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Apport du laboratoire de Biologie Clinique dans le diagnostic des allergies : Nouveaux outils.









Travail de fin d’études

pour le Master complémentaire en Biologie clinique
(Sciences de la Santé et Sciences pharmaceutiques)

Apport du laboratoire de Biologie Clinique
dans le diagnostic des allergies :
Nouveaux outils.

Romy GADISSEUR
Candidate spécialiste

5ème année de Master Complémentaire en Biologie Clinique

Service de Chimie Médicale

(Professeur J-P Chapelle)

Table des matières.

1. But du travail p3
2. Introduction  p4

  • Définition de l’allergie p4

  • Les hypersensibilités p4

  • Prévalence de l’allergie p5

  • Causes de l’allergie p5

  • Symptômes de l’allergie p5

  • Diagnostic de l’allergie p5


3. Diagnostic des allergies par les protéines recombinantes par ImmunoCAP ou par microarray p6

  • Historique p6

  • Les familles de protéines p7

  • Laboratoires de biologie clinique p8

  • L’ImmunoCAP®ISAC, allergen-microarray. P9

  • Le Centre Hospitalier Universitaire de Liège p11

  • Conclusions p11

  • Les allergènes recombinants, application au laboratoire. P12

    • Etude : Evaluation de la technique de microarray sur les 86

premiers patients pour lesquels l’ImmunoCAP ISAC a été réalisé. p12

    • Etude B: Allergènes recombinants et ImmunoCAP®, apport

dans le cadre de l’allergie à l’arachide et/ou à la noisette p16
6. Remerciements p17
7. Bibliographie p18
ANNEXES
Annexe 1. Travail sur les allergies alimentaires (Anna Blanco).
Annexe 2. Etude : A new tool in the field of in-vitro diagnosis of allergy :

Preliminary results in the comparison of ImmunoCAP© 250 with the ImmunoCAP© ISAC.
Annexe 3. Poster EAACI 2010

Component-resolved diagnosis in peanut and hazelnut allergy.
Annexe 4. Article paru dans la Revue Médicale de Liège

Allergie au venin d’Hyménoptère et tests de laboratoires: de nouvelles approches pour la prise en charge des patients à haut risque de réaction sévère.
Annexe 5. Rapport de stage (Anna Blanco) : Allergies aux venins d’Hyménoptères.
Annexe 6. Diagnostic des allergies médicamenteuses .

Annexe 7. Différentes techniques de laboratoire : Nouveaux outils.
Annexe 8. Abstract
Annexe 9. Liste des travaux.


1. But du travail

Le but de notre travail été de développer les différentes méthodes d’analyse nouvellement décrites dans la littérature et ainsi, de fournir aux cliniciens le maximum d’outils de diagnostic in-vitro adaptés à chaque histoire allergique. Nous avons voulu faire une priorité scientifique et clinique du diagnostic in-vitro des allergies avec des outils très spécialisés.
Pour se faire, nous avons concentré nos efforts autour de 3 points importants :

  • L’aide au diagnostic des allergies par les protéines recombinantes :

    • But : Utilisation des allergènes recombinants pour la compréhension des allergies croisées, pour estimer la sévérité de l’allergie et pour définir le profil allergique d’un patient dans le but de découvrir les bons candidats pour une immunothérapie spécifique.

    • Techniques : dosage des allergènes recombinants par ImmunoCAP® ou par microarray (ImmunoCAP® ISAC)

    • Etude: Evaluation de la technique de microarray sur les 86 premiers patients pour lesquels l’ImmunoCAP® ISAC a été réalisé. Comparaison des 555 résultats d’IgE spécifiques avec les 2 méthodes (CAP versus ISAC).

    • Etude: Allergènes recombinants : apport de l’ImmunoCAP®  dans le cadre de l’allergie à l’arachide et/ou à la noisette.




  • L’aide au suivi des immunothérapies spécifiques dans le cadre des désensibilisations au venin d’hyménoptères.

    • But : Mise au point des dosages divers permettant, d’une part, de découvrir les bons candidats pour une immunothérapie spécifique au venin de guêpe ou d’abeille, d’autre part, de suivre l’évolution de l’allergie au venin pendant la phase de désensibilisation et enfin d’évaluer si les patients peuvent être considérés comme « guéris » de leur allergie au venin (afin de décider si l’Immunothérapie spécifique peut être interrompue après 3 années de traitement).

    • Techniques : dosage d’allergènes par ImmunoCAP®, test d’activation de Basophiles, Cellular Allergen Stimulation Tests (CAST-ELISA), dosage de la Tryptase.

    • Etude : Sélection de 36 patients sensibilisés ou allergiques au venin (désensibilisés ou non) et réalisation du panel d’analyses.




  • L’aide au diagnostic des allergies médicamenteuses.

    • But : Mise au point des méthodes d’analyse afin de dépister les allergies médicamenteuses IgE ou non IgE-médiées.

    • Techniques : Test d’activation de Basophiles (BAT), Cellular Allergen Stimulation Test (CAST).

    • Etude : Mise au point de la technique. Aucune étude réalisée à l’heure actuelle.


Dans ce travail de fin d’études, nous nous focaliserons sur le premier sujet : l’aide au diagnostic des allergies par les protéines recombinantes.

1. Introduction :
Définition de l’allergie

L’allergie est une pathologie due à une réponse inadaptée et excessive de notre organisme vis à vis de l’environnement. Ainsi, des substances étrangères et normalement inoffensives entraînent une réaction de défense de notre système immunitaire, nuisible à l’organisme.
Hypersensibilités

L’hypersensibilité est une réponse immunitaire disproportionnée par rapport à la dangerosité de l'intrus qui peut être une bactérie, un virus, un allergène.

La réaction d'hypersensibilité évolue en trois phases : une phase de sensibilisation (premier contact avec l'antigène), une phase de latence pendant laquelle se mettent en place les mécanismes immunologiques de la réaction, et enfin une phase lésionnelle lors d'un deuxième contact, déclenchant, avec l'antigène.

On regroupe certains de ces phénomènes d'hypersensibilité sous le terme d'allergie.

Il existe quatre types d'hypersensibilité :

  • L'hypersensibilité de type I : ou hypersensibilité immédiate

    • Immunité humorale = Allergie.

      • Médiée par les IgE spécifiques d’un allergène (IgE dépendante).

      • Tendance héréditaire.

    • Manifestations cliniques diverses (dermatite atopique, rhinite pollinique, etc).

      • Apparaissent en quelques minutes.

