Solution de Giemsa : Giemsa : 1 ml, eau neutre qsp : 10 ml








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date de publication07.01.2017
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Diagnostic du paludisme

par Anne-Marie Deluol, H. Levillayer, Jean-Louis Poirot
Hôpital Saint-Antoine, Paris.
Le paludisme reste un des principaux problèmes de santé dans le monde. Même si des approches existent sur le plan vaccinal, son éradication ne sera probablement pas possible dans un avenir proche. Du point de vue thérapeutique, des molécules nouvelles ont été élaborées et d'autres seront nécessaires en raison des résistances qui s'installent.
Parallèlement à ces développements, des avancées existent également sur le plan diagnostique et il est important de préciser la place actuelle de chacune des nouvelles possibilités.
Cependant, l'examen microscopique d'un frottis mince et/ou d'une goutte épaisse colorée par le Giemsa est bien souvent la seule technique à notre disposition et demeure la référence pour l'évaluation des nouvelles méthodes diagnostiques apparues au cours de la dernière décennie.

I. Diagnostic microscopique classique :

frottis, goutte épaisse
Ils permettent d'établir un diagnostic d'espèce en ne nécessitant qu'un microscope optique et des colorants d'un coût modéré. La qualité du résultat dépend cependant beaucoup de l'expérience de la personne réalisant cet examen.
Un rappel de la technique et des caractères de chaque espèce plasmodiale est essentiel.
1. Technique du frottis sanguin
Le prélèvement doit se faire au moment de l'acmé thermique, soit par prélèvement capillaire au bout du doigt avec confection immédiate du frottis et de la goutte épaisse, soit par ponction veineuse avec prélèvement dans un tube contenant un anticoagulant (par exemple EDTA) et réalisation secondaire des lames d'examen. Le frottis doit être effectué avec soin de manière à ne comporter qu'une couche cellulaire.
La coloration ne doit pas comporter de dépôts de colorants qui gêneraient considérablement la lecture des lames et pourraient être cause d'erreur.
Le frottis, après coloration au Giemsa, sera lu avec la plus grande attention, à l'immersion, pendant 30 minutes environ, avant de rendre un résultat négatif. Le fait de trouver un élément parasitaire ne justifie pas l'arrêt de la lecture de la lame, il peut en effet exister un polyparasitisme.
Technique de la coloration au Giemsa
- recouvrir les lames d'alcool méthylique pendant 3 minutes, puis de Giemsa pendant 20 minutes pour le Giemsa lent, 10 minutes pour le Giemsa rapide ;

- rincer à l'eau neutre ;

- sécher ;

- lire la lame à l'immersion.
Solution de Giemsa : Giemsa : 1 ml, eau neutre qsp : 10 ml.
2. Technique de la goutte épaisse
Il s'agit d'une technique de concentration utilisable également pour les recherches de trypanosomes et microfilaires :
- Dépôt du sang: déposer, sur une lame de verre dégraissée, une grosse goutte de sang (2 fois le volume utilisé pour un frottis).

- Défibrination : en cas de prélèvement capillaire, pour empêcher la coagulation, avec le coin d'une autre lame ou la pointe d'un vaccinostyle, étaler régulièrement le sang sur une surface de 1 cm de diamètre, en tournant régulièrement pendant 2 minutes.

- Séchage : retourner la lame et laisser sécher à plat sur un support, soit pendant 24 heures à la température ambiante soit pendant 1 heure à l'étuve à 37 °C. Ne jamais fixer à la chaleur ou à l'alcool.
- Déshémoglobinisation : recouvrir abondamment la goutte épaisse du mélange Giemsa : 3 gouttes, eau neutre : 2 ml.

Laisser agir pendant 5 à 10 minutes jusqu'à décoloration complète. Fixer ensuite à l'alcool méthylique.
- Coloration : jeter le liquide avec précaution (risque de décollement de la pellicule de sang) et remplacer immédiatement par le mélange : Giemsa : 1 ml, eau neutre qsp : 10 ml. Laisser agir 20 minutes puis rejeter le liquide avec précaution. Laver à l'eau du robinet, en faisant couler le liquide très délicatement sur la lame. Sécher à l'air.
3. Étapes successives du diagnostic parasitologique
Reconnaissance de l'hématozoaire par :


  • sa situation intra-érythrocytaire (pour toutes les espèces, à tous les stades de leur évolution) ;

  • les caractères généraux de la forme plasmodiale : le cytoplasme très basophile

(exception avec le gamétocyte mâle souvent mauve ou rose) le noyau: azurophile

(rouge rubis ou grenat), unique ou fragmenté ; les inclusions pigmentaires provenant

du catabolisme de l'hémoglobine, l'hémozc;ine ou pigment brun/noir, de forme et

d'abondance croissantes au cours de l'évolution du Plasmodium, non visible dans les

trophozoïtes jeunes (sauf chez malariae), au maximum dans les gamétocytes.
Détermination du stade évolutif du parasite l'aspect du parasite varie en effet avec l'espèce en cause et avec son stade d'évolution (c'est-à-dire avec l'âge du parasite).


