Synthèse : organisation du génome








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UE11 – Parcours Génétique – UMR 2 – Cours n°3

Le 29/02/2016

Jean-Michel Dupont

jean-michel.dupont@cch.aphp.fr



RT : Wassila Touron

RL : Benoit Ladrette





Structure et organisation des chromosomes


Plan :


  1. La fibre de chromatine

    1. La chromatine-Fibre de 11nm

    2. Le nucléosome

    3. Il n’y a pas une mais des chromatines

    4. La chromatine-Fibre de 30nm

    5. Une nouvelle proposition : Le Polymer Melt




  1. Structure et organisation du génome pendant l’interphase




  1. Structure des chromosomes métaphasiques

    1. Le chromosome

    2. Protéines associées

      1. Topoisomérase II

      2. Condensines

      3. Cohésines

    3. Le centromère

      1. Définition

      2. Le kinétochore

    4. Les télomères

      1. Définition

      2. Rôle




  1. Synthèse : organisation du génome


Ce cours portera sur la structure du chromosome, sur son organisation dans la cellule en lien avec sa fonction, ainsi que sur la dynamique du génome, à la fois pendant et entre les cycles cellulaires.

Ces dernières années, les nouveaux outils de la biologie moléculaire nous ont permis d’avancer énormément dans la compréhension de l’état de notre génome dans le noyau de la cellule. Alors même que l’on connaissait l’agencement de la double hélice et la séquence de l’ADN, le niveau supérieur d’organisation restait mal connu, avec un probable enroulement et une compaction en chromosomes. Bien qu’il existe encore des zones d’ombres, on connaît aujourd’hui mieux l’organisation des molécules d’ADN les unes par rapport aux autres.


  1. La fibre de chromatine




    1. La chromatine


L’ADN, en tant que molécule (2nm de diamètre), est toujours associé à des protéines, histones ou non histones (jamais libre dans le noyau). L’association de la molécule d’ADN et de ces protéines est appelée chromatine. Le niveau le plus déroulé, le plus « débobiné » de chromatine que l’on a pu obtenir expérimentalement correspond à une fibre de 11nm appelée « Collier de perles » à cause de son aspect caractéristique en microscopie électronique. Cette fibre correspond au simple agencement de la molécule d’ADN autour des histones, et il est probable que cette fibre de 11nm n’existe en réalité qu’in vitro.



    1. Le nucléosome


Le nucléosome est le cœur de l’agencement de la chromatine. Il est constitué d’un octamère d’histones (2xH2A, 2xH2B, 2xH3, 2xH4) autour duquel sont enroulées 146 paires de bases (soit 1,65 tours). Les nucléosomes sont espacés les uns des autres d’environ 200 pb ; cet ADN qui les sépare est appelé ADN linker.

En plus de l’octamère d’histones (2xH2A, 2xH2B, 2xH3, 2xH4), il existe une histone H1 dont le rôle est de stabiliser l’enroulement de l’ADN autour du cœur du nucléosome. Elle permet à elle-seule d’arriver à une compaction x30 ou x40 de l’ADN. D’autres protéines non histones sont également présentes ; il faut se rappeler que l’ADN, avant d’être extrait et purifié, n’est jamais « pur » dans la cellule.

Penchons-nous à présent sur la structure des histones :
Ces protéines histones est extrêmement conservée dans la nature (peu de variants) et toutes constituées sur le même modèle : séquences d’hélices alpha reliées par des boucles. Comme pour toute protéine, on reconnaît une extrémité N-terminale et une extrémité C-terminale. Les extrémités N-terminales ont un rôle très important : elles vont s’étendre en périphérie et être le siège de modifications chimiques pour le nucléosome, puisqu’elles servent de cibles pour des interactions avec des enzymes ou des protéines de reconnaissance spécifiques.


Autre point important : si l’ADN s’enroule autour des nucléosomes, c’est grâce à des liaisons hydrogènes qui maintiennent également les différentes histones entre elles.

Il va donc falloir dérouler la molécule d’ADN et briser ces liaisons hydrogènes (puis les reconstruire) pour lire le code génétique. In vivo, il y a donc une consommation d’énergie inhérente à l’utilisation du génome par les cellules. Toute modification physico-chimique de l’ADN ou des histones va ainsi pouvoir modifier la force de ces liaisons et donc la puissance d’interaction entre l’ADN et les histones, c’est-à-dire la facilité d’accès à l’ADN.
Au sein des différentes familles d’histones, il existe des variants qui vont permettre à certaines régions du génome d’acquérir des propriétés spécifiques. Ces variants peuvent être liés à des modifications de séquence ou à des associations de l’histone à d’autres domaines non histones.
Exemples:

  • Il existe des histones spécifiques des cassures de l’ADN, c’est-à-dire que lorsque l’ADN est cassé, la reconnaissance de cette cassure, avant même sa réparation, va consister à remplacer les histones au point de cassure par un type particulier.

