Bulletin des BioTechnologies Janvier 2003








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Les Productions Microbiennes


71. On trouvera dans S Donadio et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 60 (DEC02) 77-80, une analyse des apports potentiels de la première séquence complète publiée d'un Streptomyces, S.coelicolor. Il en existe d'autres, mais elle reste propriété privée.

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72. Le maintien de la stabilité chromosomique chez la levure Saccharomyces cerevisiae est assurée par la kinase cycline-dépendante Cdc28. AA Kitazono et al.; Journal of Biological Chemistry 277 (13DEC02) 48627-48634. C'est un régulateur connu de la mitose. C'est donc également un surveillant de la mitose (plus exactement du bon fonctionnement du fuseau. Cak1, qui est une kinase connue pour activer Cdc28 par phosphorylation doit se lier à l'extrémité C-terminale de Cdc28 pour jouer un rôle non catalytique, dans ce cas, en stabilisant Cdc28. AA Kitazono et al.; Journal of Biological Chemistry 277 (13DEC02) 48627-48634.

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73. Les réarrangements des génomes (amplifications et délétions) sont souvent observés chez des S.cerevisiae sous une pression de sélection forte et prolongée. Huit souches ont été isolées après 100 à 500 générations en chemostat glucose-limitant. Six des huit souches étaient aneuploïdes. La plupart des régions aneuploïdes dérivaient de translocations, dont trois étaient situées au voisinage de CIT1, codant la citrate synthase du cycle tricarboxylique. Trois souches possédaient une amplification dans une région codant, en particulier des transporteurs d'hexoses à haute affinité. Tous ces réarrangements sont bordés par des séquences de type transposon. MJ Dunham et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (10DEC02) 16144–16149.

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74. Des chercheurs de Miyazaki décrivent un procédé de transformation d'Escherichia coli grâce à des fibres de chrysotile. Voilà un nouveau débouché pour l'amiante de Jussieu. N Yoshida et al.; Applied Microbiology & Biotechnology 60 (DEC02) 461-468.

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75. L'effet de position, souvent invoqué quand quelque chose ne se passe pas comme prévu dans un schéma d'expression, stipule que cela est dû au fait qu'un transgène s'est inséré dans une région où les gènes sont régulièrement réprimés. La parade fréquente est d'isoler le transgène avec des isolateurs.

Le phénomène est suffisamment général pour qu'on ait estimé que c'est un système conservé évolutivement. Il n'en est rien. Le mécanisme est même différent entre les deux levures Saccharomyces cerevisiae et Kluyveromyces lactis. JO Søstrand et al.; Eukaryotic Cell 1 (AUG02) 548-557). Ce que l'on appelle les "silencers" sont différents chez les deux levures. On invoque la compaction de la chromatine à la suite de déméthylations et désacétylations. Les "silencers" sont de courtes séquences que le groupe suédois compare à des héliports flanquant les séquences à expression réprimée et où atterrissent les protéines impliquées dans le "silencing". C'est le cas de Rap1 chez S.cerevisiae, mais aussi d'autres protéines, SIR (Silent Information Regulator), qui compacteraient encore plus la chromatine. Le groupe a étudié les sites cryptiques du type sexuel chez K.lactis. Ils y ont identifié la protéine Reb1p qui se lie aux "silencers" et amorce la répression de l'expression des gènes intercalés entre elles. Ces protéines n'ont rien à voir avec celle des sites HML et HMR où sont localisées les séquences muettes a et  des types sexuels de S.cerevisiae.

Les "silencers" fonctionnent d'ailleurs de façons légèrement différentes chez les deux levures alors que les séquences du type sexuel sont, en fait très voisines. Quant aux protéines SIR, elles sont également très semblables et fonctionnent de façon croisée dans les deux levures. Elles seraient, d'ailleurs, impliquées dans des désacétylations. Voir le commentaire de Holzman; ASM News 68 (OCT02) 484.

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76. La production d'éthanol par la souche KO11 d'Escherichia coli à partir de xylose a été obtenue (et brevetée) par le groupe de LO Ingram à Gainesville, en introduisant la voie d'utilisation du xylose de Zymomonas mobilis. La citrate synthase, est un enzyme clé dans la répartition du carbone en faveur des synthèses chez E.coli, et c'est elle qui limite la production de biomasse chez la souche KO11. Elle est inhibée allostériquement par de hauts niveaux de NADH, ce qui est typique des fermentations. Le groupe a donc implanté une citrate synthase (citZ) de Bacillus subtilis insensible au NADH. On peut, de plus, jouer sur les pools de substrats, oxaloacétate et acétyl coenzyme A (acetyl-CoA).

Le groupe décrit, à présent comment améliorer cette production en jouant sur la répartition du carbone entre éthanol et biomasse. SA Underwood et al.; Applied and Environmental Microbiology 68 (DEC02) 6263-6272. On trouvera un bon schéma récapitulatif de cette production. Les auteurs supplémentent le milieu avec acétate, pyruvate et acétaldéhyde, ce qui prolonge la phase dite de croissance. Bien que pyruvate et acétaldéhyde soient rapidement métabolisés, leur effet perdure dans la culture.