    • Les IgE fixées sur les mastocytes tissulaires et sur les basophiles sanguins, réagissent avec l’Ag (allergène), induisant ainsi la dégranulation de ces cellules (libération d’histamine et d’autres médiateurs).

  • L'hypersensibilité de type II : souvent localisée

    • La réaction intervient entre les Ac IgG ou IgM, et les Ag fixés sur la membrane des cellules reconnues comme étrangères.

      • Cette réaction débouche sur la cytolyse de ces cellules grâce à l’intervention de cellules cytotoxiques (macrophages, cellules NK, système réticulo-endothélial,…) ou l’action du complément.

      • Excès de production d'anticorps cytolytiques.

        • Au cours de certaines cytopénies auto-induites :

          • Lorsqu’un Ac circulant réagit avec un Ag absorbé sur une membrane cellulaire ou avec un de ses constituants naturels (Ag à la surface des globules rouges ou des plaquettes).

        • Réactions transfusionnelles, maladies hémolytiques auto-immunes, maladie hémolytique du nouveau-né.

  • L'hypersensibilité de type III : ou semi-retardée

    • Les symptômes apparaissent quelques heures après le contact avec l’antigène, en cas d’exposition aiguë.

    • Les IgG et IgM circulants se lient à des antigènes formant ainsi les complexes immuns. Ceux-ci se déposent dans les parois vasculaires, entraînant une réaction inflammatoire locale par action du complément et attraction puis activation des neutrophiles.

        • Présence du complexe immuns Ag/Ac de type IgG avec activation du complément.

    • Manifestations cliniques :

      • Vasculite allergique, alvéolite allergique (poumon du fermier, des éleveurs d’oiseaux),

      • Polyarthrite rhumatoïde, glomérulonéphrite, Lupus Erythémateux Disséminé, certaines néphropathies, maladie sérique.

  • L'hypersensibilité de type IV : ou retardée.

    • Manifestations cliniques apparaissant dans les 48-72h après le contact avec l’antigène, en cas d’exposition aiguë.

    • Les lymphocytes T se lient aux antigènes et libèrent les médiateurs sans intervention d’immunoglobulines, ni du complément.

    • Manifestations cliniques :

      • Rejet de greffe

      • Allergie de contact

      • Réaction au test tuberculinique


Prévalence de l’allergie

Selon les dernières données de l’OMS, la maladie allergique est en pleine expansion dans les pays industrialisés. En effet, la prévalence des allergies alimentaires, respiratoires et médicamenteuses chez l’adulte ou chez l’enfant a doublé au cours de ces 15 dernières années. L’allergie peut débuter dès le plus jeune âge et évolue jusqu’à l’âge adulte. Une « marche de l’allergie » (progression de la maladie allergique) a d’ailleurs été décrite récemment. La fréquence des allergies a tellement augmenté qu'elles posent désormais un important problème de Santé Publique.
Causes de l’allergie

Alors que dans les pays en voie de développement le manque d’hygiène et la sous-alimentation sont les causes principales des maladies infectieuses et de la malnutrition, dans les pays développés la suralimentation et le manque d’allergènes dans le milieu de vie ont contribué à une augmentation progressive des maladies respiratoires et des allergies. Il y a d’autres hypothèses qui peuvent expliquer l’augmentation de la prévalence des maladies allergiques dans notre population, comme la sédentarité, l’urbanisation et la contamination de l’air, l’introduction de nouveaux allergènes alimentaires (surtout des fruits exotiques), l’introduction trop précoce du soja ou de la noisette dans l’alimentation de l’enfant, et aussi l’amélioration des techniques de diagnostic des allergies.
Symptômes

L’allergie peut potentiellement être rencontrée dans toutes les spécialités médicales. Ainsi, cette maladie peut être prise en charge par des spécialistes d’orientations diverses (pneumologues, dermatologues, oto-rhino-laryngologistes, pédiatres, anesthésistes…). En effet, les symptômes cliniques varient selon le type d’allergène impliqué et peuvent atteindre tous les organes et tissus (système digestif, bronches, muqueuses, peau, œil, etc). Les symptômes de l’allergie sont très variés et d’une sévérité relative: simple désagrément périodique, conjonctivite, troubles gastrointestinaux, rhinite, asthme, dermatite, eczéma, urticaire, œdème de Quincke, choc anaphylactique. Les symptômes de l’allergie peuvent donc potentiellement entraîner une issue fatale. Ainsi, il est extrêmement important de pouvoir prendre en charge les patients allergiques à temps et, idéalement, de la manière la plus adaptée. La compréhension des mécanismes d’action à l’origine d’une histoire allergique est primordiale.
Diagnostic.

Le premier outil et la base du diagnostic de l’allergie est l’anamnèse clinique qui doit être la plus précise possible. Elle doit pouvoir apporter des informations relatives aux événements allergiques aussi bien en ce qui concerne l’allergie d’origine médicamenteuse, que l’allergie respiratoire ou alimentaire. L’anamnèse clinique est le point de départ qui permet souvent d’identifier les causes potentielles de l’événement allergique. C’est elle qui va orienter tous les tests qui se feront en aval. Par la suite, les allergologues réalisent des tests de provocation in-vivo (prick test, intradermo-réaction, test de provocation orale, etc) afin de confirmer leur hypothèse en apportant à la clinique un élément concret. Ces tests sont bien connus et utilisés depuis la fin du 19ème siècle. Les tests cutanés sont réalisés en pratique courante et sont d’ailleurs considérés comme le « Gold Standard » du diagnostic des allergies.

Jusqu’il y a peu, les laboratoires de biologie clinique participaient au diagnostic in-vitro des allergies par le dosage des IgE totales et par le dosage des IgE spécifiques dirigés contre des mixtures d’allergènes ou des extraits d’allergènes. Ils permettaient d’identifier des sources allergéniques contre lesquelles un patient sécrète des IgE.

Malheureusement, aussi bien les tests in-vitro qu’in-vivo, ils ne pouvaient ni fournir de réponse précise concernant la sévérité des allergies, les symptômes occasionnés par ces allergies, ni orienter le type de prise en charge à mettre en œuvre pour éviter au patient tout risque.