  • L’histone CENP-A, variant de l’histone H3, qui est retrouvée uniquement au niveau des centromères.


Les variations des histones peuvent aussi être liées à l’état de leurs extrémités N-terminales ; certains acides aminés peuvent en effet être la cible de modifications chimiques particulières, dont les plus importantes sont :

  • Acétylation

  • Méthylation

  • Phosphorylation


L’acide aminé reste donc le même, on a juste une légère modification de ses propriétés physico-chimiques, ce qui va changer les propriétés de l’histone et donc moduler la structure et la compaction de la fibre de chromatine.
Schématiquement, on peut dire que :

  • Pour des histones globalement acétylés, on a une diminution du nombre de charges positives, d’où un ADN moins étroitement associé aux histones (puisque la molécule d’ADN est chargée négativement et que les charges négatives se repoussent entre elles). On assiste donc à une modification des liaisons hydrogènes avec une conformation de la fibre de chromatine plus lâche, plus ouverte.

  • A l’inverse, pour des histones méthylés, on a une forme plus compacte de la chromatine.


On remarque donc que le degré d’accessibilité à l’information génétique est modulé par simple modification chimique de quelques acides aminés.
Le motif chimique que constitue la méthylation ou l’acétylation peut aussi servir de cible de reconnaissance pour des protéines qui vont intervenir dans la conformation tridimensionnelle de la chromatine.


    1. Il n’y a pas une mais des chromatines :




Hétérochromatine Euchromatine
On peut définir deux formes fonctionnelles majeures de la chromatine :

-L’euchromatine : forme plus ouverte, ADN plus accessible : expression génique possible.

-L’hétérochromatine : forme compacte, nucléosomes associés très étroitement les uns aux autres avec impossibilité pour le complexe multiprotéique de transcription de dégager l’ADN des histones et donc de lire le code génétique.
Attention : ce ne sont pas des situations figées, et c’est là tout l’intérêt ! Certains gènes peuvent être exprimés ou inhibés : on a une modulation très fine par changement de conformation (au cours d’interaction avec des éléments extérieurs ou de la différenciation par exemple).


    1. La chromatine - Fibre de 30nm




Comme expliqué au début du cours, la fibre de 11nm n’existe probablement pas in vivo. Le niveau d’organisation supérieur est donc la fibre de 30nm, dont l’existence est aussi remise en question car elle est difficilement observable. Les premières hypothèses supposaient un enroulement en ressort de la fibre de 11nm pour former celle de 30nm. Plusieurs expériences ont été réalisées, mais il s’agit d’une question difficile puisqu’on se trouve entre l’échelle moléculaire et l’échelle microscopique. De nombreux modèles d’enroulement ont été proposés, dont le solénoïde simple et le solénoïde double. Le dernier en date est le modèle dit « en zig-zag », soit deux colonnes parallèles de nucléosomes reliées par un ADN linker droit, avec un angle de 70° entre les deux colonnes.



En effet, on s’aperçoit que la taille observée est très sensible aux conditions expérimentales (21 à 44nm, soit du simple au double !). On observe également des liaisons trop proches (25 à 50 kB) pour que cela colle avec la géométrie du modèle en zig-zag.

De plus, l’observation de cette fibre dépend de la concentration en nucléosomes dans le noyau (la fibre est observée dans des conditions qui ne sont pas physiologiques, à de faibles concentrations en nucléosomes : il pourrait donc s’agir d’un artefact).


    1. Une nouvelle proposition : Polymer Melt


Un autre modèle tend aujourd’hui à remplacer celui de la fibre de 30nm. En effet, la très forte concentration de nucléosomes dans le noyau entraînerait un phénomène de polymérisation de ces derniers. On a donc un mélange amorphe, non organisé, de nucléosomes formant une sorte de gouttelette de chromatine extrêmement dense, et qui correspond à une région complètement inaccessible pour les activités enzymatiques du génome : c’est donc une inactivation fonctionnelle de la région en question.

Les autres domaines, en périphérie des gouttelettes, formeraient alors la zone active de la chromatine (concentration plus faible en nucléosomes). La concentration en nucléosomes ne serait donc pas homogène dans le noyau.

II-Structure et organisation du génome pendant l’interphase
Le génome humain est composé de 46 molécules d’ADN (46 chromosomes). Comment cohabitent ces molécules ? La réponse est complexe car nous manquons d’outils ; en effet la microscopie électronique, en noir et blanc, est insuffisante.

