Présenté à la Société de Biologie réunion du 22 Juin 2007 Summary








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L’embryon d’oursin, le point de surveillance de

l’ADN endommagé de la division cellulaire et les mécanismes à l’origine de la cancérisation.

Robert Bellé1, Ronan Le Bouffant, Julia Morales , Bertrand Cosson, Patrick Cormier

et Odile Mulner-Lorillon.
Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 7150 Mer & Santé; Université Pierre et Marie Curie Paris6, UMR 7150; Equipe Cycle Cellulaire et Développement, Station Biologique, Roscoff, F-29682 France.
(1) Correspondance : Professeur Robert Bellé Station Biologique, place George Teissier, BP 74, 29682 Roscoff Cedex, France. Tel: +33 (0) 2 98 29 23 46; fax: +33 (0) 2 98 29 23 06. e-mail: belle@sbroscoff.fr.
Titre courant : L’embryon d’oursin, modèle d’étude des anomalies du cycle cellulaire

Mots clefs : cycle cellulaire/ point de surveillance /ADN endommagé/glyphosate/cancérisation

Présenté à la Société de Biologie réunion du 22 Juin 2007




Summary



Sea urchin embryo, DNA-damaged cell cycle checkpoint and the mechanisms at the origin of cancer development. Cell division is an essential process for heredity, maintenance and evolution of all living kingdom. The sea urchin early development represents an excellent experimental model for the analysis of cell cycle checkpoint mechanisms since embryonic cells contain a functional DNA-damage checkpoint and since the whole sea urchin genome is available. The DNAdamaged checkpoint is responsible for the arrest in the cell cycle when the DNA is damaged or incorrectly replicated, for the activation of DNA repair mechanism, and for commitment to cell death by apoptosis in the case of failure to repair. New insights in cancer biology lead to two fundamental concepts at the very first origin of cancerogenesis. Cancers originate from dysfunction of the DNA-damaged checkpoints and cancers appear as a result of normal stem cell (NCS) transformation into cancer stem cell (CSC). The second one suggests a new definition of “cancer”, when CSC can be detected, far before any clinical evidence. Since early development starts from the zygote, the primary stem cell, sea urchin early development allows analysis of the early steps of the cancerization process. Although sea urchins don’t develop cancers, the model is alternative and complementary to stem cells which are not of easy isolation, don’t divide in a short time and don’t divide in synchrony. In the field of toxicology and incidence on human health, the sea urchin experimental model allows assessment of cancer risk of molecules alone or in combination long before any epidemiologic evidence. Sea urchin embryos were used for the testing of the worldwide used pesticide Roundup that contains glyphosate as the active herbicide agent and that was shown to activate the DNA-damage checkpoint of the first cell cycle of development. The model therefore allows considerable increase in risk evaluation of new products in the field of cancer and offers a tool for the discovery of molecular markers for early diagnostic in cancer biology. Prevention and early diagnostic are two decisive elements of human cancer therapy.

Résumé



La division cellulaire est essentielle pour l’hérédité, le maintien et l’évolution du monde vivant. Lors d'une lésion de l’ADN au cours de la division cellulaire, les « points de surveillance (=checkpoints) de l’ADN endommagé » exécutent les fonctions d’arrêt du cycle, de la réparation de l’ADN et de l’orientation vers la mort cellulaire par apoptose lorsqu'une réparation est impossible. A l’origine des cancers, deux concepts majeurs se renforcent de jour en jour : les cancers s’initient par un dysfonctionnement des points de surveillance de l’ADN endommagé et les cancers naissent de la transformation de cellules souches « normales » en cellules souches « cancéreuses ». Ce dernier concept modifie la définition même des cancers puisqu’il est démontré qu’une cellule souche « cancéreuse » suffit pour générer la tumeur, bien avant les signes cliniques de la maladie. Le développement précoce de l’oursin représente un excellent modèle expérimental pour appréhender l’analyse du fonctionnement des points de surveillance (checkpoints) du cycle de division et présente l’ensemble des éléments de régulation comme le montrent l’analyse du génome complet et l’existence d’un point de surveillance de l’ADN endommagé tout à fait opérationnel. Le modèle biologique du développement précoce de l’oursin, dont l’oeuf constitue une cellule souche par excellence, permet d’aborder l’étude de l’origine de la cancérisation. Dans le domaine de la toxicologie et de l’implication de nouvelles molécules en matière de santé, le modèle peut être utilisé pour prédire le risque de cancer de molécules ou de combinaisons de molécules, bien avant le moindre signe clinique de la maladie. C’est ainsi que le risque en matière de cancer d’un herbicide d’usage intensif dans le monde, le Rounduple risque en matière de cancer d’un herbicide d’usage intensif dans le monde, le Roundupa, dont le glyphosate est l’élément actif, a pu être démontré. Le modèle expérimental de l’embryon d’oursin permet ainsi de progresser considérablement dans la prévention des cancers par la connaissance des produits à risques et d’envisager de nouvelles formes de diagnostic précoce de la maladie par la mise en évidence de marqueurs moléculaires. Prévention et diagnostic précoce sont deux des éléments décisifs de la lutte contre le cancer.
Note : Roundup est une marque déposée par Monsanto Company, St. Louis, USA