Un dosage d’IgE spécifique positif pour un extrait alimentaire accompagné d’un test cutané positif entraînaient alors une éviction de l’aliment ou dumoins des précautions d’éviction des allergènes. Ainsi, lors de nos travaux réalisés, nous avons eu l’occasion de rencontrer de nombreux patients anxieux de leur statut de patient allergique et vivant parfois très inconfortablement. En effet, certains patients se sont vus dans l’obligation de suivre des régimes stricts avec éviction large rendant leur alimentation relativement acrobatique. Ainsi, au niveau des laboratoires, les tests de diagnostic in-vitro devaient absolument évoluer afin de pouvoir fournir des outils utiles et performants. Ces derniers permettraient de générer des informations plus précises aux cliniciens pour les guider vers une meilleure prise en charge du patient.
2. Diagnostic des allergies par les protéines recombinantes par ImmunoCAP ou par microarray
2.1. Historique




Les premiers outils de diagnostic d’allergies ont été mis au point fin du 19ème siècle. Il s’agissait de tests de provocation in-vivo. Ces tests in-vivo restent, à ce jour, le «gold standard» du diagnostic. En effet, les tests cutanés, tests de provocation nasale et autres sont toujours très utilisés en pratique courante. Jusqu’il y a peu, les laboratoires de biologie clinique participaient au diagnostic in-vitro des allergies par le dosage des IgE totales et par le dosage des IgE spécifiques dirigés contre des mixtures d’allergènes ou des extraits d’allergènes. La première technique de dosage s’effectuait via des méthodes radio-isotopiques (RAST). Ces tests ont vite été abandonnés pour des immunoessais.

L'ensemble de ces tests (in-vitro et in-vivo) repose sur l'utilisation d'extraits allergéniques dits globaux ou naturels. Or la composition d’extraits commerciaux reste hétérogène voire variable d'un lot à l'autre, malgré l'automatisation des techniques de fabrication et les efforts constants de standardisation. Les extraits naturels sont obtenus à partir de sources allergéniques complexes et leur composition peut varier en fonction des procédés d'extraction, de purification, des conditions de stockage utilisées et des propriétés d'hydrosolubilité des protéines allergéniques qu'ils contiennent. Cette variabilité des extraits pourrait expliquer certaines discordances entre les conclusions déduites des faits cliniques et les résultats des tests diagnostiques. Quelle que soit la méthode diagnostique choisie, l'utilisation des extraits naturels ne permet pas de préciser à quelle protéine allergénique le patient est sensibilisé (allergène majeur ou mineur) ni de connaître la proportion respective des IgE spécifiques dirigées contre les différentes protéines allergéniques contenues dans l'extrait. Malheureusement, les tests in-vitro utilisant ces extraits commerciaux ne sont pas capables de fournir des réponses précises concernant la sévérité des allergies, les symptômes occasionnés par ces allergies, ni orienter le type de prise en charge à mettre en œuvre pour éviter tout risque pour le patient.



Prenons pour exemple le cas de l’allergie à l’arachide. Un dosage d’IgE spécifiques positif pour l’extrait d’arachide n’est pas vraiment prédictif d’une allergie vraie à l’arachide (pouvant occasionner des symptômes sévères). Ce taux d’IgE peut également exprimer une sensibilisation croisée (avec ou sans symptômes, en général mineurs). En effet, le seul dosage d’IgE contre l’extrait de l’arachide ne nous permet pas de définir quel sera le type de symptôme occasionné par l’ingestion de celle-ci.



Il a fallu attendre les résultats de recherche fondamentale en matière d’immunologie et les nouvelles découvertes en matière de biologie moléculaire et de protéomique pour pouvoir comprendre les particularités jusqu’à lors inconnues des allergènes. Ainsi, l'application du génie génétique à notre discipline a permis de séquencer, de synthétiser et de cloner différentes protéines allergéniques.

L'allergène majeur des acariens Dermatophagoides pteronyssinus (Der p 1), cloné en 1988 par une équipe australienne, fut le premier d'une longue liste. En effet, en 2010, on dénombre plus de 1700 allergènes clonés. D'ailleurs, les publications consacrées aux allergènes recombinants sont de plus en plus nombreuses. En effet, la littérature abonde en matière de description, classification de ces allergènes. Chaque semaine, de nouveaux allergènes y sont décrits

Ainsi, le cheminement des connaissances sur les allergènes a connu une extraordinaire avancée au cours des deux dernières décennies. En effet, les recherches ont permis de définir quelles sont les protéines à potentiel allergénique parmi l’entièreté des protéines contenues dans les sources allergénique et de connaître les structures tridimensionnelles de très nombreux allergènes.
L’intérêt de doser les IgE spécifiques de composants et non d’extrait allergénique est de pouvoir différencier les IgE spécifiques au niveau moléculaire. En effet, certains composants sont spécifiques de la source allergéniques, marqueurs d’une sensibilisation vraie, d’autres sont des composants communs à de nombreux pollens de végétaux ou d’aliments d’origine végétale et sont appelés panallergènes, comme par exemple les profilines. Une sensibilisation à des panallergènes provoque la positivité des tests cutanés et des IgE spécifiques à de nombreux extraits allergéniques, ce qui ne permet pas une identification précise du composant allergénique en cause dans les manifestations allergiques. Ces composants sont nommés selon une nomenclature qui utilise les trois premières lettres du genre puis la première lettre de l’espèce et un chiffre qui correspond à l’ordre chronologique de la purification (exemple : Bet v 1 est le premier allergène caractérisé pour le bouleau, Betula verrucosa).
Ainsi, l'obtention des allergènes recombinants a permis d'améliorer les connaissances des allergènes sur le plan moléculaire et de mieux appréhender la notion d'allergie croisée.

L'allergie croisée repose, en effet, sur l'existence dans des familles botaniques différentes, de protéines allergéniques partageant une grande homologie structurale. La connaissance des familles de protéines allergéniques comme les protéines de stress (protéines de type PAR), les protéines de transport du calcium (polcacine) ou du transport des lipides (LTP : lipotransférase) et les protéines de structure (tropomyosine, profiline…) a également bénéficié de l'essor des allergènes recombinants.
Les cliniciens qui prennent en charge les patients allergiques sont très souvent dépourvus d’outils objectifs pour définir avec précision à quel type de protéine le patient est allergique. De plus, lorsqu’une immunothérapie spécifique est entreprise, ils ne disposent d’aucun test pour suivre son évolution et finalement décider si le patient est guéri ou non. Par ailleurs, il est décrit qu’une désensibilisation peut induire le développement d’une allergie à l’un ou l’autre des composants de ces vaccins, sans que l’on puisse s’en douter. Ainsi, l’échec d’une immunothérapie, longue, coûteuse et non dénuée de risque pour le patient pourra être attribué à une nouvelle sensibilisation, à un vaccin ne possédant pas la (les) protéine(s) contre la(les)quelle(s) le patient est allergique, voire encore à le sensibiliser contre d’autres protéines contre lesquelles il n’était pas sensibilisé au départ…
2.2. Les Familles de protéines


  • a)La famille des prolamines :

Les prolamines incluent les albumines-2S et les protéines de transfert lipidique non spécifique (nsLTP). Elles sont de bas poids moléculaire (environ 10kDa), elles sont riches en acides aminés soufrés. Leur structure tridimensionnelle très compacte et riche en hélices alpha les rend très résistantes à la chaleur et à la digestion. Les nsLTP sont thermostables et résistantes à la digestion, c’est pourquoi il existe également un risque de réactions allergiques aux aliments cuits ou transformés par l’industrie alimentaire.