  • Formes asexuées :


- Trophozoïtes : ce sont les formes les plus jeunes, mobiles, forme annulaire pour toutes les espèces.
Aspect de bague à châton : anneau bleu, châton rouge, partie interne incolore (vésicule nutritive).
Ces formes très jeunes sont sensiblement identiques pour toutes les espèces.
- Schizontes : formes parasitaires débutant au moment où la chromatine commence à se diviser. En vieillissant, les schizontes perdent leur mobilité, augmentent de taille et subissent des divisions nucléaires.
À maturité, ils prennent la forme de rosaces :
- Rosaces. La rosace occupe la totalité de l'hématie parasitée. Les noyaux sont rejetés à la périphérie, le pigment parasitaire est ramassé en amas central. À maturité complète, l'hématie éclate et libère un nombre variable de mérozoïtes.

- Mérozoïtes. Ils sont de forme ovalaire ou arrondie ; ils possèdent un cytoplasme bleu et une masse de chromatine rouge ou violette après coloration (= noyau).


  • Formes sexuées (gamétocytes) :


Formes rondes ou ovalaires remplissant presque entièrement l'hématie. Ils se rencontrent plus tardivement que les formes asexuées. Leur diagnostic est important pour l'épidémiologie et la prophylaxie du paludisme.
Microgamétocytes (mâles) : cytoplasme pâle, mauve ou rose. Les noyaux de P. vivax, P. malariae et P. ovale, sont en masses granuleuses colorées en rouge par le Giemsa.
Macrogamétocytes (femelles) : cytoplasme bleu sombre. P. vivax, P. ovale et P. malariae noyau dense, coloré en rouge par le Giemsa.
Identification de l'espèce en cause :
Le frottis mince permet de mettre en évidence tous les détails morphologiques du parasite et de l'hématie parasitée.
La goutte épaisse permet un enrichissement important en parasites, mais la lecture est plus difficile. Les parasites apparaissent plus petits, leurs couleurs sont plus vives, les contours sont moins réguliers ; les parasites sont libérés des hématies et donc fragilisés.
4. Diagnostic d'espèce
Plasmodium falciparum

  • Frottis minces


Dans le sang périphérique, on ne trouve habituellement que des trophozoïtes de forme annulaire (le développement se poursuivant ensuite dans les capillaires profonds) et des gamétocytes.
- Trophozoïtes jeunes : aspect typique de bague à châton, de petite taille, anneau très mince, taille 1/3 à 1/5 de l'hématie. L'anneau peut être plus épais.

- Dans cette espèce, on observe souvent des formes à deux noyaux pour un seul anneau et plusieurs parasites dans une même hématie.

- Après traitement, on trouve souvent ces formes en périphérie de l'hématie, et dans certains cas, le noyau rouge semble sortir de l'hématie (forme marginée).

- Trophozoïtes plus âgés : l'anneau bleu foncé du cytoplasme est plus élargi dans la partie opposée au noyau.

- Gamétocytes : ils sont présents plus tardivement ou après traitement. Ils sont très typiques dans cette espèce : forme de croissant ou de banane, mais toujours intra-érythrocytaire ; ils remplissent l'hématie dont il est souvent difficile de voir le contour.
Microgamétocyte : cytoplasme mauve ou rose, forme trapue, extrémité arrondie, forme de banane, noyau coloré en rouge allongé, présence de grains de pigment brun/noir assez dispersés dans le cytoplasme.
Macrogamétocyte : cytoplasme bleu intense, forme plus élancée, en croissant. Noyau rouge condensé entouré de nombreux grains de pigment.
Aspect des hématies parasitées : toutes les hématies, quel que soit leur âge, peuvent être parasitées. Elles sont de taille et d'aspect normaux, normochromes, parfois bleutées, avec un contour crénelé. Dans l'hématie, on peut parfois observer des granulations irrégulières appelées taches de Maurer, en coup d'ongle, de couleur rouge brique.
Aspect qénéral du frottis: au cours des accès simples, le frottis est monotone, constitué uniquement de trophozoïtes avec un polyparasitisme fréquent des hématies. Lors des accès pernicieux, on constate un envahissement important des hématies par les trophozoïtes et souvent la présence de schizontes et de rosaces qui passent dans le sang périphérique. Les rosaces renferment de nombreux mérozoïtes (8 à 32), en général de 16 à 24. L'hématie garde une taille normale. Le problème de l'identification des accès pernicieux est particulièrement important, en raison de la sanction thérapeutique immédiate qu'elle doit entraîner. Il s'agit là de la seule mais vraie urgence parasitologique.


