut y avoir rupture des liaisons covalentes entre et à l'intérieur des nucléotides et les brins sont altérés; la dénaturation est alors irréversible.

renaturer l'ADN

la renaturation de deux brins d'ADN séparés par chauffage modéré (vers 60°C) est spontanée dès retour à une température plus basse.
la renaturation ou l'hybridation (voir ci-dessous) sont utilisées dans l'association d'une sonde avec une molécule d'acide nucléique

hybrider l'ADN

(apparier des séquences d'ADN ou d'ADN et d'ARN complémentaires)

On peut hybrider (c'est-à-dire associer artificiellement) des brins d'ADN (qu'il faut donc avoir séparé auparavant par dénaturation) venant de molécules différentes mais aussi des molécules d'ARN avec des brins d'ADN ou encore des brins d'ARN. C'est encore l'hybridation mais cette fois c'est son caractère spécifique qui est employé pour l'hybridation d'une sonde (courte séquence marquée radioactivement (sonde chaude) ou non (sonde froide, par exemple sonde fluorescente, voir FISH dans l'ancien cours de terminale)...) avec une séquence d'ADN ou d'ARN complémentaire au sein d'un grand nombre de molécules d'acides nucléiques.

Les techniques de Northern et Southern blot appliquées respectivement aux molécules d'ARN et d'ADN simple brin permettent de visualiser rapidement l'hybridation entre une sonde radioactive et des acides nucléiques simple brin séparés par électrophorèse sur gel et transférés par effet buvard sur une feuille de nitrocellulose. On qualifie de "Western blot" une technique assez similaire à partir de protéines.

transcrire l'ADN en ARN

la transcription est réalisée in vivo par de gros complexes enzymatiques contenant une ARN polymérase (voir cours de 1èreS); in vitro elle peut être obtenue avec un rendement plus faible. L'ensemble des ARN transcrits dans une cellule est appelé transcriptome par analogie avec le génome désignant l'ensemble des gènes.

"retro-transcrire" l'ARN en ADN = "transcription inverse"

des enzymes de type transcriptase inverse (ou reverse) ou retrotranscriptase (capables de catalyser la synthèse d'un ADN monobrin (dit ADNc ou ADN complémentaire à partir d'un ARN, voir cours de 1èreS) ont été découvertes par Tenin, Baltimore chez les virus (1970) et par Beljanski chez Escherichia coli (1972) puis chez d'autres cellules procaryotes (Agrobacterium tumefaciens) et eucaryotes (voir histoire de la génétique).

insérer l'ADN dans une cellule

(transformer un oragnisme par transgenèse)

l'ADN peut être inséré
* chez les procaryotes et quelques cellules eucaryotes comme la levure de bière, par l'intermédiaire d'un vecteur d'insertion de type phage, virus, plasmide, cosmide (plasmide artificiel d'E. coli contenant le gène cos du phage lambda),
* chez les eucaryotes par mico-injection (à l'aide d'une micropipette et d'un micromanipulateur), électroporation (exposition brève à un courant électrique de très haut voltage de cellules de mammifères ou de plantes en présence d'ADN à insérer), bombardement (fusil à gènes avec des microprojectiles couverts d'ADN, utilisé notamment pour obtenir des maïs transgéniques), agitation ou par l'intermédiaire d'un vecteur d'insertion bactérien (cas d'Agrobacterium tumefaciens...).

exprimer un gène

l'insertion du vecteur dans la cellule transformée qui se multiplie n'implique pas que le gène inséré soit exprimé. On utilise des vecteurs d'expression qui sont souvent des dérivés du plasmide pBR322 d'E. coli (voir exercice) qui contient les signaux nécessaires à la transcription et à la traduction.

séparer-séquencer

La méthode diffère totalement selon la longueur de la molécule d'ADN que l'on veut séquencer.