  • b)La famille des cupines :

Elles sont les principales sources de stockage énergétique de la graine et regroupent les protéines de la famille des vicilines-7S et des légumines-11S. Les cupines sont des globulines de haut poids moléculaire qui se caractérisent par une structure spatiale particulière qui donnent à ces protéines une grande résistance à la chaleur et à la digestion.


  • c)Les protéines homologues d’allergènes polliniques :

Il s’agit des protéines homologues des allergènes majeurs du bouleau (Bet v1 et Bet v2). Le bouleau (Betula verrucosa) est un arbre qui fait partie de la famille des Bétulacées. Il est retrouvé dans toute l’Europe du Nord.

- Bet v 1 est une protéine de bas poids moléculaire (18kd) ; elle a été identifiée comme la principale responsable d’un syndrome oral allergique (OAS) après ingestion de certains végétaux chez les patients souffrant d’une polysensibilisation pollinique (les symptômes systémiques sont très rares).

- Bet v 2 est une profiline de 15 kDa de poids moléculaire. Elle est responsable de réactions croisées multiples avec d’autres allergènes polliniques et aussi avec des allergènes faisant partie d’autres tissus végétaux (fruits, légumes, fruits secs, épices et latex).
Ces protéines (Bet v1 et Bet v2) sont peu stables à la chaleur et à la digestion, ainsi, les problèmes sont limités à l’ingestion d’aliments frais ou crus.

Généralement, les jus commerciaux sont tolérés, parce qu’ils sont traités avant leur commercialisation. Il suffit de cuisiner les aliments pour éviter les symptômes désagréables de cette allergie. Normalement, aucun traitement n’est instauré pour ce type de symptômes (OAS), parce qu’ils disparaissent spontanément, il suffit de conseiller aux patients d’éviter l’ingestion des fruits frais ou crus.
Dans les pays d’Europe du Nord ou d’Europe Centrale, en région endémique des bouleaux, les patients allergiques au pollen du bouleau sont sensibilisés à la protéine Bet v1. Cette protéine allergénique fait partie de la famille des PAR-10 (PR-10). On trouve des autres PR-10 dans les fruits à coques et dans les fruits qui font partie de la famille des rosacées. Généralement ces patients présentent le syndrome oral quand ils mangent ces fruits à coques ou des fruits de la famille des rosaceae, par suite d’une réaction croisée entre les allergènes du pollen (Bet v1) et les protéines PR-10 de la noisette ou de l’arachide (Ara h8 et Cor a1 respectivement). Les allergènes homologues de Bet v1 sont responsables de plus du 90% des allergies croisées chez les patients allergiques au pollen du bouleau.

Par contre, les patients de la partie méditerranéenne de l’Europe (région dépourvue de bouleaux) qui sont allergiques à ces fruits, ne présentent pas des IgEs spécifiques contre Bet v 1 du bouleau. Les patients allergiques aux Rosacées et aux fruits à coques ne sont sensibilisés via une autre voie que via sensibilisation au pollen de cet arbre. Dans ce cas, on parle des allergies vraies aux fruits (arachide, noisette et Rosacées). Elles sont dues à une sensibilisation aux allergènes majeurs (pour l’arachide Ara h 2, pour la noisette Cor a 1, pour la pomme Mal d 3, pour la pêche Pru p 3,...) ou à des nsLTP (pour l’arachide Ara h 9 ou pour la noisette Cor a 8). Dans ce cas, la symptomatologie est plus grave, les patients présentent des réactions systémiques qui peuvent tourner en anaphylaxie. Comme les nsLTP et les protéines de stockage sont thermostables et résistantes à la protéolyse digestive, l’interdiction totale de ces fruits à coques ou de ces fruits de la famille des Rosacées est primordiale.


  • d) CCD : Cross-reactive carbohydrate determinants :

La plupart des allergènes végétaux sont des protéines. Dans la structure de ces protéines allergéniques, il y a fréquemment des structures chimiquement différentes qui y sont greffées : les carbohydrates.

Les fonctions de ces structures glycosydiques sont diverses. En effet, dans la protéine, elles ont un rôle structurel (elles contribuent à la conformation et à la stabilité protéique), elles protègent la protéine des enzymes protéolytiques extracellulaires, et elles modulent la fonction protéique. Au niveau cellulaire, elles ont une fonction plus dynamique : elles permettent la reconnaissance cellulaire.

Ces structures glycoprotéiques sont présentes tant dans le règne animal que dans le règne végétal. Cependant, il y a des différences importantes entre les glycoprotéines des cellules végétales et des cellules animales. Les glycans des cellules des mammifères sont plus grands et contiennent normalement de l’acide sialique et du galactose. Dans les cellules végétales, ils sont plus petits et contiennent du fucose et du xylose. Ainsi, à cause de ces différences structurales entre les glycopeptides animaux et végétaux, les glycans d’origine végétale sont reconnus par le système immunologique humain et peuvent, par la suite, donner lieu à des réactions allergiques.

En général, dans les allergies, les IgEs sont dirigés contre la partie protéique de l’allergène. Néanmoins, certains IgE reconnaissent l’épitope carbohydrate présent sur la protéine. Les IgE le reconnaissent et puis se lient aux sucres (xylose, fucose) des différentes protéines allergéniques (xylose, fucose), ce qui donne lieu à des réactions croisées.

Pour exemple, un des allergènes majeurs de l’arachide, Ara h1, contient un résidu b (1,2) xylose.
Ainsi, ces déterminants carbohydrates (CCD) sont les responsables des faux positifs dans les tests de diagnostic in-vitro de l’allergie lors de la quantification des IgE sériques.


  • e) Les parvalbumines

Allergène majoritaire des poissons, la parvalbumine est responsable des réactivités croisées envers toutes les espèces de poissons. Cet allergène est hautement stable à la chaleur. Il peut être responsable de réactions sévères.


