Les apports de la biologie moléculaire








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Cours spécialité SVT TS 2

Les apports de la biologie moléculaire

Depuis le début du XXe siècle, la localisation des gènes sur les chromosomes est admise. Leur fonction est proposée en 1941 par Beadle : « à chaque gène correspond une enzyme », ou plutôt une chaîne polypeptidique, mais le support moléculaire des gènes est encore inconnu.
I – L’avènement de la biologie moléculaire


  • En 1944, Avery et son équipent montrent, à l’aide d’expériences de transformation de Pneumocoques inoffensifs en Pneumocoques virulents, que la molécules d’ADN est le principe actif de cette transformation.

  • Ce n’est que dix ans plus tard, grâce aux travaux de Chase et Hershey, que la molécule d’ADN est reconnue comme support de l’information génétique. Ils travaillent sur des virus (composés d’une coque protéique contenant un molécule d’ADN) capables d’infecter les bactéries, de s’y multiplier et de les lyser. En utilisant des molécules marquées par radioactivité, ils montrent que seule la molécule d’ADN viral pénètre dans la bactérie et est donc porteuse de l’information génétique permettant la reconstitution totale d’une particule virale.

  • En 1953, Watson et Crick proposent le modèle moléculaire de la structure de la double hélice d’ADN.

  • En 1957, Meselson et Stahl montrent que la réplication de la molécule d’ADN se fait suivant un mode semi-conservatif. Crick et Brenner, au début des années 1960, démontrent que la séquence en acides aminés d’une protéine est déterminée par des triplets non chevauchants de nucléotides, appelés codons. Le code génétique sera décrypté en 1966.

  • Jacob et Monod fondent la génétique bactérienne au début des années 1960 et, avec elle, la génétique moléculaire ; ils sont les premiers à proposer un mécanisme moléculaire, expérimentalement fondé, d’expression et de régulation de l’expression de gènes, ce qui leur vaudra le prix Nobel en 1965.

  • Leurs résultats rendent plus évidentes des expériences réalisées par Pardee, Jacob et Monod qui montrent, dès 1961, que l’ARN joue un rôle f’intermédiaire entre l’ADN et la synthèse protéique (l’ARN messager sera découvert par Brenner et Jacob à la fin des années 1960).


II – Les principes de la technologie de l’ADN recombinant


  • La « technologie de l’ADN recombinant » consiste à extraire de l’ADN d’un organisme donneur, à le découper en fragments qu’on insère dans un vecteur moléculaire capable de transformer génétiquement un hôte cellulaire. Cette technique a permis de mieux comprendre l’organisation et le fonctionnement des génomes et de mettre en œuvre des techniques de manipulation de ces derniers.

  • Dans un premier temps, il faut extraire l’ADN du donneur, puis celui du vecteur qui peut être un plasmide bactérien. L’étape suivante consiste à couper l’ADN grâce à des endonucléases ou enzymes de restriction (la première enzyme de restriction est identifiée et purifiée en 1970), capables de reconnaître spécifiquement une courte séquence nucléotidique, de quelques bases, et de cliver ce site. Certaines enzymes permettent d’obtenir des extrémités cohésives pouvant former des liaisons avec des séquences complémentaires. Les molécules seront soudées entre elles grâce à une enzyme, l’ADN ligase, qui crée des liaisons phosphodiester. On obtient ainsi une molécule d’ADN recombinant qui peut être amplifiée.

Certains sites de restriction peuvent disparaître par mutation, mettant en évidence le polymorphisme de l’ADN.
III – Les techniques de clonage et de séquençage


  • Dès 1972, ces techniques permettent au généticien de construire une banque d’ADN où tous les fragments issus de molécules d’ADN génomique ont été isolés, purifiés et amplifiés, puis d’identifier dans la banque, le clone contenant le gène recherché.




  1. Le plasmide, vecteur de clonage




  • Le plasmide bactérien est un bon vecteur de clonage car c’est une molécule d’ADN de petite taille, facile à extraire et à purifier, puis à manipuler in vitro. Il est également facile de le réintroduire dans des bactéries, de sélectionner les bactéries ainsi transformées, au sein desquelles le plasmide se réplique.

  • Les plasmides utilisés aujourd’hui contiennent au moins :

    • Une séquence de clonage dans laquelle existent plusieurs sites uniques de linéarisation afin de générer, selon les fragments à cloner, les séquences cohésives adéquates.

    • Un gène de sélection afin de sélectionner les bactéries transformées. Il s’agit, en général, d’un gène de résistance à un antibiotique.




  1. L’obtention d’une banque d’ADN génomique




  • Une fois l’ADN génomique découpé par des enzymes de restriction, les fragments sont introduits in vitro dans le vecteur. Une suspension de bactéries est transformée par ces plasmides. Un crible de sélection approprié permet d’identifier les clones bactériens portant les plasmides recombinants.

  • Chaque clone cellulaire renferme un seul type de plasmide : des fragments d’ADN génomique ont donc été isolés, purifiés et amplifiés.

  • L’ensemble des clones constitue une banque de fragments d’ADN génomique. La première banque génomique humaine complète a été obtenue en 1978.




  1. L’identification d’un clone




  • L’identification du clone contenant le gène est, chaque fois, une stratégie particulière qui dépend de ce qu’on connaît du gène : connaissance partielle de sa séquence nucléotidique, de la séquence peptidique du produit codé, localisation chromosomique…




  1. L’utilisation de l’ADN cloné




  • Une fois cloné, un gène ou le fragment d’un gène peut être séquencé. La méthode la plus utilisée, celle de Sanger, consiste à réaliser in vitro la séquence des deux brins.

  • Le brin complémentaire est utilisé comme matrice sur laquelle vient s’hybrider une amorce de synthèse qui correspond à une séquence du plasmide bordant la zone de clonage. L’amorce permet à une ADN polymérase d’assurer la synthèse de la séquence étudiée, synthèse qui peut être interrompue par l’incorporation d’un didésoxyribonucléotide (ddNTP).

  • Si l’amorce est marquée, le séquençage se fait en quatre tubes distincts renfermant chacun un ddNTP ; si les ddNTP sont marqués avec des fluorochromes différents, la réaction peut être faite dans un seul tube (depuis 1990). Une électrophorèse permet de séparer selon leur taille les fragments produits et se terminant soit par A, soit par G, soit par C, soit par T. Sur l’ensemble du séquençage, on obtient tous les fragments possibles, différents les uns des autres par un seul nucléotide. Ces techniques permettent de connaître la séquence d’un gène et confirment le polymorphisme de l’ADN.

  • Une fois connue la séquence totale ou partielle d’un gène, il n’est plus utile de le cloner pour en avoir de grandes quantités mais il suffit de l’amplifier in vitro.

  • Un procéder appelé réaction en chaîne de polymérisation, ou PCR, a été mis au point en 1985.

  • Le concept de gène a évolué : « un gène – une enzyme », puis « un gène – un polypeptide », sachant que certaines protéines sont formées de plusieurs chaînes codées par des gènes différents.


Les techniques de la biologie moléculaire ont révolutionné ce concept en montrant l’extraordinaire complexité de l’organisation des gènes (existence, dans un gène, de séquences non codantes ou de régulation), de leurs modes d’expression et de régulation (un même gène peut coder des protéines très différentes dans deux types cellulaires ou à deux moments différents), au point qu’il convient mieux aujourd’hui de parler « des gènes » que du gène.


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