Carte des territoires présomptifs de l’embryon de xénope








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Système UAS/Gal4



Mouche transgénique qui possède l’élément Pgal4 inséré aléatoirement dans le génome : si près d’un enhancer, il va contrôler son expression. Avec ce vecteur on peut cloner n’importe quel ADNc  lignée effectrice UAS
On réalise le croisement : Lignée pilote Gal4 (enhancer-trap) X Lignée effectrice UAS.
Pour que le gène que l’on a cloné sous le contrôle des séquences UAS s’exprime, il faut que le facteur de transcription gal4 reconnaisse les UAS. (Système binaire)
Gal4 est un facteur de transcription (issu de la levure) qui permet l'expression de gène en dehors de leur domaine d'expression par reconnaissance des sites UAS. On peut aussi remplacer LacZ/GFP par une toxine pour empêcher l'expression d'un gène et déterminer sa fonction.

Sans gal4 : pas d’expression du gène X. Ce système permet de contrôler l’expression spatio-temporelle du gène X

On a des centaines de lignées pilote différentes qui vont exprimer le facteur de transcription à des endroits et des moments différents car il sera inséré dans des endroits différents du génome donc sous le contrôle d’enhancers différents.
Pour voir où s’exprime Gal4 :

  • hybridation in-situ

  • immuno-fluorescence avec Ac anti-gal4

  • utilisation d’une lignée effectrice dans laquelle on a cloné le gène de la GFP en aval des UAS


Les mouches qui n’auront pas le balanceur ont le bon génotype qui exprime RE-GAL4 et UAS-GFP pour que gal4 puisse activer les UAS et donc faire exprimer la GFP

gène-trap



Contrairement à tout à l’heure, on n’attrape pas des enhancer mais des gènes grâce à de nouveau vecteur.

On ne clone pas de gène en aval des séquences UAS. Cet élément P s’intègre de façon aléatoire dans le génome.

EP X pilote gal4  active la transcription d’un gène qui se trouve à proximité du site d’insertion de l’élément P
Lignée pilote Gal4 (enhanceur-trap expression de gal4 dans l’aile) X Lignées effectrices UAS

On n’analyse pas une seule lignée EP. À chaque lignée, on étudie un gène différent.

UAS-RNAi




les micro-ARN



Les microARNs, mode de régulation post-transcriptionnelle de l’expression génique.

Découverte



Découverte du gène lin-4 : 693 pb sauvent le phénotype mutant

Problème: ces 693 pb ne codent pas pour une protéine.

Mais ces 693 pb produisent 2 petits ARNs:

  • de 61 nucléotides forme une structure hairpin (épingle à cheveux).

  • de 22 nucléotides correspond aux 22 premiers nt de l’ARN de 61 nt.


Délétion des régions complémentaires  phénotype gain de fonction de Lin-14  Augmentation de la protéine Lin-14

Augmentation de Lin-4  diminution des protéines Lin-14 sans modification de la quantité des mRNA lin-14

  • lin-4 régule l’expression de lin-14 post-transcriptionnellement, via des séquences complémentaires présentes dans le 3’UTR de lin-14



identification



microRNAs identifiés chez:

  • les animaux

  • les plantes

  • certains virus expriment des microRNAs (les virus à ADN)


Estimation : 300 microRNAs chez les vertébrés. Les microRNAs représentent 1 à 5% des gènes d’un génome.Il est possible de les détecter par in situ hybridation : expression tissu-spécifique des microRNAs : Expression au cours du développement
Par génétique

  • chez C .elegans: 1rs microRNAs, lin-4 et let-7

  • chez la drosophile: bantam

Peu de microRNAs identifiés lors de crible génétique à cause de leur petite taille
Par clonage de petits ARNs

Clonage des premiers microRNAs chez la drosophile et l’homme

identification des cibles



Prédiction: 200 gènes cibles par microRNAs.

Tous les types de protéines sont représentés, pas un type prédominant.

Dans 98% des cas, 1 site de fixation pour un microRNA par 3’UTR

Plusieurs microRNAs peuvent en théorie se fixer sur un même 3’UTR.

30% des gènes seraient régulés par les microRNAs.

Fonctions



Expression différente des microRNAs et des gènes cibles : exclusion mutuelle

microRNAs interviennent pour éviter une expression incorrecte de gènes

50% des gènes de microRNAs sont localisés dans des régions génomiques associées à des cancers

Les microRNAs pourraient jouer un rôle important dans la pathologie de certains cancers humains : oncogènes et suppresseur de tumeurs.

Les profils d’expression entre cellules normales et tumorales différents selon le type de tumeurs et le stade de la tumeur.

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