Thèse pour l’obtention du grade de docteur de l’université








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université joseph fourier

faculté de médecine de grenoble


Année : 2005 N° D’ORDRE




thèse



pour l’obtention du grade de docteur de l’université
ecole Doctorale Chimie et Sciences du Vivant
(EDCSV ; Option : Biologie Cellulaire)


Evaluation par PCR de l’activité antivirale des inhibiteurs de l’ADN polymérase du Virus d’Epstein-Barr



Présentée par


Mirvat Ballout



Soutenue publiquement le 15 décembre 2005




Directeur de thèse : Professeur Jean-Marie Seigneurin

Co-directeur de thèse : Docteur Patrice Morand


Professeur Jean-Marie Huraux (Paris), rapporteur
Professeur Hélène Peigue-Lafeuille (Clermont-Ferrand), rapporteur

Professeur Max Maurin (Grenoble), examinateur


Professeur Jean-Marie Seigneurin (Grenoble), examinateur




Remerciements




Ce travail a été réalisé dans le laboratoire de Mr le Professeur Jean-Marie Seigneurin qui m’a accueillie dans son laboratoire et encadrée dans son équipe. Je tiens à lui exprimer ma gratitude pour son soutien et son encouragement et la confiance qu’il m’a accordée tout au long de ce travail.
Je remercie vivement Mr le Docteur Patrice Morand pour son aide et son encadrement. Je lui adresse ma profonde reconnaissance pour son écoute, son soutien et pour tous les conseils qu’il m’a apportés.
Je remercie vivement Mme le Professeur Hélène Peigue-Lafeuille et Mr le professeur Jean-Marie Huraux de m’avoir fait l’honneur d’accepter de juger ce travail et d’apporter toutes leurs connaissances et leur expérience sur les herpesvirus.
Je remercie très sincèrement Mr le Professeur Max Maurin de m’avoir fait l’honneur de présider cette thèse.
Je remercie vivement Mme le Dr Raphaële Germi pour sa disponibilité, son aide et son encadrement qui m’a beaucoup apporté.
Je remercie très chaleureusement Odile Genoulaz qui a participé à ce travail, pour sa grande compétence technique et son aide précieuse.
Je remercie très chaleureusement tous les membres du laboratoire de Virologie de l’hôpital Michallon de Grenoble, en particulier Monique Baccard pour son soutien, son écoute et sa gentillesse. Marie-Josette Bourgeat et Geneviève Gui pour leur aide pour les cultures cellulaires. J’exprime toute ma sympathie et mes remerciements pour Samira, Christine, Sylvie, Marion, Virginie, Bénédicte, Anne, Julien, Gérard et Toufik. Je remercie les secrétaires Christiane, Gisèle et Claire pour leur soutien et leur bonne humeur ainsi qu’à tout le reste du personnel du laboratoire pour leur gentillesse, leur soutien à mon égard et pour les moments agréables passés à leur côté.
Une partie de ce travail a été réalisée au laboratoire d’immunologie cellulaire (Centre de transfusion sanguine de Grenoble). Je remercie vivement Mme le Docteur Marie-Christine Jacob et Mme le Docteur Martine Pernollet de m’avoir accueillie dans leurs équipes et de m’avoir apporté leur connaissance dans la cytométrie en flux. Je remercie Mme Sylvie Glaizal et Mme Agnès Colomer pour leur assistance technique et leur gentillesse.

A mon père, tu es toujours auprès de nous et dans notre cœur.
A ma mère, à qui je dois tout. Je te promets nous allons rattraper tout le temps que j’ai passé loin de toi.
A ma sœur Moutia, grâce à ton amour, ton soutien et tes encouragements j’ai pu aller jusqu’au bout.
A ma sœur Widade, ton amour était pour moi un vrai motif pour travailler. Merci.
A mon frère Jihad, à May et leurs enfants. Je vous remercie pour tout ce que vous avez fait pour moi.
A ma sœur Ferial, à Toufik et leurs enfants. Enfin, nous allons pouvoir réaliser nos projets.
A Danielle Renversez, je te remercie du fond du cœur pour ton soutien dans les moments difficiles. Les bons moments que nous avons passés ensemble resteront gravés à jamais dans ma mémoire.
A Françoise et Jean-Paul Missud. Votre accueil chaleureux et exceptionnel m’a beaucoup touché. Je vous remercie énormément.
A Ali Ibrahim. Je te remercie pour ton aide et ton soutien.
A mes amies et amis avec lesquels j’ai partagé les bons et mauvais moments. Pardonnez moi de ne pas vous citer toutes et tous.