  • Goutte épaisse


Elle présente un intérêt dans les faibles infestations. C'est alors le Plasmodium le plus facile à reconnaître. On retrouve souvent l'anneau complet du trophozoïte, ou une partie seulement en raison de sa dislocation au moment de la technique (aspect en ailes d'oiseau, en point d'interrogation ou d'exclamation). Les trophozoïtes âgés conservent mieux leur aspect, on retrouve l'anneau bleu et le noyau rouge. Les gamétocytes sont en général intacts et sont donc facilement reconnaissables.
Plasmodium vivax

  • Frottis minces

- Trophozoïtes jeunes : 2 à 4 μm avec un cytoplasme en forme d'anneau bleu clair, un noyau en général unique, rouge, plus gros que dans P. falciparum. Le noyau est rarement divisé. Les formes très jeunes ressemblent à P. falciparum mais sont plus grandes. L'hématie est rose saumon.

- Trophozoïtes âgés : ils sont de grande taille : 5 μm. Au bout de 8 heures, ils possèdent une activité amiboïde marquée. Ils prennent alors une forme irrégulière, fantasque et tourmentée dite amiboïde. Un pigment verdâtre apparaît, réparti en masses irrégulières, fines, dans tout le cytoplasme du parasite.

- Schizontes : 6 à 7 μm, de forme ovale ou arrondie remplissant presque entièrement l'hématie distendue qui prend alors des formes variables et étranges. Le noyau est formé de grosses masses rouges de chromatine irrégulièrement réparties. On trouve dans le cytoplasme du parasite un pigment brunâtre, en petits amas fins éparpillés au centre et à la périphérie. - Rosace : le parasite occupe toute l'hématie ; elle contient 12 à 18 mérozoïtes, irrégulièrement distribués, avec un amas de pigment brun/noir au centre.

- Gamétocytes : microgamétocytes qui occupent toute l'hématie, cytoplasme mauve, gros noyau rouge rejeté sur le côté ; pigment peu abondant. Les macrogamétocytes : cytoplasme bleu foncé, noyau plus petit et plus compact, rouge sombre ou violet. Pigment en grains très fins, rejetés en principe à la périphérie du parasite.
Aspect des hématies parasitées : au stade du trophozoïte âgé, l'hématie parasitée est de grande taille et on voit apparaître des granulations orangées ou roses dans le cytoplasme de l'hématie non occupée par le Plasmodium : ce sont les granulations de Schüffner. Au stade schizonte, l'hématie est très augmentée de taille, très pâle avec de nombreuses granulations de Schüffner. Au stade rosace, les contours de l'hématie peuvent être anguleux.
Aspect général du frottis : très panaché, avec présence de tous les stades évolutifs. Le parasitisme est moins intense qu'avec P. falciparum.


  • Goutte épaisse

- Trophozoïtes jeunes : paraissent plus petits que sur les frottis. Souvent, l'anneau et le noyau sont fragmentés.

- Trophozoïtes âgés : cytoplasme plus abondant avec présence d'hémozoïne, contours moins nets, irréguliers.

- Gamétocytes : ils sont difficiles à différencier des schizontes ; leur cytoplasme est plus régulier et ils renferment plus de pigment.
Plasmodium ovale

  • Frottis minces

- Trophozoïtes jeunes : anneau petit mais large, bleu foncé avec un gros noyau rouge (plus gros que dans P. malariae). Apparition rapide de grosses granulations orangées : les granulations de Schüffner. Elles sont plus précoces que dans P. vivax.

- Trophozoïtes âgés: forme allongée ou ovoïde, cytoplasme bleu foncé, non amiboïde noyau rouge très net, gros et compact.

