Rapporteurs : Professeur Bruno levy (Nancy)








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Université du Droit et de la Santé – Lille II

Ecole Doctorale Biologie - Santé de Lille

THESE

Pour l’obtention du grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE LILLE II

Discipline : Réanimation Médicale

Présentée et soutenue publiquement

Par

Laurent ROBRIQUET

Le 22 décembre 2008

Modulation de l’équilibre hydrique pulmonaire au cours de l’agression pulmonaire aiguë infectieuse

Membres du Jury :

Président : Professeur François FOURRIER (Lille)

Rapporteurs : Professeur Bruno LEVY (Nancy)

Docteur Christian JAYR (Paris)

Examinateur : Professeur Bertrand GUIDET (Paris)

Directeur de thèse : Professeur Benoît GUERY (Lille)

Je remercie sincèrement,

Ma famille sans qui je n’aurais pu mener ce travail.

Le professeur Benoît Guery qui m’a donné l’opportunité de travailler dans des domaines passionnants et fait découvrir le monde de la recherche.

Le professeur Claude Chopin qui a guidé mes premiers pas dans le monde de la Réanimation.

Le professeur François Fourrier pour avoir accepté d’être président du jury.

Les rapporteurs de cette thèse, le Professeur Bruno Levy et le Docteur Christian Jayr, pour avoir accepté d’expertiser ce travail.

Le Professeur Bertrand Guidet qui nous a fait l’honneur d’apporter un éclairage critique à cette thèse.

Le Professeur Michael Matthay qui m’a accueilli avec enthousiasme au sein de son laboratoire à San Francisco.

Mes collègues et amis de la Réanimation Polyvalente à Lille qui m’ont permis de passer du temps au laboratoire.