Introduction



Parmi les modèles marins, l’embryon d’oursin est un modèle de choix pour l’étude du cycle cellulaire, de sa régulation et de son dysfonctionnement. L’objet de cette revue est d’exposer les concepts récents en matière de points de surveillance (checkpoints) de la division cellulaire, et de la pathologie essentielle de leur dérégulation dans les mécanismes initiaux conduisant aux cancers. Le modèle biologique de l’embryon d’oursin permet de répondre à des questions fondamentales de la biologie et ouvre des perspectives nouvelles pour comprendre les mécanismes à l’origine des cancers. Il procure des outils moléculaires de prévention des risques et de diagnostic précoce. Les résultats scientifiques étant très abondants dans les différents domaines, nous avons choisi de référencer le texte avec des articles scientifiques de revues, en français s’ils existent, qui relatent les travaux originaux et les connaissances approfondies des fonctionnements des processus biologiques traités. La dernière partie montre l’intérêt du modèle expérimental en matière de toxicologie et de santé humaine, et en particulier les effets et leurs conséquences en matière de santé, de l’herbicide à base de glyphosate, le Roundup, très largement employé dans le monde.
1-La division cellulaire essentielle pour l’hérédité, le maintien et l’évolution du monde vivant.
Une des découvertes biologiques majeures du XIXe siècle réside dans le fait que les cellules constituent les unités structurales et fonctionnelles de tous les organismes vivants et qu’elles prolifèrent par croissance et division. Il est admis que toutes les cellules du monde vivant actuel ont pour origine une cellule ancestrale, apparue il y a environ 0,9 milliard d’années, qui a conduit par un continuum de divisions cellulaires aux organismes actuels dont l’homme (Cavalier-Smith, 2006). L’unité cellulaire du vivant, « ex ovo omnia », (fig.1) sert de
fondement conceptuel à la théorie de Darwin de l’évolution et est la base des grandes découvertes de la biologie cellulaire et de l’embryologie du XXe siècle. La division cellulaire est un processus biologique universel aussi ancien que l’existence des cellules et probablement le mieux conservé au cours de l’évolution. Ainsi, la division cellulaire, qui à chaque cycle de division d’une cellule mère donne naissance à deux cellules filles, se perpétue depuis la cellule ancestrale (fig.1). Elle permet à partir d’une cellule unique, l’oeuf, de former les dix mille milliards de cellules qui constituent un être vivant tel que l’homme (Nasmyth, 2001). Parmi les cellules des organismes parents, les cellules germinales, spermatozoïdes et ovocytes, fusionnent pour la continuité de l’espèce (fig.1). Dans l’organisme humain adulte, un milliard de cellules sont renouvelées quotidiennement par autant de divisions cellulaires pour maintenir l’intégrité de l’individu (Meijer, 2003).