Ces deux additifs accroissent la production d'acétate extra-cellulaire qui contribue à l'accumulation d'acétyl-CoA. On peut obtenir le même résultat en inactivant l'acétate kinase (ackA), ce qui économise l'acétyl-CoA au bénéfice de la production de biomasse. L'inactivation de l'alcool-aldéhyde déshydrogénase (adhE), qui se sert de l'acétyl-CoA comme accepteur d'électrons n'apporte rien à la croissance, ce qui confirme que cette enzyme n'a qu'un rôle mineur dans la production d'éthanol. La croissance de la souche KO11 sur xylose semble plus limitée par la répartition des squelettes carbonés vers les biosynthèses plus que par l'ATP. Les modifications dans la production et la consommation d'acétyl-CoA semble une voie prometteuse pour le pilotage du métabolisme. Ce qui expliquerait qu'une réorientation relativement modeste du pyruvate de la fermentation vers les synthèses de biomasse améliore sensiblement la production d'éthanol à partir du xylose. Ceci ne gêne en rien la fermentation, bien au contraire, car la fermentation d'un xylose à 9,1% dans 1% de solubles de distillation de maïs se passe en 72 heures au lieu de 96 heures.

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77. On trouvera dans S Srinivasan et al.; Applied & Environmental Microbiology 68 (DEC02) 5925-5932, la description d'une système de production de protéines hétérologues par Ralstonia eutropha (alias Alcaligenes eutrophus). On éviterait ainsi la production assez fréquente d'inclusions dans les systèmes classiques basés sur E.coli, surtout quand on utilise des promoteurs forts.

Le choix de Ralstonia est, en fait, une façon d'utiliser les efforts déployés pour en faire un producteur acceptable de polyhydoxybutyrate (PHB). L'organisme a été complètement séquencé (http://jgi.doe.gov/JGI_microbial/html/ralstonia/ralston_homepage. htm). On sait la manipuler en hautes densités cellulaires (jusqu'à 230g/L.), et dans de très gros fermenteurs (plusieurs centaines de milliers de litres) ce qui est un plus, car E.coli, à cette échelle, est difficile à manipuler (transferts d'oxygènes, etc…) et tend à produire de nombreux acides organiques parasites. Le fait que Ralstonia (contrairement à E.coli) utilise de préférence la voie d'Entner-Doudoroff pour utiliser les hexoses entraîne un rapport NADPH/NADH supérieur qui permet des biosynthèses plus efficaces car le pouvoir réducteur engendré inévitablement peut être purgé dans la production du PHB en l'absence de l'oxygène, ce qui permet de limiter l'oxygénation du milieu, contrairement à ce qui se passe pour E.coli et les Bacillus qui, en limitation d'oxygène produisent des acides organiques (comme nous lors des crampes musculaires) pour évacuer les électrons.

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78. Beaucoup de microorganismes possèdent une structure de surface (extérieure à la paroi), appelée couche S, qui est formée d'une sous-unité protéique (ou glycoprotéique) disposée régulièrement.

Les protéines de la couche S peuvent représenter 10 à 15% des protéines totales de la cellule. Les gènes de la protéine de la couche S ont été clonés à partir de Lactobacillus brevis L.acidophilus, L.helveticus et L.crispatus. Ce sont des protéines de très faible taille (43 à 46 kDa). Un domaine fortement conservé de la partie C-terminale permet l'ancrage de la couche sur la paroi cellulaire chez L.acidophilus. Chez L.brevis, cette partie est fortement hétérogène et on n'y trouve pas le domaine d'ancrage. Le gène slpA de cette protéine de L.brevis est exprimé à partir de deux promoteurs adjacents et son expression permet une très forte production et une sécrétion de protéines hétérologues chez divers Lactococcus et Lactobacillus. Il est donc possible de faire exprimer, dans la couche S de ces bactéries, un épitope (antigénique par exemple) d'une protéine en fusionnant le gène de cette protéine avec slpA. C'est ce qu'ont réalisé des chercheurs finlandais. S Åvall-Jääskeläinen et al.; Applied & Environmental Microbiology 68 (DEC02) 5943-5951.

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79. Les flux métaboliques dans cinq générations successives de Corynebacterium glutamicum productrices de lysine (450 000 tonnes par an) obtenues par mutation au hasard et sélection ont été suivis par des chercheurs de Saarbrücken. L'optimisation de la production de lysine a été accompagnée par une réorientation de ces flux. C'est la voie des pentoses phosphates qui a été favorisée de façon continue. Par ailleurs, la régulation des carboxylations des composés en C3 et des décarboxylations en C4 est essentiellement en cause. Le flux relatif par l'isocitrate déshydrogénase chute de 82,7% chez la souche de départ à 59,9% chez les souches sélectionnées pour la surproduction de lysine. La demande de NADPH, est augmentée de 109 à 172% du fait de la production accrue de lysine, mais la production de NADPH, qui reste relativement constante, devient un facteur limitant. Néanmoins les mesures indiquent que la bactérie est remarquablement équipée pour balancer cette production entre voie des pentoses phosphates et tricarboxylique (cycle de Krebs). Cet équilibre varie, en réalité, d'une souche à une autre.

L'intérêt de cet article est dans l'utilisation d'un profil généalogique des réseaux de régulations. De telles données doivent exister dans les firmes productrices, mais elles se gardent bien de les divulguer.

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