A mon père
A ma mère
A Moutia et Widade
Ce travail vous est dédié avec tout mon amour.

Abréviations


6-Fam : 6-carboxyfluorescéine

7-AAD : 7-Amino-actinomycine

ACV : [9-(2-hydroxyethoxymethyl)guanine] (aciclovir)

BDCRB : (2-bromo-5,6-dichloro-1-(beta-D-ribofuranosyl)benzimidazole)

BVDU : (E)-5-(2-bromovinyl)-2'-deoxyuridine (brivudine)

b.w : body weight

CAEBV : chronic Active EBV Infection

CFS : chronic fatigue syndrome

CTL : les cellules T cytotoxiques

DMSO : diméthyle sulfoxide

EA : Early Antigen

EBERs : Epstein-Barr Encoded small RNAs

EBNAs : protéines nucléaires

EBV : Epstein-Barr virus

EGCG : (_)-Epigallocatechin gallate

ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Et-PFA : éthyle PFA

FITC : isothiocyanate de fluorescéine

FRET : Fluorescence Resonance Energy Tranfer

FSC : Forward Scatter

GCV : [9-(1,3-dihydoxy-2-propoxyméhyl)guanine] (ganciclovir)

Gp : Glycoprotéine

HAART : highly active antiretroviral therapy

HCMV : Human Cytomegalovirus

HHV-4 : herpesvirus humain de type 4

hPBGD : porphobilinogène désaminase

HPMPC : (S)-1-(3-hydroxy-2-phosphonylméhoxypropyl)cytosine) (cidofovir)

HPMPCpp : cidofovir diphosphate

HSV : Herpes Simplex Virus

IEA : Immediate Early Antigen

IF : immunofluorescence

IR (Internal Repeats) : répétitions internes

KDa : kilodalton

LCL : lignées lymphoblastoïdes

LCR : liquide céphalo-rachidien

LC-Red 640 : LightCycler-Red-640-N-hydroxy-succinimide ester

LC-Red 705 : LightCycler-Red-705-Phosphoramitide

LED : Light-Emitting Diode

LMNH : Lymphomes Malins Non-Hodgkiniens

LMPs : protéines membranaires

ND : non donné

NDP : nucleoside diphosphate

NK : Natural Killer

NPC : carcinome Indifférencié du Nasopharynx 

OHL : leucoplasie orale chevelue

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

ORF : Open Reading Frame

Ori-Lyt : origine de réplication lytique 

Ori-P : origine de réplication plasmidique

PAA : Phosphonoacetic Acid

Pb : paires de bases

PBS : tampon phosphate

PCR : Polymerase Chain Reaction

PCV : [9-(4-hydroxy-3-hydroxyméthylbut-1-yl)guanine (penciclovir)

PEL : primary effusion lymphoma

PK : Protein Kinase

PMA : Phorbol 12-myristate, 13-acetate

PMEA : [(phosphonylméthoxy)éthyl]adénine (adéfovir)

PMEApp : adéfovir diphosphate

PNMP : pyrimidine nucleoside monophosphate

PPi : Pyrophosphate

PTLD : Post Transplant Lymphoproliferative Disease

RT-PCR : reverse transcriptase Polymerase Chain Reaction

SH2D1A : SH2 domain protein 1A

SI : indice de sélectivité

SIDA : syndrome d’immunodéficience acquise

SLAM : signaling lymphocyte activation molecule

S-oligos : oligodésoxynucléotides

SSC : Side Scatter

Tamra : 6-carboxytetramethylrhodamine

THC : delta-9 tetrahydrocannabinol

TK : Thymidine Kinase

TPA : 1, 2 tetradecanoylphorbol 13-acetate

TR (Terminal Repeats) : répétitions terminales

TSA : trichostatin A

UL (Unique Long) : unique long

US (Unique Short) : unique court

VCA : Viral Capsid Antigen

VIH : virus de l’immunodéficience humaine

VZV : Varicella Zoster Virus

WB : Western Blot

XLP : syndrome lymphoprolifératif lié au chromosome X


Sommaire

université joseph fourier 1

faculté de médecine de grenoble 1

Année : 2005 N° D’ORDRE 1

Mirvat Ballout 1

Soutenue publiquement le 15 décembre 2005 1

Professeur Max Maurin (Grenoble), examinateur 1

Remerciements 3

Principaux aspects biologiques de l’infection par le virus d’Epstein-Barr 15

Introduction 16

I.Découverte de l’EBV et de son rôle 17

II.Propriétés du virus 17

1.Classification et structure 17

2.Le génome de l’EBV 18

3.Gènes et protéines de l’EBV 20

a.Protéines de la latence 20

b.Protéines du cycle productif lytique 21

4.Réplication productive et cycle lytique 22

5.Immortalisation, transformation et lignées lymphoïdes 24

III.Les modes de transmission de l’EBV 25

IV.Les cellules cibles de l’EBV 26

V.La persistance de l’EBV 28

VI.Les maladies causées par l’EBV 30

1.La mononucléose infectieuse 30

2.Le syndrome lymphoprolifératif lié au chromosome X (XLP) ou syndrome de Purtilo 31