Figure 1. Ex ovo omnia, toute cellule actuelle provient d’une cellule ancestrale.
La division cellulaire permet ainsi la croissance, le développement et le maintien de tous les organismes vivants. Cependant, elle est aussi la source de pathologies graves, dont les cancers, deuxième cause de mortalité dans les populations des pays développés (Kanavos, 2006). Les grandes avancées de la génétique, de la biologie cellulaire, de la biochimie, de la biologie moléculaire et plus récemment de la génomique permettent d’appréhender les mécanismes de la division cellulaire en termes de gènes, de protéines codées par ces gènes, de fonctions cellulaires complexes et de réseaux de régulations dans lesquels les protéines kinases/protéines phosphatases jouent un rôle prépondérant (Alberts et al., 2002). L’étude de ces mécanismes, dont nous ne sommes qu’à l’aube de leur compréhension, est essentielle à notre entendement du monde vivant et à l’analyse de l’influence de l’environnement sur celui-ci. Elle est aussi nécessaire pour la mise en oeuvre de stratégies de prévention et de thérapie pour empêcher ou traiter les pathologies issues des dérèglements des processus biologiques. des dérèglements des processus biologiques.
2-Le cycle cellulaire et les points de surveillance du cycle (=checkpoints).
La division cellulaire est le processus fondamental par lequel une cellule mère donne naissance à deux cellules filles, identiques entre elles et à la cellule mère dont elles dérivent. La réplication des chromosomes (phase S) et leur ségrégation dans chacune des cellules filles (phase M) constituent les deux événements clefs du cycle cellulaire. Ces phases, S (synthèse de l'ADN) et M (mitose), sont séparées par des phases G (gap) : G1 qui précède la phase S et G2 qui prépare la phase M. Les cellules quiescentes, en phase G0, entrent dans un cycle cellulaire sous l’action de facteurs mitogènes. La découverte des concepts fondamentaux de fonctionnement du cycle cellulaire, concrétisée par l’attribution du prix Nobel de physiologie et médecine en 2001 est exemplaire et issue des différentes approches cellulaires et génétiques de l’étude du cycle (Nasmyth, 2001). Le prix Nobel a récompensé Lee Hartwell, pionnier de l’approche génétique chez la levure, Paul Nurse, découvreur du gène cdc2 (cell cycle control 2) de la transition G2-M du cycle chez la levure de fission et Timothy Hunt pour la découverte de la protéine régulatrice de cdc2, la cycline, au cours des divisions précoces embryonnaires chez la palourde et l’oursin (Nasmyth, 2001). Par l’utilisation de quelques modèles biologiques de choix, tels que les levures, les embryons d’oursins, les ovocytes d’étoile de mer et de xénope, ou les cellules de mammifères en culture, les mécanismes moléculaires de l’orchestration du cycle cellulaire par la famille des protéines kinases dépendantes des cyclines (CDKs, cyclin dependent kinases) ont été élucidés. Ces protéines kinases jouent un rôle essentiel dans le déclenchement, le contrôle et la succession harmonieuse des différentes phases du cycle. Elles sont constituées d’une sous unité catalytique, la kinase, associée à une sous unité régulatrice, la cycline, et s’activent séquentiellement pour assurer le bon déroulement du cycle. Les détails de leur activité et de leur activation ont fait l’objet de nombreuses revues (Nasmyth, 2001; Meijer, 2003; Nurse, 2000; Murray, 2004). Le complexe CDK1 (initialement dénommé cdc2) associé à la cycline B, s’active pour assurer la transition G2-M du cycle cellulaire, et représente l’archétype des CDKs. Dès la découverte de CDK1, le concept de point de contrôle du cycle (checkpoint) a émergé, comme le mécanisme permettant aux cellules de ne s’engager dans la phase suivante du cycle que lorsque la précédente est correctement exécutée. Rapidement, le concept s’est affiné en « points de surveillance » du cycle cellulaire dans lesquels s’intègrent non seulement les éléments effecteurs sur le cycle (CDKs), mais aussi les éléments de détection des anomalies, de la transduction du signal et des effecteurs comme les éléments de réparation des erreurs de division ou l’engagement des cellules vers l’apoptose, la mort programmée des cellules (fig. 2). Il est à noter cependant que plusieurs auteurs restreignent le point de surveillance au mécanisme de l’arrêt du cycle cellulaire. Nous privilégions le concept qui englobe l’ensemble des voies de signalisation entre le stress initial et les différents acteurs, dont les mécanismes de détection des erreurs, de leur médiation vers les voies de transduction qui activent les différents effecteurs des processus biologiques concernés (fig.2).