  • f) Les tropomyosines

Constituant principal des muscles, on retrouve la tropomyosine chez tous les animaux. La tropomyosine des invertébrés (de type crevette, moule, crabe, escargot, etc) est un allergène puissant qui est responsable de réactions croisées entre les différents types de fruits de mer. Cet allergène très stable à la chaleur est responsable de réaction sévère.
2.3. Laboratoire de Biologie clinique
Après des mises au point et de rigoureuses validations, la firme « Phadia-diagnostic » a commercialisé des réactifs utilisant la technologie des allergènes recombinants, devenant le leader mondial en la matière. Ainsi, les laboratoires de diagnostic ont pu acquérir la technologie des recombinants. Les dosages d’IgE spécifiques pour les composants allergéniques a été rendue possible par l’adaptation de l’automate ImmunoCAP de Phadia (qui effectuait déjà les traditionnelles mesures d’IgEtot et d’IgE pour les extraits). Ainsi, les laboratoires de biologie clinique désireux d’offrir ce bel outil technologique à leurs cliniciens spécialisés ont pu acquérir la technologie des recombinants aisément. A l’heure actuelle, près de 100 allergènes sont disponibles sur le marché sous forme de composants.
Actuellement, les allergènes recombinants commencent à être bien connus par les cliniciens spécialisés et sont dosés en routine. Au niveau du laboratoire, les dosages d’IgE spécifiques ont vu le nombre de tests se multiplier. En effet, il y a 2 ans, seul l’extrait de la source allergénique était disponible, maintenant, pour une même source allergénique, on peut tester jusqu’à 8 allergènes (latex, fléole des prés).

!! Power of component = power of numbers !!

Malheureusement, l’INAMI est un facteur limitant car il ne rembourse toujours que 6 allergènes par prescription. Pourtant, chez certains patients, une bonne dizaine de recombinants est parfois nécessaire pour aboutir à un diagnostic. C’est le cas chez les patients polysensibilisés, atopiques, ou avec une histoire d’allergie peu claire, parfois pour lesquels aucun screening par tests cutanés n’est possible (dermographisme, prise de corticoïdes ou d’antihistaminiques). Ainsi, il n’est pas rare que le diagnostic prenne une année avant d’être posé…et ce, après de nombreuses consultations chez l’allergologue.
Pour ces patients pour lesquels tant de recombinants sont nécessaires, afin de leur éviter cette attente souvent inconfortable et de nombreuses prises de sang, il était nécessaire de trouver une solution. L’alternative était de trouver un système permettant de mettre à disposition tous les allergènes recombinants et naturels purifiés sur un même système et qui seraient testés simultanément. Cependant, avec la méthode d’ImmunoCAP traditionnelle, cette perspective était inenvisageable étant données la quantité de sang nécessaire pour la réalisation de chaque test et la charge de travail pour l’appareil lui-même.
2.4. L’ImmunoCAP®ISAC, allergen-microarray.
Le test ImmunoCAP® ISAC, fondé sur la technologie innovante des biopuces à protéines, mesure les IgE spécifiques de 103 composants allergéniques issus de 40 sources allergéniques différentes. L’ImmunoCAP® ISAC est une plateforme d’immuno-dosages miniaturisée qui permet la mesure simultanée d’IgE spécifiques de nombreux composants à partir d’une goutte de sérum ou plasma. Grâce à l’utilisation d’une technologie de nano-distribution ultra-précise, des composants allergéniques naturels purifiés ou recombinants sont immobilisés sur un support solide (biopuce). Le dosage est réalisé en deux étapes. Les IgE du sérum du patient se lient d’abord aux composants allergéniques immobilisés. Puis, après un lavage, les IgE fixées sur les allergènes sont détectées à l’aide d’un anticorps anti-IgE humains couplé à une molécule fluorescente. Les résultats des tests sont quantifiés à l’aide d’un scanner de biopuce (CAPITALBIO LusScan) et analysés avec le logiciel ImmunoCAP® ISAC (MIA software).
L’ImmunoCAP® ISAC permet de poursuivre l’exploration diagnostique des patients qui ont développé un profil de sensibilisation complexe (tels que les patients polysensibilisés) dont l’analyse requiert la recherche d’IgE spécifiques vis-à-vis d’un plus grand nombre de composants. Il aide à optimiser la prise en charge grâce aux applications maintenant bien connues du diagnostic moléculaire de l’allergie :

  • Il permet de différencier une sensibilisation spécifique d’une réactivité croisée afin de mieux cibler le traitement spécifique (immunothérapie, éviction).

  • Il permet d’évaluer le degré de sévérité de ces réactions.

  • Les 103 composants allergéniques ont été sélectionnés pour couvrir un large spectre d’allergènes : pollens d’arbres, graminées, herbacées, acariens, phanères d’animaux, moisissures, latex, aliments, venins d’insectes. Un sérum de calibration permet de rendre un résultat quantitatif en unités ISU (ISAC Standardized Units).

  • Les résultats rendus sont présentés selon 2 classements :

    • Par groupes de protéines (marqueurs spécifiques d’espèce, marqueurs de réactivité croisée), accompagnés d’un commentaire précisant pour les marqueurs de réactivité croisée, leur rôle dans la symptomatologie.

    • Par source allergénique, avec pour chacune le détail des IgE spécifiques des différents composants dont elle est constituée. ImmunoCAP® ISAC permet d’établir un profil complet de réactivité IgE, qui sera particulièrement intéressant pour différencier les marqueurs spécifiques d’espèce, des panallergènes responsables de réactivités croisées et rarement en cause dans la symptomatologie.