TABLE DES MATIERES

Pages

Liste des abréviations 7

Résumé 12

I) Introduction 14

1) revue de la littérature

A) Agression pulmonaire aiguë et syndrome de détresse respiratoire aigu 15

1) Définitions 15

2) Epidémiologie 15

3) Facteurs de risque 16

4) Physiopathologie 17

4.1) Agression de la barrière alvéolo-capillaire 17

4.1.1) Agression endothéliale 17

4.1.2) Agression épithéliale 17

4.2) Agression pulmonaire dépendante des PNN 18

4.2.1) Séquestration des PNN 18

4.2.2) Migration transendothéliale des PNN 19

4.2.3) Rôle des molécules d’adhésion 19

4.2.3.1) Sélectines 19

4.2.3.2) Intégrines 19

4.2.3.3) Chémokines 20

4.3) Sécrétion pulmonaire de médiateurs inflammatoires 21

4.3.1) IL-1β 21

4.3.2) TNF-α 21

4.3.3) IL-10 22

4.3.4) MIF 22

4.3.5) HMG-1 23

4.4) Agents lésionnels incriminés 23

4.4.1) Stress radicalaire 23

4.4.2) Protéases 25

4.4.3) Médiateurs lipidiques 26

4.4.4) Apoptose 27

4.5) Résolution de l’agression pulmonaire aiguë et du SDRA 27

B) Rôle de la cascade de la coagulation 29

1) Généralités sur l’hémostase normale 29

1.1) Hémostase primaire 29

1.1.1) Vasoconstriction réflexe 29

1.1.2) Sécrétion plaquettaire 29

1.2) Schéma général de la coagulation 29

1.3) Régulation de la coagulation plasmatique 31

1.3.1) Antithrombine 31

1.3.2) TFPI 32

1.3.3) PC 34

1.4) La fibrinolyse et les inhibiteurs de la fibrinolyse 35

2) La coagulation au cours de l’agression pulmonaire aiguë 37

2.1) Initiation de la coagulation 37

2.1.1) Rôle de l’épithélium alvéolaire 37

2.1.2) Modulation du facteur tissulaire 39

2.2) Propagation de la coagulation 39

2.2.1) Antithrombine 39

2.2.2) Protéine C 40

2.3) La fibrinolyse 44

3) Interactions entre l’inflammation et l’hémostase 46

4) Conséquences de l’altération de la coagulation 48

C) La résorption de l’œdème pulmonaire 50

1) Introduction 50

2) Mécanisme de base de la résorption de l’œdème pulmonaire 50

2.1) transport actif de sodium : la clairance liquidienne alvéolaire 51

2.2) Surface d’échange pulmonaire 51

2.3) Les cellules alvéolaires de type II 52

2.4) Les cellules alvéolaires de type I 54

2.5) Etudes in vivo pour le transport actif de sodium 54

2.6) Régulation dépendante des catécholamines 55

2.7) Rôle du canal CFTR 56

2.8) Régulation indépendante des catécholamines 57

2.9) Rôle de l’environnement lipidique 57

3) Transport liquidien alvéolaire en conditions pathologiques 58

3.1) Etudes expérimentales 58

3.1.1) Infection bactérienne et inflammation 58

3.1.2) Hypoxie 60

3.1.3) La ventilation mécanique 61

3.1.4) La coagulation 61

3.1.5) Stimulation pharmacologique 62

3.1.6) Thérapie génique 64

3.2) Etudes cliniques 64

3.2.1) Résolution de l’œdème pulmonaire hydrostatique 65

3.2.2) Résolution de l’œdème pulmonaire lésionnel 65

3.2.3) Stimulation pharmacologique 66

2) Plan de l’étude et objectifs du travail 68

II) Travaux personnels 69

A) Matériels et méthodes 70

1) Animaux 70

2) Traceurs radioactifs 70

3) Agents chimiques et réactifs 70

4) Souches bactériennes et conditions de culture 71

4.1) P. aeruginosa 71

4.2) E. coli 71

5) Charge bactérienne pulmonaire 71

6) Instillation intratrachéale 72

6.1) Instillation intratrachéale chez le rat 72

6.2) Instillation intratrachéale chez la souris 72

7) Administration intraveineuse de la rhPCa chez le rat 72

8) Préparations chirurgicales 73

9) Paramètres mesurés 75

9.1) Evaluation de la perméabilité de la barrière alvéolo-capillaire 75

9.1.1) Eau extravasculaire pulmonaire 75

9.1.2) Fuite protéique bidirectionnelle chez le rat 76

9.1.3) Perméabilité vasculaire pulmonaire chez la souris 77

9.2) Mouvements liquidiens alvéolaires et pulmonaires 77

9.2.1) Clairance liquidienne alvéolaire in vivo 77

9.2.2) Clairance liquidienne alvéolaire in situ 79

10) Recueil du LBA et cytologie 80

11) Mesures des paramètres de la coagulation 81

12) Mesures des cytokines 81

13) Mesures des catécholamines plasmatiques 82

14) Histologie 82

B) Protocoles expérimentaux 82

1) Evaluation de la rhPCa sur l’équilibre hydrique pulmonaire 82

2) Evaluation du tonus β-adrénergique 83

2.1) Inhibition du tonus β-adrénergique endogène 83

2.2) Equilibre hydrique pulmonaire au cours de la stimulation 84

β2-adrénergique exogène

C) Résultats 85

III) Discussion 107

A) Effets de la rhPCa au cours de l’agression pulmonaire aiguë induite par Pa 108

B) Implication du tonus adrénergique sur l’équilibre hydrique pulmonaire 113

C) Stimulation β2-adrénergique exogène au cours de la pneumopathie aiguë à Pa 118