Figure 2. Les étapes schématiques des voies des points de surveillance du cycle cellulaire.
Les effecteurs des CDKs assurent le bon déroulement du cycle alors que l’ensemble des constituants des points de surveillance est mobilisé en cas d’erreurs, soit dans les phases de duplication des chromosomes (ADN non répliqué ou endommagé), soit au moment de leur ségrégation (points de surveillance du fuseau de division). Les cellules étant soumises en permanence à des agents lésant l’ADN, tels que les radiations ionisantes ou des molécules issues du métabolisme cellulaire lui-même, et la réplication à chaque cycle de division des trois milliards de bases que constitue le génome humain ne s’effectuant pas sans erreurs inhérentes à tout processus biologique, les points de surveillance sont les mécanismes fondamentaux du maintien de l’intégrité du génome. A ce jour, plus de cent acteurs protéiques des points de surveillance du cycle cellulaire sont identifiés et font l’objet de nombreuses publications. Les acteurs et mécanismes des points de surveillance de l’ADN endommagé ou non répliqué sont les plus documentés (Kastan & Bartek, 2004; Sancar et al., 2004), non seulement pour leur rôle biologique fondamental, mais aussi pour leur rôle dans la genèse de pathologies comme les cancers (Kastan & Bartek, 2004; Hartwell & Kastan, 1994). La figure 3 présente les acteurs moléculaires identifiés des points de surveillance de l’ADN endommagé, classés selon leur fonction et les cibles terminales dans le déroulement du cycle cellulaire. La mobilisation des points de surveillance de l’ADN endommagé provoque un ralentissement ou un arrêt du cycle cellulaire et active la machinerie très sophistiquée de réparation de l’ADN (Sancar et al., 2004; Wang & Cho, 2004; Houtgraaf et al., 2006; Lisby & Rothstein, 2004). Les mécanismes de la réparation sont multiples et dépendent du type de l’endommagement (Sancar et al., 2004). Lorsque la réparation est effective, l’inhibition de la progression dans le cycle cellulaire est levée. Lorsque la réparation échoue, par excès de dommages ou défaut génétique de la machinerie de réparation, l’arrêt du cycle peut être permanent et conduire à la sénescence, l’apoptose ou la cancérisation (Kastan & Bartek, 2004; Schultz et al., 2000; Massague, 2004; Liu et al., 2003).
Figure 3. Les composants du point de surveillance de l’ADN endommagé et les phases d’inhibition du cycle cellulaire (d’après Sancar et al., Annu. Rev Biochem, 2004).
L’apoptose, la mort programmée des cellules, permet l’élimination de la très grande majorité des cellules dont l’ADN est endommagé et non réparé (Norbury & Zhivotovsky, 2004). Ainsi, lorsque le point de surveillance de l’ADN endommagé est mobilisé, les protéines kinases ATM/ATR orchestrent la réponse (voir fig. 3). Elles inhibent la progression du cycle cellulaire par une voie de phosphorylation impliquant les

protéines kinases Chk1/Chk2, engagent la réparation par les protéines RPA, BRCA1 et la phosphorylation de H2AX et activent la voie apoptotique des caspases par l’intermédiaire de la protéine p53 (Nyberg et al., 2002). L’acquisition par les cellules de la résistance à l’apoptose favorise l’instabilité génétique et ses conséquences au cours du processus de la cancérisation (Kastan & Bartek, 2004; Sawyers, 2004).
La découverte des proto-oncogènes et des gènes suppresseurs de tumeurs, gènes cellulaires dont la surexpression ou une altération génétique favorise ou même, comme dans le cas de c-myc est suffisante pour conduire au cancer, a fourni une base au concept de l’origine génétique du cancer dans les dernières décennies. La relation entre les oncogènes et les mécanismes de la surveillance du cycle cellulaire, soit parce que les oncogènes sont des éléments des pojnts de surveillance, soit parce qu’ils agissent sur ceux-ci par des voies de signalisation cellulaire, mène au nouveau concept de l’instabilité génétique des cellules permettant le processus de la cancérisation (Blanchard, 2003).
3-Points de surveillance et cellules souches à l’origine des cancers.
Deux concepts fondamentaux ont progressivement émergé au cours des deux dernières décennies. Le premier est le rôle des points de surveillance du cycle cellulaire à l’origine des cancers, et le deuxième plus récent, est que les cancers ont pour origine des cellules souches. Bien que l’aneuploïdie, une mauvaise répartition des chromosomes, caractérise beaucoup de cellules tumorales et résulte du dysfonctionnement du point de surveillance du fuseau mitotique, il paraît de plus en plus évident que l’aneuploïdie est la conséquence de la cancérisation plutôt que son origine (Malmanche et al., 2006; Lopes & Sunkel, 2003; Kops et al., 2005). En revanche (fig. 4), l’implication des points de surveillance de l’ADN endommagé ou non correctement répliqué est généralement reconnue comme la source initiale de la cancérisation (Kastan & Bartek, 2004; Massague, 2004). La genèse d’un cancer nécessite 6 à 8 mutations qui confèrent aux cellules cancéreuses leur propriétés : l’instabilité génétique, l’échappement au contrôle par les facteurs externes, l’induction de l’angiogenèse et la propriété de migration pour former les métastases. Les points de surveillance de l’ADN endommagé ou incorrectement répliqué assurent le maintien de l’intégrité du génome. Ainsi, les cellules qui échappent au contrôle des points de surveillance, soit parce qu’un mécanisme de surveillance est affecté par l’erreur de division, soit parce que l’ADN n’a pas été correctement réparé, acquièrent l’instabilité génétique qui permet par un processus de sélection de conduire aux tumeurs et aux cancers (Kastan & Bartek, 2004; Massague, 2004). Au cours de cette sélection, elles acquièrent la possibilité d’échapper à l’apoptose (fig. 4). Trois à quatre décennies peuvent s’écouler entre le stress initial et les signes cliniques de cancers, à l’exception de cancers à évolution rapide pour lesquels un ou plusieurs éléments de la machinerie des points de surveillance est génétiquement affecté. Par exemple, dans le cas du rétinoblastome, la protéine Rb est génétiquement affectée et provoque une tumeur hautement maligne de la rétine chez le nourrisson et l’enfant. La protéine Rb est l’un des effecteurs du point de surveillance de la transition G1/S (Wang et al., 2001). Puisque 80 % des cancers sont considérés de source non génétique, c’est-à-dire sans prédisposition génétique initiale (Kanavos, 2006), les mécanismes endogènes ou environnementaux qui lèsent l’ADN génèrent les mutations nouvelles qui rendent les points de surveillance inefficaces et induisent l’instabilité génétique transmissible aux cellules filles. surveillance, soit parce qu’un mécanisme de surveillance est affecté par l’erreur de division, soit parce que l’ADN n’a pas été correctement réparé, acquièrent l’instabilité génétique qui permet par un processus de sélection de conduire aux tumeurs et aux cancers (Kastan & Bartek, 2004; Massague, 2004). Au cours de cette sélection, elles acquièrent la possibilité d’échapper à l’apoptose (fig. 4). Trois à quatre décennies peuvent s’écouler entre le stress initial et les signes cliniques de cancers, à l’exception de cancers à évolution rapide pour lesquels un ou plusieurs éléments de la machinerie des points de surveillance est génétiquement affecté. Par exemple, dans le cas du rétinoblastome, la protéine Rb est génétiquement affectée et provoque une tumeur hautement maligne de la rétine chez le nourrisson et l’enfant. La protéine Rb est l’un des effecteurs du point de surveillance de la transition G1/S (Wang et al., 2001). Puisque 80 % des cancers sont considérés de source non génétique, c’est-à-dire sans prédisposition génétique initiale (Kanavos, 2006), les mécanismes endogènes ou environnementaux qui lèsent l’ADN génèrent les mutations nouvelles qui rendent les points de surveillance inefficaces et induisent l’instabilité génétique transmissible aux cellules filles.