Ce test permet donc d’apporter de nouvelles informations au diagnostic et d’améliorer la prise en charge de ces patients polysensibilisés. Ce nouveau test basé sur les allergènes recombinants marque une révolution dans le diagnostic de l’allergie et entraînent une transition progressive vers le diagnostic moléculaire (Component Resolved Diagnosis - CRD). Ceci ouvre la voie à une immunothérapie hautement spécifique, sur mesure pour le patient, dès que de nouveaux réactifs thérapeutiques basés sur des composants allergéniques recombinants seront disponibles. ImmunoCAP® ISAC est le premier outil diagnostic in-vitro exclusivement basé sur des composants allergéniques.
2.5. Le Centre Hospitalier Universitaire de Liège
Le laboratoire de Chimie Médicale du CHU de Liège (Prof. JP Chapelle) fut le premier laboratoire belge (octobre 2008) à acquérir l’innovante technologie des microarrays pour le diagnostic in-vitro des allergies et, à ce jour, le laboratoire fait partie des trois laboratoires de référence pour les analyses complexes que sont les déterminations des allergènes recombinants par microarrays.
2.6. Conclusions
La connaissance moléculaire des allergènes a permis une meilleure compréhension des réactions croisées biologiques et des réactions croisées pertinentes sur le plan clinique. Elle fournit au quotidien une explication aux réactions simultanément positives en tests cutanés, elle permet de mieux identifier les réactions croisées entre allergènes respiratoires, entre allergènes alimentaires, et bien sûr entre allergènes respiratoires et alimentaires.
L’évolution des connaissances en matière d’allergènes a eu pour conséquence que le clinicien a du modifier son raisonnement lorsqu’il effectue un diagnostic allergologique et que les laboratoires de Biologie Clinique ont du s’adapter aux nouvelles méthodes de diagnostic in-vitro et ce, pour accroître la pertinence du diagnostic.
Les apports de la biologie moléculaire ont modifié la prise en charge du patient allergique. Le clinicien dispose dès à présent de nouveaux outils pour le diagnostic in-vitro qui lui permettent de mieux déterminer l’importance des sensibilisations vis à vis des allergènes moléculaires présents dans des sources allergéniques complexes
2.7. Les allergènes recombinants, application au laboratoire.


  • Etude A: Evaluation de la technique de microarray sur les 86 premiers patients pour lesquels l’ImmunoCAP ISAC a été réalisé (article soumis, Annnexe 1).


2.7.A.1. Matériel et méthode :
2.7.A.1.1. Sélection de patients 
Nous avons sélectionné 86 patients (26 hommes, 60 femmes ; âge moyen = 30 ans) sur base de leurs taux d’IgE spécifiques pour des allergènes recombinants ou naturels purifiés mesurés grâce à l’ImmunoCAP® 250 (Phadia, Uppsala, Sweden). Tous avaient subit une anamnèse auprès d’un allergologue et chacun d’entre-eux avaient un diagnostic d’hypersensibilité de type 1 posé. Les IgE spécifiques dosés étaient dirigés vers les sources allergéniques reprises dans le tableau 1.
Tableau 1: Classification des 555 IgE spécifiques mesurés avec l’ImmunoCAP®250 (CAP) et l’ImmunoCAP® ISAC (ISAC) incluant la famille de protéine et leur fréquence dans l’étude.


Allergen source

Component

Occurrence in the study

Protein family

or function

Foods

 

 

 

Peach (Prunus persica)

rPru p 1

26

PR-10

 

rPru p 3

13

nsLTP

Kiwi fruit (Actinidia deliciosa)

rAct d 8

5

PR-10

Peanut (Arachis hypogea)

rAra h 1

16

Storage protein, 7S globulin

 

rAra h 2

9

Storage protein, Conglutin

 

rAra h 3

10

Storage protein, Glycinin

 

rAra h 8

15

PR-10

Brazil nut (Bertholletia excelsa)

rBer e 1

10

Storage protein, 2S albumin

Hazelnut (Corylus avelana)

rCor a 1

10

PR-10

 

rCor a 8

14

nsLTP

Celery (Apium graveolens)

rApi g 1

10

PR-10

Sojabean (Glycine max)

rGly m 4

11

PR-10

Wheat (Triticum aestivum)

rTri a 19 Gliadin

8

Gliadin

Egg white (Galus domesticus)

 

 

 

Ovomucoid

nGal d 1

1

Ovomucoid

Carp (Cyprinus carpio)

rCyp c 1

12

Parvalbumin

Cod (Gadus callarias)

rGad c 1

9

Parvalbumin

Cow (Bos domesticus)

 

 

 

Alpha-lactalbumin

nBos d 4

2

Alpha-lactalbumin

BSA

nBos d 6

1

Serum albumin

Casein

nBos d 8

3

Casein

Lactoferrin

nBos d lactoferrin

1

Transferrin

Shrimp (Penaeus aztecus)

rPen a 1

11

Tropomyosin

Grass pollen

 

 

 

Timothy grass (Phleum pratense)

rPhl p 1

18

Grass group 1

 

rPhl p 11

11

Ole e 1-related protein

 

rPhl p 12

8

Profilin

 

rPhl p 2

13

Grass group 2

 

nPhl p 4

12

Berberine bridge enzyme

 

rPhl p 5

9

Grass group 5

 

rPhl p 6

12

Grass group 6

 

rPhl p 7

5

Ca Binding protein

Occupationnal allergens

 

 

 

Latex (Hevea brasiliensis)

rHev b 1

5

Rubber elongation factor

 

rHev b 3

2

Small rubber particle protein

 

rHev b 6

9

Hevein precursor

 

rHev b 8

6

Profilin

 

rHev b 11

1

Chitinase

Tree pollen

 

 

 

Birch (Betula verrucosa)

rBet v 1

29

PR-10

 

rBet v 2

14

Profilin

 

rBet v 4

11

Ca Binding protein

Cypress (Cupressus arizonica)

nCup a 1

5

Pectase lyase

Olive (Olea europaea)

nOle e 1

19

Common olive group 5

Weed pollen

 

 

 

Mugwort (Artemisia vulgaris)

nArt v 1

7

Defensin

 

nArt v 3

9

nsLTP

Saltwort (Salsola kali)

nSal k 1

3

Pectin methylesterase

 

 

 

 

Venoms

 

 

 

Honey bee (Apis mellifera)

rApi m 1

2

Phospholipase A2

Epidermals and other poteins

 

 

 

Cat (Felis domesticus)

rFel d 1

18

Uteroglobin

 

nFel d 2

7

Serum albumin

Dog (Canis familiaris)

rCan f 1

15

Lipocalin

 

rCan f 2

6

Lipocalin

 

nCan f 3

10

Serum albumin

Mites

 

 

 

House dust mite

nDer p 1

13

Cysteine protease

(Dermatophagoides pteronyssinus)

rDer p 10

5

Tropomyosin

 

rDer p 2

12

NCP2 family

Microorganism

 

 

 

Aspergillus fumigatus

rAsp f 1

14

Mitogillin family

 

rAsp f 6

16

MnSOD

Alternaria alternata

rAlt a 1

21

 

Carbohydrate Determinants

 

 

 

Bromelin (Ananas comosus)

nAna c 2

11

Cross-Reactive Carbohydrate determinants


Nous avons également réalisé un ImmunoCAP® ISAC sur 2 échantillons présentant des concentrations d’IgE totales supérieur à 10000 KU/L et ce, afin de s’assurer qu’il n’y avait pas de fixation non spécifique des IgE.
2.7.A.1.2. Dosages.
Pour chacun de ces patients, une recherche du profil de sensibilisation par microarray a été réalisée selon la procédure recommandée par le fabricant.