  • la cartographie de restriction : l'action d'une (ou de plusieurs) enzyme(s) de restriction sur des molécules d'ADN données fournit un ensemble de fragments de tailles variées qui dépend de la séquence de l'ADN coupé. Les fragments (dits "fragments de restriction" d'une taille de quelques milliers à quelques dizaines de milliers de paires de nucléotides) peuvent être séparés et leur taille évaluée. Ce qui permet, par comparaison de l'action de plusieurs enzymes de restriction, l'établissement de ce que l'on appelle une carte de restriction. On peut donc penser que deux cellules possédant la même information génétique auront exactement la même carte de restriction. De la même manière, deux cellules de fonction identique mais prise chez deux individus différents, sont supposées avoir des cartes de restriction différentes mais voisines.

  • l'électrophorèse sur gel : le gel de polyacrylamide permet de séparer des molécules d'ADN de moins de 500 nucléotides qui ne différent que par un seul nucléotide. On utilise des gels d'agarose pour des molécules de plus grande taille et enfin la méthode d'électrophorèse sur gel d'agarose en champ pulsé pour des molécules d'ADN de très grande taille (millions de paires de nucléotides). La coloration des fragments d'ADN est réalisée soit au bromure d'éthidium, fluorescent en lumière ultra-violette lorsqu'il est lié à l'ADN, ou le 32P radioactif (de type béta) que l'on doit auparavant incorporer aux groupements phosphate de la molécule d'ADN ce qui implique sa réplication...

  • la méthode chimique et la méthode enzymatique de séquencage rapide de l'ADN ; la méthode chimique combine un marquage par le 32P radioactif, une destruction modérée de l'une des 4 bases, et une séparation par électrophorèse sur gel. La méthode enzymatique repose sur l'utilisation de l'ADN à séquencer comme matrice pour réaliser une copie marquée (radioactivement ou chimiquement) de la séquence recherchée, suivie par un ajout contrôlé de nucléotides un par un et une séparation sur gel de chaque fragment en cours d'allongement. C'est cette dernière méthode qui est surtout utilisée dans les automates (voir par exemple Biologie moléculaire de la cellule, pp297-298).

génie génétique

  1. isolement "du" gène, en fait d'une séquence d'ADN (essentiellement représentée par l'utilisation des enzymes de restriction... voir ci-dessus); cette étape peut nécessiter l'utilisation de transcriptase inverse où de cloner le gène à partir du génome entier (ce qui est la méthode habituelle et qui permet d'obtenir une banque génomique qui contient des vecteurs recombinants (voir ci-dessous) de tous les gènes d'un organisme) ou partiel...

  2. insertion dans un vecteur d'insertion (virus ou plasmide bactérien) qui est aussi appelé "chimère" ou plutôt recombiné (ADN recombinant, vecteur recombinant) nécessitant l'utilisation des enzymes de type ligases...

  3. transformation (ou transfection ou encore transduction...) d'un hôte en vecteur de multiplication par insertion du vecteur modifié (phase d'amplification) associée aux techniques de criblage (isolement) des transformants...

  4. expression de la séquence insérée et amplifiée




Exercices d'application: construire une carte de restriction simplifiée
Belin n°8 p 164 (le texte du sujet est erroné, voir ci-dessous les questions corrigées); Nathan TP1, 2, p 76 et exercice n°1 p 85

Un plasmide d'une souche bactérienne (B1) circulaire (que l'on nommera pB1) contient un seul site de restriction de l'enzyme HindIII. Ce site est situé dans le gène de résistance à la tétracycline (un antibiotique) que porte de plasmide.
On coupe le génome de la drosophile à l'aide de la même enzyme de restriction HindIII. On obtient des fragments qui sont insérés (voir génie génétique) dans des vecteurs d'insertion qui sont justement les plasmides pB1 de la même souche bactérienne (B1). Par des techniques appropriés on crible les transformants ayant intégré un fragment d'ADN de la drosophile. On obtient ainsi un ensemble de souches de bactéries B1* transformées dont leur plasmide pB1* a intégré tel ou tel gène drosophilien. C'est ce que l'on appelle une banque d'ADN. En fait il s'agit d'une banque de clones de souches bactériennes B1* (recombinées) dont le plasmide recombiné (pB1*) contient tel ou tel gène de drosophile.
Le clone n°15 contient par exemple un gène de drosophile inséré. On analyse l'ADN de ce plasmide transformé (pB1*) par digestion enzymatique en présence des enzymes de restriction Hind III et/ou EcoRV. Les résultats sont présentés ci-dessous, le témoin étant le plasmide pB1 non recombiné.