IV) Conclusions et perspectives 120

V) Collaborations 123

VII) Références bibliographiques 125

VIII) Articles 142

Liste des abréviations

ADN Acide désoxyribonucléique

AMPc Adénosine monophosphate cyclique

ARN Acide ribodésoxynucléique

AT III Antithrombine III

ATP Adénosine triphosphate

C4bBP C4b binding protein

CD18 Cluster of differentiation 18

CFTR Cystic fibrosis transmembrane conductance

CFU Unité formant colonie

CIVD Coagulation intra-vasculaire disséminée

CLA Clairance liquidienne alvéolaire

CLP Clairance liquidienne pulmonaire

CREB cAMP response element binding protein

DAG Diacylglycerol

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

EPRC Endothelial cell PC receptor

ERK Extracellular signal-regulated kinase

FT Facteur tissulaire

HGF Hepatocyte growth factor

ICAM Intercellular adhesion molecule

IFN Interferon

IL Interleukin

IP3 Inositol triphosphate

KGF Keratinocyte growth factor

LBA Lavage bronchoalvéolaire

LPS Lipopolysaccharide

MIF Macrophage migration inhibitory factor

MIP Macrophage inflammatory protein

MMP Matrix metalloproteinases

NFkB Nuclear factor-kappa B

Pa P. aeruginosa

PA Plaminogen activator

PAF Platelet activating factor

PAI-1 Plasminogen activator inhibitor-1

PAR Protease activated receptor

PCa Protéine C activée

PGI2 Prostaglandine I2

PI Phosphatidylinositol

PKA cAMP-dependent protéine kinase

PNN Polynucléaires neutrophiles

PS Protéine S

RNS Reactive nitrogen species

ROS Reactive oxygen species

SDRA Syndrome de détresse respiratoire aigu

SSI Sérum salé isotonique

TAFI Thrombin activable fibrinolysis inhibitor

TAT Thrombine antithrombine

TFPI TF pathway inhibitor

TIMP Tissue inhibitors of metalloproteinases

TM thrombomoduline

TNF-α Tumor necrosis factor alpha

t-PA Tissue plasminogen activator

u-PA Urokinase plasminogen activator

VCAM Vascular cell adhesion molecule

VEGF Vascular endothelial growth factor

VLA Very late antigen

vWF Facteur von Willebrand

Ce travail réalisé d’une part à l’université de Lille II, à la faculté de Médecine et d’autre part à l’université de San Francisco a donné lieu aux publications et communications suivantes :

Publications :

Direct visual instillation as a method for efficient delivery of fluid into the distal airspaces of anesthetized mice. Su X, Looney M, Robriquet L, Fang X, Matthay MA. Exp Lung Res 2004;30:479-493

Alveolar epithelium: role in lung fluid balance and acute lung injury. Matthay MA, Robriquet L, Fang X. Proc Am Thorac Soc 2005 ;2(3) :206-13

Intravenous administration of activated protein C in Pseudomonas-induced lung injury: impact on lung fluid balance and the inflammatory response. Robriquet L, Collet F, Tournoy A, Prangère T, Neviere R, Fourrier F, Guery B. Respir Res 2006 ; 22 :7-41

Protective effect of endogenous beta-adrenergic tone on lung fluid balance in acute bacterial pneumonia in mice. Su X, Robriquet L, Folkesson HG, Matthay MA. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2006;290:L769-L776

Communications à des congrès internationaux :

Effect of endogenous beta-adrenergic inhibition on lung fluid balance in acute E. coli pneumonia in mice. Robriquet L, Su X, Folkesson HG, Frank JA, Matthay MA. American Thoracic Society International Conference, 2004.

IL-1 is an important mediator of increased endothelial permeability and alveolar epithelial injury in experimental ventilator-induced lung injury. Frank JA, McAuley DF, Pittet JF, Gutierrez J, Robriquet L, Roux J, Dobbs L, Matthay MA. American Thoracic Society International Conference, 2004.