En tout, 555 mesures d’IgE spécifiques pour des allergènes recombinants ou naturels purifiés ont été dosés.
2.7.A.2. Résultats :
Trois cent quatre-vingt quatre résultats parmi les 508 mesures sont des valeurs d’IgE positives (>0,10 kUA/L) en CAP et les 171 autres sont des dosages d’IgE négatifs (<0 ;10 kUA/L) en CAP.

Lorsque nous avons comparé les résultats fournis par l’ImmunoCAP® ISAC avec les dosages d’IgE spécifiques obtenus par la méthode traditionnelle (ImmunoCAP®250), nous avons observé que 302 des 384 résultats positifs en CAP étaient également rendus positifs par l’ISAC. (concordance= 78.65%). Pour ces 82 résultats discordants, la moyenne des valeurs d’IgE en Cap était de 0.67±2.06 kUA/L. Nous avons observé que 52 de ces 82 résultats discordants étaient <0.35 kUA/L, l’ancien cut-off de l’ImmunoCAP®. Si nous prenons ce cut-off en considération, la concordance des résultats positifs est de 92.19% (voir le Tableau 2).
Tableau 2: Comparaison des 555 résultats d’IgE spécifiques mesurés avec l’ImmunoCAP©250 (CAP) et l’ImmunoCAP© ISAC (ISAC) selon les 2 différents cut-off (0.10 and 0.35 kUA/L) pour l’ImmunoCAP©


 

ISAC < 0,30 ISU

ISAC ≥ 0,30 ISU

CAP < 0,1 kUA/L

160

11

CAP ≥ 0,1 kUA/L

82

302

CAP < 0,35 kUA/L

212

27

CAP ≥ 0,35 kUA/L

30

286



Sur les 171 résultats <0,10 kUA/L en CAP, nous avons observé que 160 résultats sont également retrouvés négatifs en ISAC (concordance= 93.57 %). La moyenne des 11 valeurs discordantes est de 1,57±3,56 ISU.
Nous n’avons pas constaté de fixation non spécifique des IgE jusqu’à une concentration >150000 KU/L.
Nous avons remarqué que les discordances apparaissaient plus fréquemment avec certains allergènes spécifiques (voir Tableau 1). Parmi ces allergènes retrouvés négatifs en ISAC mais positifs en CAP, nous avons retrouvé notamment rAsp f 1 (7 résultats discordants sur 14 mesures), rPru p 3 (5 résultats discordants sur 13 mesures), nAna c 2 (4 résultats discordants sur 11 mesures), rApi g 1 (4 résultats discordants sur 10 mesures).
2.7.A.3. Discussion.
Dans cette étude, nous avons voulu comparer les résultats d’IgE spécifiques de 86 patients, c’est-à-dire, un total de 555 dosages d’IgE pour des allergènes recombinants ou naturels purifiés, mesurés en ImmunoCAP et en ImmunoCAP ISAC, un nouvel outil diagnostic basé sur la technologie des microarrays. La concordance des résultats positifs a été retrouvée à 78.65% et la moyenne des 82 résultats discordants a été retrouvée à 0.67±2.06 kUA/L. Néanmoins, 52 de ces résultats discordants étaient <0.35 kUA/L, l’ancien cut-off de l’ImmunoCAP 250. Si on tient compte de ce cut-off, la concordance des résultats positifs aurait été de 92.19%. Nous avons remarqué que les discordances apparaissaient plus fréquemment avec certains allergènes spécifiques. Parmi ces allergènes retrouvés négatifs en ISAC mais positifs en CAP, nous avons retrouvé notamment rPru p 3 (5 résultats discordants sur 13 mesures). La moyenne des résultats de rPru p 3 discordants (positifs en ImmunoCAP) était de 2, 14 kUA/L, ce qui est un taux relativement élevé. Cependant, ce point est de grand intérêt car rPru p 3 est une protéine de transfert lipidique (LTP), une famille de protéine extrêmement importante. En effet, une sensibilisation à rPru p 3 est souvent associée à des réactions systémiques en addition à un syndrome oral allergique, principalement dans le sud de l’Europe. Cette protéine, étant stable à la chaleur, peu causer des réactions même aux aliments cuits. La concordance pour les résultats négatifs a été retrouvée à 93,57%. Toutes ces discordances, aussi bien les valeurs positives que les négatives, pourraient peut-être trouver leur explication par une différence de présentation de l’allergène. En effet, les allergènes, qu’ils soit fixés à la matrice d’un CAP ou coaté sur une lame de téflon ne présentent peut-être l’épitope d’une manière différente. Il est possible que les protéines immobilisées ne permettent pas la reconnaissance avec les IgE. En ce qui concerne la spécificité, nous avons retrouvé une excellente spécificité vis-à-vis des IgEtot puisque nous n’avons pas retrouvé de fixation non spécifique des IgE avec la technique d’ImmunoCAP ISAC jusqu’à un taux de 150000U/L. En ce qui concerne les contrôles de qualité, le suivi d’une technique de microarray est difficile à mettre en place. En effet, il est presque impossible d’imaginer un CQ avec des positivités pour chacun des allergènes testés. D’après nous, le plus important des paramètres à surveiller est la variation de lot à lot. Dans notre étude, nous avons donc utilisé du sérum d’un patient polysensibilisé comme contrôle du lot. Une publication de Kricka et al atteste que les techniques de microarray nécessitent des protocoles standardisés et particulièrement focalisé sur la phase préanalytique. En effet, une unique erreur de dilution peut induire de nombreux résultats erronés.
2.7.A.4. Conclusions
Récemment, l’ImmunoCAP ISAC est apparu sur le marché pour réaliser du Component-Resolved-Diagnosis. Nos résultats ont démontré que le microarray a un bon fonctionnement analytique après comparaison des 555 IgE spécifiques avec les résultats fournis par l’ImmunoCAP 250. Néanmoins, il est nécessaire d’avoir une meilleure sensibilité pour certains allergènes comme rPru p 3.