Figure 4. Schéma général de la réponse à l’ADN endommagé ou non répliqué sur la destinée de la cellule. Les cellules réparent leur ADN ou s’orientent vers l’apoptose. Les cellules acquièrent l’instabilité génétique par les dommages dans les voies de signalisation des points de surveillance. Celles qui échappent au contrôle de l’apoptose par de nouveaux dommages génèrent le cancer ( d’après Kastan et Bartek, nature, 2004). L’origine du cancer au niveau des cellules souches constitue le deuxième concept émergeant depuis quelques années (fig. 5).

Figure 5. Relations entre les cellules souches identifiées et des cancers avérés (d’après Ratajczak et al., 2006).
Ainsi, les cellules souches sont à l’origine de cancers (fig. 5). Lors des anomalies de leurs divisions ou lorsqu’elles sont affectées au niveau de leur ADN, soit par le métabolisme naturel, soit par les agents carcinogènes, elles acquièrent l’instabilité génétique. Elles sont alors des cellules pré-cancéreuses et se transforment progressivement par un mécanisme de sélection, en cellules souches cancéreuses qui génèrent alors le(s) cancer(s). A partir de l’oeuf, l’embryon est constitué de cellules souches totipotentes, capables de se différencier en tous les tissus d’un organisme, qui deviennent progressivement multipotentes aptes à se différencier en un ou quelques types cellulaires (fig. 6 ; gauche). Les cellules souches normales sont multipotentes indifférenciées et capables de se renouveler indéfiniment, elles sont retrouvées dans la plupart des tissus humains et en assurent le maintien (Reya et al., 2001; Sell, 2004; Pardal et al., 2003) grâce à leur propriété d’auto renouvellement (fig. 6; gauche). Elles sont alors des cellules souches adultes progénitrices des différentes cellules des tissus différenciés (fig. 6). Dans un nombre croissant de cancers, des cellules souches dites « cancéreuses » sont découvertes et caractérisées, renforçant le concept que les cancers prennent naissance dans les cellules souches (Sell, 2004; Pardal et al., 2003; Ratajczak et al., 2006; Beachy et al., 2004). Les tumeurs se développent et sont entretenues par l’auto renouvellement des cellules souches cancéreuses qu’elles contiennent (fig. 6; droite). De nombreuses données expérimentales récentes, dont des exemples sont illustrés la figure 5, viennent renforcer le concept des cellules souches cancéreuses à l’origine de nombreux cancers. Cependant, il n’est pas exclu qu’un cancer puisse aussi être généré à partir de la dédifférenciation de cellules tissulaires ou progénitrices (fig. 6 droite). Les propriétés de migration des cellules souches cancéreuses expliquent les métastases et le développement des tumeurs secondaires (Sell, 2004; Pardal et al., 2003; Ratajczak et al., 2006; Beachy et al., 2004). dédifférenciation de cellules tissulaires ou progénitrices (fig. 6 droite). Les propriétés de migration des cellules souches cancéreuses expliquent les métastases et le développement des tumeurs secondaires (Sell, 2004; Pardal et al., 2003; Ratajczak et al., 2006; Beachy et al., 2004).