3.L’infection chronique active à EBV (CAEBV) 32

4.La leucoplasie orale chevelue (OHL) 32

VII.Les maladies associées à l’EBV 33

1.Le Lymphome de Burkitt (LB) 33

2.Les syndromes lymphoprolifératifs post-transplantation (PTLD) 34

3.Les Lymphomes Malins Non-Hodgkiniens (LMNH) des patients VIH-positifs 34

4.Le Carcinome Indifférencié du Nasopharynx (NPC) 35

5.La Maladie de Hodgkin (MH) 36

6.Autres tumeurs associées à l’EBV 37

L’évaluation in vitro et in vivo des antiviraux contre le virus d’Epstein-Barr 38

Introduction 39

I.Métabolisme intracellulaire et mécanisme d’action des antiviraux 41

1.Les analogues des nucléosides 41

2.Les analogues des nucléotides 42

3.Les analogues du pyrophosphate 43

II.Méthodes d’évaluation de l’activité des antiviraux 47

1.Les systèmes cellulaires 47

2.Les technologies pour évaluer la diminution de la réplication virale. 54

a.Détection ou quantification de l’ADN viral 54

b.Détection ou quantification des transcrits et antigènes viraux 55

c.Evaluation de l’activité transformante du virus 56

d.Evaluation de l’activité enzymatique des protéines virales. 57

III.Résultats d’évaluation de l’activité des antiviraux in vitro 60

1.Les analogues des nucléosides 60

2.Les analogues nucléotidiques 66

3.Les CycloSal-nucléosides monophosphates 68

Meier et al. (105, 106) ont rapporté pour la première fois l’application du concept CycloSal à un autre analogue nucléosidique, le BVDU (possédant un groupe 3’-OH), résultant en une augmentation de l’activité antivirale. 69

Le 3-Methyl-CycloSal-BVDUMP et une série de dérivés 3’-O-modifiés, ont été synthétisés à partir du BVDU (105, 106). En utilisant toujours le même concept, Meier et al. (104) ont synthétisé et testé l’activité anti-EBV du BVDU et de ses CycloSal phosphate triesters au niveau des cellules P3HR-1 TPA- induites (7 jours, Slot Blot). Les résultats de ces études montrent que le groupe 3’-OH est essentiel pour l’activité antivirale. L’estérification de ce groupe avec de simples acides carboxyliques abolit toute l’activité biologique alors que l’utilisation des esters d’acides -aminés retient l’activité (105). Les 3’-non modifiés CycloSal-BVDUMPs ont une forte activité, contrairement à tous les dérivés 3’-ester qui sont inactifs. Le 5-methoxy-CycloSal-BVDUMP est plus de 90 fois plus actif que le BVDU, alors que les 3’-aminoacyl-CycloSal-BVDUMPs ont une activité qui dépend de l’acide aminé et de la configuration C. Le plus actif de ces derniers est le composé 4f qui est un dérivé L-leucine (104). Dans Meier et al. (105), le 3-methyl-CycloSal-BVDUMP s’est avéré le plus actif parmi les composés testés. Il est plus de 73 fois plus actif (EC50 : 4.1 µM) que le BVDU (EC50 > 300 µM ou 100 µg/mL) qui est complètement inactif, et 2 fois plus actif que le composé de référence l’ACV (EC50 : 7.2 µM ou 1.62 µg/mL). Des valeurs similaires d’EC50 ont été obtenues dans les autres études de Meier et al. (104, 106). 69

Finalement, ces résultats nous montrent qu’avec la méthode CycloSal, il est possible de convertir un composé anti-EBV inactif, le BVDU, en un agent bioactif. Elle permet aussi l’utilisation réussie d’analogues nucléosidiques sans l’intervention d’une TK virale. 69