Dès le XIXème siècle, les scientifiques se sont intéressés à ce que l’on appelait alors la substance héréditaire : était-elle organisée aléatoirement dans le noyau ? Ou rangée par territoires ?

On voit apparaître diverses théories uniquement basées sur des suppositions, comme celle de Rabl (chaque molécule porteuse d’une information dans le noyau occupe une région qui lui est propre) ou celle de Comings (pas de placement particulier des molécules dans le noyau). Cette question est très longtemps restée ouverte, sans réelle piste de réponse, jusqu’à il y a une vingtaine d’années, grâce à des progrès dans les techniques d’étude.


La technique qui a permis de grandes avancées est l’hybridation in situ fluorescente, car on disposait de fluorochromes de couleurs différentes. On pouvait ainsi repérer spécifiquement deux molécules d’ADN différentes, et observer la place de chacune.

On peut utiliser la microscopie confocale pour obtenir, par reconstruction des noyaux cellulaires en 3 dimensions.
On observe donc que chaque molécule, mais aussi chaque sous-segment de molécule (bras court et bras long par exemple) a une place spécifique, et que cette organisation est présente même pendant l’interphase.

On peut aller jusqu’au niveau de sous-bandes : 1 région=1 domaine particulier.
Ces techniques permettent maintenant de marquer l’ensemble des chromosomes d’une cellule ; on constate qu’il n’y a pas ou peu de superposition entre les différents territoires chromosomiques.

Chez l’Homme, on arrive à une « carte » complexe. Cependant l’emplacement de chaque molécule n’est pas prédictible. Les positions des chromosomes et leur voisinage sont variables en fonction des types cellulaires et pour un même type cellulaire. Cependant, on peut remarquer des fréquences particulières pour certaines associations, pour des raisons fonctionnelles. Ces associations laissent deviner une implication en pathologie de par la proximité entre certains chromosomes.



Exemple d’association fonctionnelle :

On observe une association des bras courts des chromosomes acrocentriques (qui sont les chromosomes 13, 14, 15, 21, 22). Or ces bras courts contiennent les gènes codants pour les ARN ribosomaux, synthétisés dans le nucléole. Le nucléole, site de transcription des ARNr dans le noyau, n’est en réalité que l’expression morphologique de la production de ces ARNr. Ces régions se colocalisent logiquement au même endroit, de manière fonctionnelle.


Ci-dessus : Nucléoles

F : Centre fibrillaire (gène ARNr inactifs, gènes actifs en périphérie)

D : Composé fibrillaire dense (transcrits primaires, premières étapes de maturation)

G : Composé granulaire (maturation des transcrits)

Le schéma des territoires dans le noyau montre que chaque territoire occupe un espace bien défini, délimité par un espace interchromatinien relié aux pores nucléaires. C’est dans cet espace que circulent, entre autres, les produits de transcription.


Hypothèse alternative : MR Branco, 2006,

Une équipe de chercheurs a utilisé une autre méthode de préparation que la technique classique avec fixation de la cellule par du méthanol et de l’acide acétique (qui pourrait altérer la conformation de la chromatine) : la technique de coupe par congélation avec cryosections ultrafines (150nm). Ils observent alors une zone de recouvrement des territoires voisins : près de 40% du territoire de chaque chromosome est entrelacé avec le voisin.

Donc selon cette théorie, il n’existerait pas d’espace interchromatinien séparant chaque territoire Par conséquent, on aurait des échanges entre boucles de chromosomes différents, ce qui pourrait expliquer certaines anomalies chromosomiques ou des phénomènes de transcription commune pour des chromosomes situés sur des gènes différents.


La microscopie électronique permet de mettre en évidence un fin réseau d’espaces dépourvus de chromatine à l’intérieur des territoires. Le noyau est composé de 50% de chromatine et de 50% de « trou », d’autre chose. On peut le vérifier par l’expérience : on utilise des cellules vivantes transfectées avec une histones marquée à la GFP (protéine fluorescente verte). La chromatine est donc marquée en vert. On utilise ensuite du Br-UTP (Bromo-déoxyuridine, en rouge) qui s’intègre dans les ARN pendant la transcription et permet donc de visualiser les sites de transcription. En superposant les images, on remarque qu’en effet, là où il n’y a pas de chromatine, on trouve bien des produits de transcription qui se déversent dans les espaces interchromatiniens, lesquels sont des canaux vers les pores nucléaires.
Cet espace interchromatinien s’insère à l’intérieur du territoire comme une éponge et va avoir plusieurs rôles :

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