Figure 6. Les cellules souches à l’origine des cancers.
Gauche : Les cellules souches embryonnaires donnent naissance aux cellules souches progénitrices qui assurent le renouvellement tissulaire en se différenciant en cellules matures. Droite: par mutations, en particulier par endommagement de l’ADN, les cellules souches normales donnent naissance aux cellules souches précancéreuses puis par évolution clonale aux cellules souches cancéreuses. Les dernières forment les tumeurs et assurent leur renouvellement (d’après Pardal et al., Nature reviews, 2003). Il n’est pas exclu que des cellules matures à faible taux de renouvellement puissent se dédifférencier pour donner des cellules souches précancéreuses.
Ces concepts ont deux implications

importantes. D’une part, dans la définition même du « cancer », terme jusqu’alors utilisé lorsque les signes cliniques apparaissent, et qu’il faut maintenant reconsidérer dans la mesure où, les cellules souches elles-mêmes sont « cancéreuses » dès lors qu’elles ont acquis les propriétés pour générer un cancer. D’autre part, ces concepts changent radicalement les perspectives thérapeutiques, non seulement pour la prévention, car tout agent qui agit sur l’un des mécanismes des points de surveillance est potentiellement cancérigène, mais aussi pour la détection précoce de cancers pour laquelle la détection des cellules souches cancéreuses serait un excellent critère, et enfin pour les stratégies de traitement qui doivent s’orienter vers l’élimination ciblée de ces cellules souches cancéreuses (Sell, 2004; Pardal et al., 2003; Ratajczak et al., 2006; Beachy et al., 2004).
4-L’oursin, un modèle biologique de choix pour étudier les relations entre les éléments des points de surveillance de l’ADN endommagé.
La complémentarité des approches, génétiques chez les levures, biochimiques et cellulaires dans des extraits ovocytaires ou embryonnaires précoces (xénope, oursin, étoile de mer, palourde), a permis l’explosion rapide des connaissances dans le domaine des acteurs du cycle cellulaire et de leur régulation (cf. partie 2). Parmi les modèles biologiques de choix, les ovocytes des invertébrés marins se sont révélés pertinents pour aboutir aux concepts actuels de la régulation du cycle cellulaire (Nurse, 2000; Dorée, 2003). L’abondance du matériel biologique et la disponibilité d’ovocytes et de gamètes arrêtés physiologiquement à des stades précis, et pouvant poursuivre le cycle cellulaire de façon synchrone par stimulation naturelle, constituent les raisons majeures de la pertinence des modèles ovocytaires. La fécondation provoque de manière naturelle l’entrée des gamètes dans le cycle cellulaire et des divisions synchrones des cellules sans qu’il soit nécessaire d’y adjoindre des drogues ou des facteurs de croissance. Le fait que les gamètes d’oursin aient achevé leur méiose avant la fécondation et soient arrêtés en phase G1 du cycle cellulaire (fig. 7) confère au modèle un avantage particulier par rapport aux autres métazoaires dont les gamètes sont arrêtés en métaphase de la seconde division méiotique. La fécondation de l’oursin (fig. 7) permet l’analyse des voies biochimiques de régulation du cycle cellulaire sans interférence avec les mécanismes d’achèvement de la méiose comme c’est le cas dans les modèles alternatifs des embryons, dont le xénope ou la souris (Gilbert, 2003).

Figure 7. Le développement précoce de l’oursin.
L’obtention récente du génome complet de Strongylocentrotus purpuratus (Sodergren et al., 2006) montre que l’oursin possède les gènes orthologues impliqués dans la régulation du cycle cellulaire, dans les points de surveillance, la réparation de l’ADN endommagé et l’apoptose (Fernandez-Guerra et al., 2006; Robertson et al., 2006). La disponibilité du génome complet donne accès aux approches de génomique fonctionnelle facilitant les études des mécanismes moléculaires du cycle cellulaire et des voies reliant la détection, la transduction et les effecteurs des points de surveillance, en particulier des points de surveillance de l’ADN endommagé.
L’oeuf étant la cellule souche par excellence qui conduit à un organisme complet (Sell, 2004), le développement précoce de l’oursin (fig. 7) offre un modèle de choix pour comprendre les premières étapes de la transformation de la cellule souche en cellule souche « cancéreuse ». Les divisions précoces offrent l’avantage d’être rapides. La première division est complète en 2 heures avec les transitions G1-S et G2-M. Les 4 ou 5 divisions suivantes sont rapides avec une succession des phases S et M puis plus lentes avec l’apparition des phases G1 et G2. Les premières divisions jusqu’au stade morula obtenu en 6 heures sont