4.Les analogues du pyrophosphate 70

5.Les autres groupes antiviraux 71

a.Les molécules à activité antivirale 72

b.Les molécules à double activité antivirale et anticancéreuse 75

Les valeurs d’EC50 calculées sont très variables selon les études et dépendent de plusieurs facteurs dont : le système cellulaire, la durée du traitement, la méthodologie et le paramètre viral étudié. Cependant, peu nombreuses sont les études qui se différencient par un seul paramètre nous permettant de tirer des conclusions sur l’effet de ce paramètre sur les résultats obtenus. Pour cela, il est difficile de pouvoir établir une conclusion concernant l’influence de tel ou tel paramètre. Cependant, en plus de la variabilité des conditions expérimentales pour le calcul d’EC50 (ou EC90), l’évaluation de la CC50 a été réalisée parfois sous les mêmes conditions que celles d’EC50 (lignée, durée) alors que dans d’autres cas elle a été mesurée à une durée inférieure et/ou sur un autre système cellulaire. Ceci a aussi entraîné des différences entre les valeurs des SI calculées pour un même composé. D’après ce qui précède, on conclut sur l’importance de la standardisation des essais en culture cellulaire pour faciliter la comparaison des résultats inter-études. 89

IV. Evaluation in vivo de l’activité des antiviraux contre l’EBV 90

Rappel sur les techniques utilisées dans notre étude expérimentale 98

Le système du LightCycler 99

Description du système du LightCycler (Roche) 99

1.Le thermocycleur 100

a.Le carousel 100

b.La chambre thermique 101

2.L’unité optique 101

3.Les formats de fluorescence 102

a.Sondes d’hybridation 102

b.SYBR Green I 104

c.Sondes d’hydrolyse (technologie TaqMan) 106

d.Mesure de la fluorescence 108

4.Analyse des données 108

5.Les avantages du système du LightCycler 108

La cytométrie en flux 110

I.Principe 110

1.Quel type de particules ? 110

2.Les propriétés mesurées 110

3.Dispersion de la lumière (Light Scattering) 111

4.Qu’est ce que le FSC et le SSC ? 111

5.Les différentes parties du cytomètre 112

a.Le système fluidique 112

b.Le système optique 113

c.Le système électronique 114

6.Application de la cytométrie en flux : étude de la viabilité cellulaire et de l’apoptose 114

a.Détection des cellules viables 114

b.Détection des cellules apoptotiques 114

c.Rôle de l’annexine-V 115

d.Double marquage annexine V-PE / 7-AAD 115

Etude expérimentale 118

But du travail 118

I.Matériels et Méthodes 120

1.Les composés antiviraux 120

2.Lignées cellulaires 120

3.Culture cellulaire 120

4.Etude de l'effet des antiviraux sur la viabilité cellulaire et l'apoptose 121

a.Traitement des cellules 121

b.Mesure de la viabilité et de l’apoptose par cytométrie en flux 121

5.Etude de l'effet des antiviraux sur la croissance cellulaire 122

6.Etude de l’effet des antiviraux sur la réplication de l’ADN viral 122

a.Essai d’inhibition du virus 122

b.Extraction de l’ADN total 124

c.PCR en temps réel pour quantifier l’ADN EBV 125

7.Calcul d’EC50  127

8.Etude de l’effet des antiviraux sur la réplication de l’ADN cellulaire 127

a.PCR en temps réel pour quantifier l’ADN cellulaire 127

9.Etude de l’effet des antiviraux sur la transcription virale ( ARNm gp350/220) 128

a.Essai d’inhibition du virus 128

b.Extraction de l’ARN total 129

c.RT-PCR en temps réel pour quantifier l’ARNm gp350/220 de l’EBV 129

10.Etude de l’effet des antiviraux sur la transcription cellulaire ( ARNm hPBGD) 131

a.RT-PCR en temps réel pour quantifier l’ARN cellulaire 131

11.Analyse des données fluorométriques 132

12.Analyse statistique des résultats 132

13.Expression des résultats 132

II.Résultats 133

1.Effets des drogues antivirales sur la viabilité cellulaire 133

2.Effets des drogues antivirales sur l’induction de l’apoptose 137

3.Effets des drogues antivirales sur la croissance cellulaire 138

4.Effets des drogues antivirales sur la réplication de l’ADN EBV 140

5.Effets des drogues antivirales sur la réplication de l’ADN cellulaire 146

6.Effet des drogues antivirales sur l’expression de l’ARNm de la gp350/220 146

7.Effets des drogues antivirales sur l’expression de l’ARN cellulaire 153

Discussion et perspectives 154

Bibliographie 161

Articles publiés ou soumis 183

Article n° 1. 184

Article n° 2. 185

Annexe : Article n° 3. 186

Résumé 187


Principaux aspects biologiques de l’infection par le virus d’Epstein-Barr

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