Résumé Ce stage s’inscrit dans la continuité des travaux du Pr. Zine qui contribuent au développement d’une nouvelle thérapie cellulaire pour pallier aux surdités neurosensorielles








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date de publication01.04.2017
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AUZANNEAU Margaux

Première année de Master Biologie Santé

Cellules souches de l’oreille interne : Biologie et applications thérapeutiques.


Maître de stage : Professeur ZINE Azel

Institut des Neurosciences de Montpellier

INSERM U583

Directeur : Professeur C.HAMEL


Résumé

Ce stage s’inscrit dans la continuité des travaux du Pr. Zine qui contribuent au développement d’une nouvelle thérapie cellulaire pour pallier aux surdités neurosensorielles.

La cochlée, ou limaçon, est l’organe responsable de l’audition situé dans l’oreille interne. La transduction du signal sonore s’effectue grâce à des cellules sensorielles qui constituent l’épithélium cochléaire : les cellules ciliées. Chez l’homme, ces cellules sensorielles ne se renouvellent pas et leur perte conduit à une surdité neurosensorielle.

In vivo, la différenciation des cellules ciliées est régie par des gènes clefs de la famille bHLH comme Hes1 et Math1 [1]. Nous avons transfécté des cellules souches / progénitrices cochéaires pour forcer l’expression de ces gènes et tenter d’obtenir in vitro de nouvelles cellules ciliées.

A terme, la greffe de ces cellules pourrait permettre la régénération de l’épithélium cochléaire et la restauration de la fonction auditive.
Introduction :

La recherche sur les cellules souches embryonnaires est très controversée au niveau éthique et politique. En 2006, pour contourner ces problèmes, Shinya Yamanaka démontrait que des fibroblastes de souris adultes mais aussi humains pouvaient être reprogrammés en cellules souches pluripotentes induites (iPS) par transduction rétrovirale de quatre gènes : c-Myc, Klf4, Oct4 et Sox II [2] évitant ainsi la manipulation d’embryons. Cependant, l’intégration aléatoire des vecteurs rétroviraux dans le génome des cellules provoque fréquemment la formation de tumeurs. Dans cet article, les auteurs ont choisi d’utiliser un vecteur non intégratif pour éviter ces anomalies génétiques.

Ils ont produit des cellules iPS humaines à partir de cellules fibroblastiques embryonnaires humaines (les IMR90) transduites par un adénovirus : le pShuttle-cytomégalovirus (CMV). Ainsi, cinq CMV ont été générés. Un premier, utilisé comme contrôle, exprimant le gène de la GFP et chacun des autres l’un des quatre gènes d’intérêt.

Les cellules IMR90 ont d’abord été incubées une première fois en présence des cinq CMV puis mises en culture dans un milieu spécifique pendant trente-quatre heures. Cependant ces adénovirus perdent leur expressivité après la division mitotique, aussi les auteurs ont réitéré l’opération une seconde fois au quatrième jour.

Au septième jour de culture, les cellules ont été dissociées et réensemencées sur une couche de fibroblastes embryonnaires murins. Enfin à partir du huitième jour les auteurs ont remplacé quotidiennement le milieu de culture par un milieu spécifique des cellules souches embryonnaires (ES).

Après vingt-cinq à trente jours de culture, 26 colonies de cellules présentant des caractéristiques morphologiques des cellules ES furent identifiées mais seules trois d’entre elles se sont révélées être de véritables iPS.

Ces colonies ont été marquées par immunofluorescence pour révéler l’expression de certains gènes spécifiques des cellules souches et des trois feuillets embryonnaires (Oct4, nanog, Nestin, Map2)

L’ADN génomique des cellules iPS humaines a été purifié et les cytosines non méthylées ont été converties en uracile puis différentes PCR ont été pratiquées. Les produits de ces PCR ont été clonés et séquencés. Les auteurs ont fait des caryotypes des cellules iPS humaines pour vérifier leur diploïdie et afin de confirmer que les clones été réellement issus des cellules IMR90, ils ont analysé les «short tandem repeat » (STR) de ces cellules.

Afin d’être sûr de la non-intégration du génome viral dans les trois lignées cellulaires iPS, une PCR ainsi qu’un southern blot ont été réalisés.