régulées par des modifications traductionnelles et post-traductionnelles sans nécessité de nouvelles transcriptions. Le stade d’une blastula nageante est observé à 20 heures et poursuit le développement jusqu’au stade adulte (Glibert, 2003). Les embryons sont observés au microscope et la coloration de l’ADN permet de suivre par fluorescence l’évolution nucléaire, d’abord de la tête du spermatozoïde et du noyau de l’ovule puis des cycles de division nucléaire (Marc et al., 2002 ; fig. 7). Bien évidemment, et puisque les oursins ne développent pas de cancers, le modèle complète celui constitué par les cellules souches humaines, le plus approprié mais dont l’isolement est difficile du fait de leurs présences en très faible quantité, et dont les divisions sont longues et naturellement asynchrones (Sell, 2004), même si il est possible de les obtenir à partir de cellules différenciées (Egli et al., 2007). Dans le modèle de l’oursin, la régulation du cycle cellulaire est bien documentée, en revanche, les acteurs des points de surveillance n’en sont qu’à leur premières caractérisations fonctionnelles. L’existence même de points de surveillance était controversée. Les premières évidences de leur existence dans les cellules embryonnaires précoces proviennent des expériences montrant l’inhibition du premier cycle cellulaire par une action inhibitrice de l’activation de CDK1/ cycline B ayant pour effet un blocage de la transition G2 -M du cycle (Marc et al., 2002). Cet effet a été obtenu sous l’action d’un pesticide d’usage courant (voir partie 5). La voie de transduction passant par la protéine phosphatase CDC25 pour empêcher l’activation de CDK1/ cycline B, s’est révélée fonctionnelle (Marc et al., 2004a). Par l’utilisation d’agents lésant l’ADN, la fonctionnalité du point de surveillance G2 -M en réponse à l’endommagement de l’ADN a été établie (Le Bouffant et al., 2006, 2007, fig. 8). Et récemment, par l’utilisation de génotoxiques, la fonctionnalité de la voie apoptotique a été démontrée ainsi que celle de la réparation de l’ADN (Le Bouffant et al., 2007, fig. 8). Ainsi le modèle oursin permet l’étude fonctionnelle de l’ensemble des voies de signalisation du point de surveillance de l’ADN endommagé. Cette étude est d’autant plus prometteuse que des extraits in vitro reproduisant des évènements observés in vivo à différentes phases du cycle et/ou de l’activation des points de surveillance peuvent être préparés et ont été expérimentalement probants pour des études antérieurs du cycle cellulaire. Des extraits interphasiques ont permis l’analyse de la re-formation du noyau (Collas, 2000), de la synthèse d’ADN en phases G1 et S (Zhang & Ruderman, 1993), des évènements de la phase M (Collas, 1998). Les études fonctionnelles dans de tels extraits sont réalisables par des expériences de déplétion/complémentation de protéines, facilitées par la connaissance du génome complet, et par addition d’effecteurs spécifiques des voies de signalisation.