Effect of pharmacological inhibition of chloride transport on lung fluid balance in acute E. coli pneumonia in mice. Robriquet L, Song Y, Folkesson HG, Frank JA, Verkman AS, Matthay MA. Abstract ISICEM 2005

Effect of -adrenergic stimulation on lung fluid balance in acute P. aeruginosa pneumonia in rats. Robriquet L, Chopin C, Guery B. American Thoracic Society International Conference, Abstract 2006

Communications à des congrès nationaux :

Effets de l’inhibition du transport de chlore sur la pneumonie aiguë à E. coli chez la souris. Robriquet L, Franke JA, Verkman AS, Matthay MA. Congrés de la société de Réanimation de Langue Française, abstract 2005

Effets de l’administration des 2 agonistes sur la pneumonie aiguë à P. Aeruginosa chez le rat. Robriquet L, Chopin C, Guery B. Congrés de la société de Réanimation de Langue Française, abstract 2006

Résumé :

L’agression pulmonaire aiguë et le syndrome de détresse respiratoire aigu (SDRA) sont caractérisés par une augmentation de la perméabilité de la barrière alvéolo-capillaire à l’origine de l’exsudation d’un liquide d’œdème riche en protéines conduisant à une altération sévère des échanges gazeux. En dépit des progrès réalisés ces dernières années dans la prise en charge des patients, la mortalité demeure élevée (30-40%) (1). L’agression pulmonaire aiguë est marquée par un état procoagulant et antifibrinolytique à l’origine de dépôts de fibrine et de membranes hyalines dans le poumon distal (2).

La protéine C activée est un important régulateur de la coagulation et exerce des propriétés anti-inflammatoires pulmonaires (3). Ainsi, dans un premier temps, notre travail a consisté à caractériser l’équilibre pulmonaire au cours de l’administration de protéine C activée in vivo sur un modèle murin de pneumopathie aiguë à P. aeruginosa (Pa). Nos résultats ont montré que l’administration de PCa à la phase précoce de l’agression pulmonaire aiguë induite par Pa tendait à augmenter la formation de l’œdème pulmonaire avec une perte de la compartimentalisation de la réponse inflammatoire.

Dans un deuxième temps, nous avons évalué l’équilibre hydrique pulmonaire dépendant du tonus β-adrénergique endogène au cours de la pneumonie aiguë à E. coli. L’inhibition du tonus β-adrénergique endogène induisait une augmentation de l’œdème pulmonaire en diminuant la résorption de l’œdème alvéolaire et en majorant le trouble de perméabilité vasculaire pulmonaire. Enfin, la stimulation β2-adrénergique exogène diminuait l’œdème pulmonaire au décours de la pneumonie à Pa.

Ainsi, des approches pharmacologiques différentes peuvent moduler l’équilibre hydrique pulmonaire au cours des pneumonies aiguës. Les connaissances fondamentales acquises au cours de ce travail de thèse seront directement valorisables par la mise au point de nouvelles stratégies thérapeutiques au cours de l’agression pulmonaire aiguë secondaire à la pneumonie aiguë.

Abstract:

Acute lung injury and acute respiratory distress syndrome (ARDS) are characterized by increased permeability of the alveolar-capillary barrier, resulting in influx of protein-rich edema fluid and consequently impairment in arterial oxygenation. Although mortality has decreased over recent decades, it remains high (30-40%), and pulmonary and non pulmonary morbidity in ARDS survivors is significant (1). Procoagulant-antifibrinolysis imbalance is evident within the distal airspaces of the injured lung, resulting in fibrin and hyaline membrane deposition (2).

The activated protein C pathway is an important regulation of the coagulation system and exerts anti-inflammatory propriety on the distal lung (3). The first aim of our study was to examine the effects of activated protein C on lung fluid balance in the early phase of Pseudomonas aeruginosa (Pa)-induced lung injury. Our results have showed that administration of activated protein C in the early stage of Pa-induced lung injury tended to increase lung edema formation with a loss of the inflammatory response compartmentalization.

The second aim was to evaluate the effect of endogenous β-adrenergic tone on lung fluid balance in acute E. coli pneumonia in mice. β-adrenoceptor inhibition worsened pulmonary edema by both increasing lung vascular permeability and decreasing alveolar fluid clearance. Finally, exogenous β2-stimulation attenuated the degree of pulmonary edema following Pa-induced lung injury.

Thus, different pharmacological approaches can modulate lung fluid balance in acute pneumonia. These new fundamental mechanisms could be useful to develop new therapeutic strategies in pneumonia induced acute lung injury.
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