Le laboratoire dans lequel travaillent les auteurs étant impliqué dans la recherche sur la maladie de Parkinson, ils ont choisi de différencier les iPS en neurones dopaminergiques. Cette différenciation sert également de test sur le potentiel de différenciation de ces cellules iPS humaines.

La réussite de ce projet a tout d’abord démontré, que les cellules iPS humaines générées par des adénovirus sont pluripotentes et peuvent se différencier en cellules appartenant aux trois feuillets embryonnaires ; et que ces cellules n’ont pas d’ADN viral intégré dans leur génome, supprimant ainsi le risque d’apparition de tumeurs malignes. Les perspectives d’utilisation de ces cellules iPS seraient la création de cellules souches spécifiques pour chaque individu et le développement des autogreffes.

Pendant mon stage, nous sommes partis de cellules souches cochléaires (cellules souches adultes) dans l’espoir d’atteindre le même objectif thérapeutique.

Matériels et méthodes :

Microdissection de l’épithélium sensoriel : On enlève la strie vasculaire et le ganglion spiral de la cochlée.

L’épithélium cochléaire subit ensuite une dissociation enzymatique par la thermolysine puis par la trypsine (incubations de 30 minutes à 37°C).

Préparation de la plaque 24 puits : On dépose une lamelle ronde préalablement rincée à l’alcool 70°, dans chaque puits. On ajoute 500µl de poly ornithine à 0,1mg/L pendant 12 heures à 37°C. Après deux rinçages à l’eau, on incube avec 500µL de fibronectine à 5µg/L pendant 4 heures à température ambiante.

Milieu de culture NS (neurosphère) : DMEMF12, glucose (200g/L), glutamine (200 mM), N2, B27, insuline (10mg/mL), ciprofloxaxine (10mg/mL), B27, Héparane Sulfate (50ng/mL), EGF (20ng/mL) et FGF2 (10ng/mL).

Electroporation : «Optimization quick protocol » Microporator de Digital BioTM ». Les cellules sont centrifugées à 2100rpm pendant 5 minutes puis resuspendues dans le tampon R à raison de 10µL par puits(150 000 cellules pour 10µL de tampon R). L’électroporation s’effectue à l’interieur du cône de la pipette (Volume total : 10µL) placé dans une cuve contenant 3mL de tampon E. La machine est ensuite calibrée selon le programme désiré et les cellules sont ensemencées dans 500µL de milieu NS juste après le pulse.

Fixation des cellules : La plaque de 24 puits est centrifugée pendant 10 minutes à 1000 RPM. Le milieu de culture est remplacé par 500µL de PFA à 4%. Après 20 minutes à température ambiante, les lamelles sont rincées au PBS.

Immunocytofluorescence : Solution de blocage : NDS 10% triton 1% 1h à température ambiante.

Incubation anticorps primaire : NDS 1%, triton 0,1%

Myosine VIIA (1/200) Sox2 (1/150) Math1 (1/100)

Incubation anticorps secondaires : 2h RT

Donkey anti Rabbit CY5 (1/1500)

Donkey anti Goat Alexa 594 (1/1500)

Donkey anti Mouse Alexa 594 (1/1500)

Après montage, les lamelles sont analysées par microscopie à fluorescence(Apotome).
Résultats :

Pour atteindre notre but, nous avons transfecté les cellules par électroporation. Cette méthode consiste à créer des pores dans la membrane plasmique des cellules par un pulse électrique et permettre ainsi l’intégration des plasmides dans celles-ci. La membrane se régénère d’elle-même au cours de la culture si le pulse n’est pas trop intense. Les programmes d’électroporation sont définis par trois critères : le nombre de pulses, leur durée (ms) et leur intensité (V). Nous avons testé différents programmes (Figure 1 B) et déterminé le meilleur à chaque expérience en se basant sur le nombre de cellules vivantes et le nombre de cellule transfecté définit par l’expression du gène de la GFP contenu dans le plasmide (Figure 1 A).

