Paris Saclay Proposition de stage 2016-2017








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date de publication18.10.2016
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Master Biologie Santé

Paris Saclay

Proposition de stage 2016-2017


Titre du stage : Etude du mécanisme d’encapsidation de l’ARN viral du Virus Respiratoire Syncytial par la nucléoprotéine N
5 Mots clés

VRS

Nucléoprotéine

Polymérase

ARN

virus



Responsable de l’équipe d’appui : Dr. J.F Eléouët
Intitulé et adresse du laboratoire : Biologie Moléculaire des Paramyxovirus
Maître de stage : Nom, prénom : Eléouët Jean-François

Email : jean-francois.eleouet@jouy.inra.fr Tél : 01 34 65 26 40
Description du stage :
Le Virus Respiratoire Syncytial (VRS) est le principal agent responsable des bronchiolites sévères du nourrisson et du veau. A ce jour, ni vaccin pour l’homme ni antiviraux efficaces ne sont disponibles contre ce pathogène. Le VRS est un virus enveloppé de la famille des Paramyxiviridae. Son génome, de polarité négative, est associé de façon constitutive à la nucléoprotéine N. Ce complexe N-ARN est reconnu spécifiquement par la polymérase L grâce à l’interaction médiée par la protéine P. La protéine P joue également le rôle de protéine chaperon en maintenant la protéine N néo-synthétisée sous forme monomérique et libre d’ARN (N0), interaction nécessaire pour l’encapsidation spécifique de l’ARN viral au cours de la réplication du génome viral.

Les travaux de l’équipe portent sur la caractérisation fonctionnelle et structurale des protéines constituant le complexe polymérase du VRS, avec pour objectif la recherche finalisée d’inhibiteurs de ce complexe. L’équipe a notamment une grande expertise concernant la caractérisation des interactions entre les protéines N et P. Toutefois, les mécanismes impliqués dans la spécificité d’encapsidation du génome viral par la protéine N0 restent à ce jour mal connus. Les difficultés d’obtention de protéine N monomérique sans ARN N0 constituent un frein majeur pour réaliser l’étude de ces mécanismes in vitro. En effet, la protéine N présente une forte affinité pour l’ARN et une forte tendance à oligomériser. C’est pourquoi lors de sa production en bactérie, elle interagit de façon non spécifique avec les ARNm bactériens. La purification de N recombinante monomérique a récemment pu être réalisée dans l’équipe soit par expression d’un mutant de N n’interagissant pas avec l’ARN (mutant K170AR185A) (Galloux et al, 2015), soit par délétion des trente résidus N-ter de N et co-expression avec le N-ter de P (données non publiées). Toutefois, l’étude de l’encapsidation nécessiterait l’obtention de N sauvage monomérique.

Afin de mieux caractériser les ARN encapsidés par la protéine N recombinante produite chez E. Coli, les ARN présents dans les anneaux de N-ARN ont été purifiés au laboratoire et les séquences analysées par RNA-seq (JF Eleouët et plateforme Image de Gif-sur-Yvette, données non publiées). Cette analyse a permis de mettre en évidence que les ARN contenus dans ces anneaux contiennent en grande majorité l’extrémité 5’ des ARN bactériens.

Une différence majeure entre ARNm procaryotes et eucaryotes consiste en l’absence de coiffe en 5’ des ARNm procaryotes. En effet, dans les cellules eucaryotes, les ARN messagers subissent des modifications post-transcriptionnelles en 5’ et en 3’. L’ARN est transcrit par l’ARN polymérase II et débute par un nucléotide 5’ triphosphate (5’PPP). Cette extrémité est clivée par une triphosphatase, et une série de modifications va ensuite conduire à la formation d’une coiffe en 5’. Les ARN procaryotes, quant à eux, ne subissent aucune modification et présentent une extrémité 5’ triphosphate. De même, les ARN génomiques et antigénomiques viraux ne possèdent pas cette coiffe 5’ et restent donc sous forme 5’ triphosphate.

Au vu des résultats de séquençage des ARN bactériens encapsidés, l’hypothèse selon laquelle la protéine N présenterait une spécificité d’interaction pour les 5’ triphosphate a été émise. Cette hypothèse permettrait d’expliquer la spécificité d’encapsidation du génome viral par N dans les cellules eucaryotes.
Le projet proposé par l’équipe consiste à étudier la spécificité d’interaction de N avec les ARN en cellules euraryotes, par des approches couplées de biologie moléculaire, biochimie et biologie cellulaire. Ce stage visera plus spécifiquement à comparer la capacité de N à interagir avec les ARN cellulaires dans des cellules présentant ou non des ARN 5’PPP. En effet, le laboratoire dispose de la lignée BSRT7 (cellules de rein de hamster) exprimant la polymérase T7 cytoplasmique qui génère des ARN 5’PPP. Les complexes N-ARN-P seront notamment purifiés afin de procéder à l’analyse des ARN par technique de RNA seq.

Enfin, l’influence de modifications post-traductionnelles de N (méthylation et phosphorylation) sur sa capacité à interagir avec l’ARN sera étudiée. Par analyse par spectrométrie de masse de la N purifiée de cellules eucaryotes, le laboratoire a récemment identifié 5 résidus potentiellement méthylés. De même des résidus sérine et thréonine présentant une forte probabilité de phosphorylation ont été identifiés en surface de N. L’ensemble de ces différents résidus seront mutés individuellement. L’impact des mutations sur l’activité du complexe polymérase sera dans un premier temps étudié grâce à un test fonctionnel (minigénome) disponible au laboratoire. L’impact des mutations critiques sur la capacité de N à interagir avec les ARN sera alors étudiée par immunoprécipitation.

Références (2 ou 3)

1 : Ouizougun-Oubari M, Pereira N, Tarus B, Galloux M, Lassoued S, Fix J, Tortorici MA, Hoos S, Baron B, England P, Desmaële D, Couvreur P, Bontems F, Rey FA, Eléouët JF, Sizun C, Slama-Schwok A, Duquerroy S. A Druggable Pocket at the Nucleocapsid/Phosphoprotein Interaction Site of Human Respiratory Syncytial Virus. J Virol. 2015 Nov;89(21):11129-43.

2 : Galloux M, Gabiane G, Sourimant J, Richard CA, England P, Moudjou M, Aumont-Nicaise M, Fix J, Rameix-Welti MA, Eléouët JF. Identification and Characterization of the Binding Site of the Respiratory Syncytial Virus Phosphoprotein to RNA-Free Nucleoprotein. J Virol. 2015 Apr 1;89(7):3484-96.

3: Sourimant J, Rameix-Welti MA, Gaillard AL, Chevret D, Galloux M, Gault E, Eléouët JF. Fine mapping and characterization of the L polymerase-binding domain of the respiratory syncytial virus phosphoprotein. J Virol. 2015 Apr;89(8):4421-33
Parcours de M2 :  GCD  GEN2EV
Profil de l’étudiant recherché (formation initiale) :

- Biologie Cellulaire

- Biologie Moléculaire







Ce stage peut-il se poursuivre par une thèse : OUI NON

Ecole Doctorale de Rattachement :
Nom de la personne titulaire d’une HDR qui encadrerait la thèse : Dr J.F Eléouët
Accord de principe pour proposer le sujet (éventuellement modifié) à un étudiant de M1 (stage de 7-8 semaines généralement de mi-avril a mi-juin) si votre proposition n’a pas été pourvue par un étudiant de M2 : OUI


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