Figure 8. Le point de surveillance de l’ADN endommagé fonctionnel dans les embryons d’oursin (d’après Le Bouffant et al., CMLS, 2007)
Le modèle des embryons précoces d’oursin devrait permettre l’étude fonctionnelle des voies de signalisation du point de surveillance de l’ADN endommagé, et de son dérèglement pouvant conduire aux propriétés des cellules souches « cancéreuses » . Ces recherches sont complémentaires des approches génétiques, et nous postulons que cette convergence d’approches sera aussi fructueuse que celle qui a permis l’identification et la caractérisation fonctionnelle des acteurs du cycle cellulaire (Nasmyth, 2001).
5-Le modèle de l’embryon d’oursin et la toxicité du Roundup
- Le modèle de l’embryon d’oursin et la toxicité du Roundup
Un des challenges majeurs de la toxicologie est la détermination des risques en matière de santé d’une exposition à un ou plusieurs produits apparemment sans conséquence immédiate (de Rosa et al., 2004). En particulier, la question se pose pour l’emploi de pesticides (Barr et al., 1999) dont certains, comme le Roundup sont utilisés à très grande échelle dans le monde dans des applications domestiques, de services ou agricoles. L’emploi du Roundup s’intensifie du fait du développement mondial des organismes génétiquement modifiés (OGM) rendus tolérants au Roundup (Blackburn & Boutin, 2003). Depuis les premières mises sur le marché du Roundup en 1975, les risques sur l’environnement et la santé publique étaient considérés comme négligeables (Williams et al., 2000).
Le Roundup contient le glyphosate, molécule active comme désherbant, associé à des produits de formulation jouant le rôle de surfactants et de perméabilisants (Williams et al., 2000). Lors de l’exposition d’ embryons d’oursin à différents cocktails de pesticides, le Roundup, d’usage courant et disponible aisément dans les commerces, a été choisi initialement comme contrôle non toxique pour sa réputation de sécurité, largement entretenue par les campagnes de publicité. De façon inattendue, le Roundup s’est révélé agir sur le déroulement de la division cellulaire, à des doses bien inférieures (500 à 2500 fois) à celles recommandées par le fabricant en usage herbicide (Marc et al., 2002 ; 2003 ; 2004a ; 2004b). L’analyse de l’action du produit sur la première division de l’embryon d’oursin montre que le Roundup inhibe l’activation du complexe CDK1/ cycline B, complexe protéique terminal du point de surveillance de l’ADN endommagé (cf. partie 3). L’effet du Roundup s’explique par son contenu en glyphosate et nécessite la présence de produits de formulation qui permettent son entrée dans les cellules (Marc et al., 2002). La connaissance de l’universalité des mécanismes des points de surveillance du cycle cellulaire a permis de suggérer qu’il pouvait y avoir un risque en santé humaine (Marc et al., 2002) et a justifié l’alerte des autorités de tutelles en 2002. L’effet est analogue pour différentes formulations contenant le glyphosate (Marc et al., 2004b). Le pesticide affecte la synthèse de l’ADN et aboutit à l’inhibition de l’activation de CDK1/ cycline B par la voie de transduction impliquant la protéine phosphatase CDC25 (Marc et al., 2004a).
La toxicité du Roundup a aussi été démontrée au niveau de la transcription dans le modèle de l’oursin (Marc et al., 2005), au niveau d’enzymes du métabolisme des hormones stéroïdes dans des modèles cellulaires humains (Richard et al., 2005) y compris des cellules embryonnaires en culture (Benachour et al., 2007), et dans des écosystèmes reconstitués (Relyea, 2005). Des effets sur le cycle cellulaire et le point de surveillance de l’ADN endommagé ont été démontrés dans un modèle in vivo de poissons (Cavas & Konen, 2007). Le Roundup est toxique sur des cultures de cellules de kératinocytes humaines (Gehin et al., 2006) probablement en relation avec le point de surveillance de l’ADN endommagé. Le Roundup est déversé massivement par voie aérienne sur des cultures en Amérique du Sud (Solomon et al., 2007), touchant avec évidence l’ADN et le point de surveillance de l’ADN endommagé chez l’homme (Paz-y-Mino et al., 2004).

Figure 9. Représentation schématique des effets du Roundup, herbicide à base de glyphosate, sur l’ADN, le point de surveillance de l’ADN endommagé et par voie de conséquence sur les mécanismes à l’origine des cancers (cf. texte).
Avec l’accumulation des évidences expérimentales liant l’origine des cancers avec l’acquisition de l’instabilité génétique des cellules qui échappent au point de surveillance du cycle cellulaire et affectent des cellules souches (cf. partie 3), les résultats obtenus sur le modèle pertinent du développement précoce de l’oursin (cf. partie 4) sont révélateurs de conséquences en matière de santé humaine. En prenant en compte la définition émergeante du cancer, dès le début de la tumorigenèse (cf. partie 3), le Roundup est incontestablement un agent cancérigène (fig. 9). Lorsqu’elles seront possibles, les études épidémiologiques permettront d’estimer l’incidence du produit sur les différents types de cancers, en particulier les cancers des voies respiratoires puisque le produit pulvérisé contient la formulation à des concentrations très supérieures à celles qui activent le point de surveillance de l’ADN endommagé.

Le modèle biologique de l’embryon d’oursin permet d’évaluer les risques de toxicologie à long terme en matière de cancer. Il peut donc être à la base d’une méthode cellulaire et moléculaire fiable de la mesure du potentiel cancérigène de substances ou de combinaisons de substances, un problème majeur de la toxicologie actuelle, fournissant une évaluation beaucoup plus précoce que les études épidémiologiques qui ne peuvent s’effectuer qu’ a posteriori (Marc et al., 2003). Dans une perspective d’application à grande échelle, la mise au point d’extraits acellulaires mimant in vitro le point de surveillance de l’ADN endommagé, parfaitement réalisables à partir des embryons, sera d’un intérêt majeur (Marc et al., 2003).

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