Lors de la première expérience (Figure 2), le programme 5 (1200 V / 20ms / 2 pulse), s’est avéré être le plus efficace. Nous avons pu observer la présence d’un marquage GFP qui témoigne de l’intégration et de l’expression des gènes du plasmide (Hes1 et Math1). In vivo, Math 1 est nécessaire pour orienter la différenciation des cellules progénitrices cochléaires en cellules ciliées [1, 3]. Toutefois l’expression du gène Math 1 n’a pas pu être vérifiée en immunofluorescence (Figure 2-C). De plus, le nombre total de cellules transfectées obtenues (les cellules GFP positives) reste très faible, nous avons donc gardé le nombre de deux pulses au cours des essais suivants afin d’optimiser le taux de transfection. Malheureusement, ces cultures ont été contaminées (Figure 3) et nous n’avons donc pas pu obtenir de résultats.

Au cours de la troisième expérience (Figure 4), nous avons obtenus les meilleurs résultats avec le programme 1 (1100V / 20mS / 2 pulses). Nous avons obtenus quelques cellules exprimant la GFP lors de la transfection avec le plasmide Contrôle (Figure 4-A), mais pas avec les autres plasmides (Figure 4 B-C).

Enfin dans la quatrième expérience, (Figure 5), le même programme nous a de nouveau donné des résultats positifs. On peut voir que certaines des cellules transfectées avec le plasmide Hes 1 (Figure 5-B) expriment à la fois la GFP et Sox II. De plus, certaines cellules transféctées avec le plasmide Math 1 (Figure 5-C) expriment très nettement la GFP. Toutefois cette cellule ne possède aucun des critères morphologiques d’une cellule ciliée.
Conclusion  et perspectives :

La transfection par électroporation de nos cellules n’est pas un succès à part entière car le rendement obtenu est trop faible pour pouvoir exploiter cette méthode à grande échelle. Le nombre de cellules GFP positives était si peu élevé que le taux de transfection n’a pas été calculé. Nous avons donc tenté d’infecter nos cellules souches cochléaires par une forme atténuée du VIH : un lentivirus contenant le gène de la GFP. Cette méthode est encore optimisée actuellement.
ANNEXES :
Expérience 3

A

B

Expérience 4

Expérience 1

Expérience 2

Figure 1 : A Carte du Plasmide contrôle utilisé. Les gènes d’intérêt HES1 ou Math1 ont été insérés sur le site ECOR1 de ce plasmide. B Programmes utilisés pour la transfection avec le microporator pour chacune des quatre expériences.


B

DAPI

Sox2

GFP

M7A

A

DAPI

M7A

GFP

C

DAPI

Math1

GFP

M7A

Figure 2 : Expérience 1: Immunofluorescences sur cellules transfectées

A : plasmide contrôle programme 5, objectif 20 ; B : plasmide Hes 1 programme 5, objectif 20 ; C : plasmide Math 1 programme 5, objectif 40.

DAPI

M7A

GFP

Figure 3 : Expérience 2 : Immunofluorescence sur cellules transfectées.

Plasmide contrôle, programme 3, objectif 20.

C

DAPI

Math1

GFP

M7A

B

DAPI

Sox2

GFP

M7A

A

DAPI

M7A

GFP


Figure 4 : Expérience 3 Immunofluorescence sur cellules transfectées.

A : plasmide contrôle, programme 1, objectif 20 ; B plasmide Hes 1, programme 1, objectif 20 ; C plasmide Math 1, programme 1, objectif 20.

C

DAPI

Math1

GFP

M7A

A

DAPI

M7A

GFP

DAPI

Sox2

GFP

M7A

B


Figure 5 : Expérience 4 : Immunofluorescence sur cellules transfectées.

A : plasmide contrôle programme 1 objectif 20 ; B : plasmide Hes 1, programme 1, objectif 20 ; C : plasmide Math1, programme 1, objectif 20.

Bibliographie :
[1]: Ping Chen, Jane E.Johnson, Huda Y. Zoghbi and Neil Segil. The role of Math1 in inner ear development: Uncoupling the establishment of sensory primordium from hair cell fate determination. Development 129, 2002; 2495-2505.

[2]: Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast culture by defined factors. Cell 2006; 126:663-676

[3]: Kohei Kawamoto, Shin-Ichi Ishimoto, Ryosei Minoda, Douglas E. Brough and Yehoash Raphael. Math1 Gene Transfer Generates New Cochlear Hear Cells in Mature Guinea Pigs In vivo.The Journal of Neuroscience, June 1, 2003; 4395-4400.

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