  • Etude B: Allergènes recombinants et ImmunoCAP®, apport dans le cadre de l’allergie à l’arachide et/ou à la noisette (travail de Anna Blanco, Annexe 1)


2.7.B.1. Introduction
Les allergies aux arachides ou aux noisettes sont très fréquentes et sont parfois associées à des symptomatologies mortelles, en plus de syndrome d'allergie orale (OAS). En fait, les IgE spécifiques pour les extraits d'arachide et de noisette (respectivement f13 et f17) sont utilisés pour le diagnostic in-vitro de l'allergie, mais ces mesures ne nous permettent pas de prédire les symptômes cliniques du patient. Le but de notre étude était d'évaluer l'utilisation d'allergènes recombinants pour réaliser du Component-Resolved-Diagnosis (CRD) pour les allergies à l'arachide et l'allergie aux noisettes. Notre objectif était aussi de voir si CRD pourrait permettre une meilleure prise en charge de ces patients sensibilisés à l’un de ces fruits secs. .

2.7.B.3. Méthodes
Soixante-deux patients cliniquement bien définis ont été sélectionnés sur la base des résultats positifs (> 0.10kUA/L) pour les IgE f13 (n=38) ou f17 (n=24) mesurées sur l’ImmunoCAP© 250. Nous avons donc décidé de mesurer les IgE contre 2 allergènes recombinants de noisette (rCor a 1 et rCor a 8), 5 allergènes de l'arachide (rAra h 1-2-3-8-9) et contre les déterminants carbohydrates (CCD) chez ces patients. Au total, 276 dosages d’IgE spécifiques pour des recombinants avaient été dosés. Selon les résultats, nous avons évalué les résultats cliniques des 62 patients.
2.7.B.4. Résultats.
Parmi les 62 patients, 36 (càd 58%) ont été sensibilisés à une protéine de type PR-10 (Bet v 1-like: Cor a 1: n = 14 ou Ara h 8: n = 22). Comme la sensibilisation aux protéines PR-10 est généralement associée à des symptômes mineurs, comme l'OAS, aucune éviction alimentaire ne devait être initiée chez ces patients. Neuf des 62 patients (14,5%) ont présenté des IgE positives pour une prtéine de type lipide-Transfer-proteins (LTP) (Cor a 8: n = 4 ou Ara h 9: n = 5). Nous avons découvert 12 (19,3%) sensibilisations aux protéines de stockage (Ara h 1: n = 5, Ara h 2: n = 3, Ara h 3: n = 4) qui sont les principaux allergènes de l'arachide. Comme la sensibilisation aux LTP et aux protéines de stockage peut provoquer des réactions graves, une éviction stricte a dû être recommandée à ces patients. Cinq patients avaient des IgE positives pour les CCD, qui sont associés à des résultats faussement positifs in-vitro, mais sont, semble-t-il, sans pertinence clinique.

2.7.B.. Conclusions.
Nos résultats ont montré que, chez les patients présentant des IgE positifs pour f13 ou f17, la détermination des différents allergènes recombinants nous a permis d'évaluer les résultats cliniques de ces patients. Comme la sévérité des symptômes est corrélée avec le profil de sensibilisation, ce qui pourrait aider les cliniciens à prendre la bonne décision lorsqu’un régime d’éviction strict doit être initié ou non.

4. Conclusion :
La route de la découverte des profils de sensibilisation est tracée…
Les dosages d’IgE spécifiques pour les extraits allergéniques sont toujours utiles en première intention mais ils ne permettent pas toujours de conclure (multiple positivités des tests, manque de précision). En effet, les IgE spécifiques pour les extraits pas toujours significatifs.

Échecs de désensibilisation

Ne permettent pas d’évaluer la sévérité des réactions allergiques

Contribuent parfois à des régimes d’éviction trop larges…

Le CRD est entre nos mains.

Sensibilisations peuvent causer des erreurs de diagnostic (et erreurs thérapeutiques également).

Familles de protéines décrites, similarités de structure (homologie de chaînes d’acides-aminés ou homologie de structure)

Allergie à une seule protéine peut causer des réactions croisées à d’autres protéines de la même famille.

Allergènes recombinants permettent de se focaliser sur un (ou plusieurs) allergène(s) d’une source :

Disponibilité en CAP (et/ou en ISAC) ou en cours de développement…

L’ImmunoCAP ISAC est un outil de choix pour évaluer le profil de sensibilisation d’un patient :

Polysensibilisé, atopique

Dont l’anamnèse n’est pas très claire

Dont les prick tests donnent beaucoup de positivités.
L’ImmunoCAP ISAC permet de travailler sur une quantité MINIME de sérum (20µL) et de gagner du temps (et finalement de l’argent).
La technique permet d’éviter les régimes d’éviction trop larges et d’améliorer le confort de vie du patient allergique/atopique…
Le dosage de tryptase

Un taux basal élevé indique une augmentation du risque de réaction sévère

dans l’allergie aux venins et médicamenteuse

Avant et pendant l’IT pour venins (ImmunoThérapie spécifique)
Les Western Blot peuvent apporter une aide au diagnostic mais nécessite encore un travail important de la part du laboratoire…

Les tests de BAT et de CAST ne sont pas à utiliser en première intention.

Ils sont complémentaires aux tests cutanés et IgEs.

Intérêt particulier quand ces tests ne peuvent être réalisés ou aboutissent à des résultats douteux en comparaison avec l’anamnèse clinique.

Les microarrays peuvent nous être profitables, dans des cas difficiles :

103 recombinants or allergènes naturels purifiés en une seule détermination…

Validation analytique de l’ImmunoCAP© ISAC :

Concordance : 86% (résultats négatifs) et 94% (résultats positifs)
L’ImmunoCAP© ISAC a un rôle à jouer dans le diagnostic et le soin aux patients avec des profils de sensibilisation complexes.
Comme cette technique génère potentiellement des résultats inattendus, la réalisation et l’interprétation d’un microarray doivent être évalués en parallèle avec la clinique du patient.
Interprétation des résultats difficile :

Destiné aux spécialistes !

Nous sommes là pour vous aider…

similaire:

7. Bibliographie p18 iconBibliographie thématique restreinte (1995-2006) Vous pouvez consulter...

7. Bibliographie p18 iconBibliographie “Peripherie und Zentrum”
Bibliographie récapitulative” in: Haïti: Lettres et l’être, Toronto: gref 1982

7. Bibliographie p18 iconBibliographie p. 22

7. Bibliographie p18 iconBibliographie p 4

7. Bibliographie p18 iconBibliographie

7. Bibliographie p18 iconBibliographie

7. Bibliographie p18 iconBibliographie. 69

7. Bibliographie p18 iconBibliographie

7. Bibliographie p18 iconBibliographie

7. Bibliographie p18 iconBibliographie, sitographie








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