Questions:

1) Définir un clone et une banque génomique.

2) Expliquer l'importance de l'unicité et de la localisation du site de restriction d'Hind III

3) Construire la carte de restriction de pB1 et de pB1* du clone 15 pour les deux enzymes de restriction utilisées ici.




Corrigé
1) Un clone est un ensemble de cellules identiques génétiquement (voir page sur les manipulations cellulaires). Ici le terme désigne plus particulièrement une population bactérienne issue d'une cellule unique, génétiquement transformée. Un clone est donc, dans cet exemple, une souche bactérienne transformée (B1*) présentant un gène de drosophile intégré à son plasmide pB1*. Chaque clone possède un gène identifié de drosophile. L'ensemble des clones constitue une banque génomique plasmidique de la drosophile. La banque n'est complète que si l'on a l'intégralité du génome de l'organisme étudié inséré, gène par gène, dans un très grand nombre de clones. Ce qui suppose de connaître tous les gènes de l'organisme... ce qui est pour le moins rare.
D'une façon plus générale, une banque d'ADN pourrait être définie comme le lieu où l'on conserve des organismes ou des parties d'organismes génétiquement identifiés et transformés.

2) Un plasmide qui présente plusieurs sites de coupures par une enzyme de restriction (plusieurs sites de restriction pour une même enzyme) donnera plusieurs petits fragments d'ADN sans que l'on puisse insérer un gène en récupérant un plasmide complet et circulaire. La localisation du site de restriction au sein d'un gène marqueur (ici un gène de resistance à un antibiotique) permet de sélectionner les souches ayant inséré le gène de drosophile (c'est le criblage des transformants). En effet, un plasmide recombiné pB1* (avec un fragment d'ADN de drosophile qui s'est inséré dans son gène de résistance à la tétracycline), a un gène de résistance à la tétracycline altéré (non fonctionnel). La souche transformée (B1*) devient donc sensible à la tétracycline. Il suffit donc, SUR UNE RÉPLIQUE (bien sûr car sinon on détruit la souche que l'on recherche), de faire agir la tétracycline: la souche sensible (détruite ou dont la croissance est réduite) est la souche transformée qu'il suffit alors de récupérer au niveau de la culture ayant permis de faire la réplique (voir illustration ci-dessous).



3)



Il me semble bien difficile de présenter vraiment ces méthodes de façon accessible à un élève de terminale sans faire appel à des notions assez complexes sur la structure du génome et surtout sur la régulation de son expression. Il me paraît dérisoire de vouloir expliquer une technique d'hybridation de sonde radioactive alors qu'un élève de TS ne sait même pas que les gènes eucaryotes sont morcelés en introns et exons. Certains manuels scolaires ont d'ailleurs franchi le pas, ce que je ne fais pas étant donné que la complexité du génome (et les interactions entre gènes) ne me semble pas changer fondamentalement le paradigme mendélien-morganien.

Depuis près d'un demi-siécle de nombreuses voix de scientifiques, de philosophes...de renom se sont levées pour dénoncer l'inflation des résultats expérimentaux sans enjeu théorique. A quoi sert-il d'accumuler des données si l'on a pas fait l'effort de théoriser la recherche ? La recherche en biologie moléculaire travaille sur le même paradigme depuis plus de 50 ans. Il est temps que cela change.
Pour ce qui est des motifs du lobby de la biologie moléculaire, en France particulièrement, il est clair que les enjeux sont politiques, et économiques. S'y ajoutent probablement des enjeux philosophiques et éthiques.
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