- Schizontes : arrondis ou ovales. Situés au centre de l'hématie. Le nombre de noyaux est variable selon le degré de maturation.

- Rosaces : 4 à 12 mérozoïtes (en général 8), organisés autour d'une masse centrale de pigment.

- Gamétocytes : arrondis, pâles. Pigment en forme de bâtonnets.

Aspect des hématies parasitées : taille normale. Lors de la confection du frottis, la pression provoque souvent une ovalisation des hématies parasitées, avec un aspect frangé des contours.



Aspect général du frottis: parasites en règle peu nombreux. Frottis polymorphe : présence de trophozoïtes, schizontes, rosaces et gamétocytes.


  • Goutte épaisse


Formes rondes ou ovales, compactes. Noyaux irréguliers. Il est très difficile d'établir un diagnostic d'espèce sur la goutte épaisse.
Plasmodium malariae

  • Frottis rninces

- Trophozoïtes jeunes : petits, compacts. Anneau bleu foncé, épais.
Dans le cytoplasme du parasite, on trouve un grain de pigment brun/noir.
- Trophozoïtes âgés et schizontes : formes variées, ovalaires, en bandelette ou en drapeau, typique de l'espèce. Le trophozoïte est allongé , un bout à l'autre de l'hématie, en position équatoriale. Pigment brun/noir, dispersé en masses grossières, dans tout le cytoplasme du parasite.

- Rosaces: cytoplasme plus foncé. Pigment brun/noir rassemblé en une masse compacte au centre, entouré d'un petit nombre de mérozoïtes (8 à 12), ovales, bleus, avec un noyau rouge régulièrement disposé à la périphérie qui donne l'aspect typique de marguerite à ces rosaces.
- Gamétocytes : ils ressemblent à ceux du P. vivax, mais sont plus petits, plus rares dans le sang circulant et surtout plus pigmentés (pigment grossier noirâtre).
Aspect des hématies parasitées : elles sont ,légèrement rétractées avec une tendance à l'hyperchromie.
Aspect général du frottis : diversité des formes évolutives. Formes très pigmentées. Abondance de pigment brun/noir grossier à tous les stades, donnant un aspect sale, foncé au parasite. Seules les hématies âgées sont parasitées, ce qui réduit la parasitémie. De ce fait, les parasites sont plus rares que dans les autres espèces.


  • Goutte épaisse


Trophozoïtes et schizontes sont difficiles à différencier de ceux de P. vivax. En revanche, les rosaces sont en général nombreuses et faciles à identifier en raison de leur aspect caractéristique en marguerite.
Il. Techniques indirectes de diagnostic
La technique traditionnelle de diagnostic, basée sur la coloration par le Giemsa, permet un diagnostic de certitude mais il nécessite de posséder un microscope correct et implique un microscopiste qualifié. C'est pour tenter de pallier ces inconvénients que des techniques de diagnostic indirect ont été mises au point. Elles peuvent être classées en plusieurs catégories : sérologie, microscopie de fluorescence (essentiellement technique QBC), recherche d'antispécifiques (méthodes dites des bandelettes) enfin détection d'acides nucléiques spécifiques (PCR). Nous exposerons les avantages et inconvénients de chacune d'entre elles sans les détailler techniquement.
1. Sérologie
Elle n'a pas d'intérêt pour un diagnostic d'urgence. La sérologie est surtout utilisée sur le plan épidémiologique et pour le diagnostic de certaines formes cliniques tel le Paludisme viscéral évolutif, au cours duquel le taux d'anticorps est très élevé.
La technique la plus couramment utilisée est celle de l'immunofluorescence indirecte en utilisant comme support des hématies parasitées. Comme toute technique sérologique, elle nécessite des réactifs annexes (antiglobulines humaines ... ) ainsi qu'un microscope plus coûteux. Par ailleurs, elle ne peut répondre à l'urgence du diagnostic dans la mesure où le temps passé est long et surtout parce qu'un résultat négatif ne peut exclure un accès palustre.
2. Microscopie de fluorescence
Ce groupe de techniques est basé sur l'utilisation de fluorochromes qui rendent fluorescents les acides nucléiques des parasites. Parmi les techniques décrites, celle dénommée QBC* (Becton Dickinson) a fait l'objet de nombreuses publications. Le sang est prélevé dans un tube micro-hématocrite contenant le fluorochrome (acridine orange) et un flotteur. Après centrifugation, ce dernier se trouvera dans la zone de densité correspondante à celle des hématies parasitées; il ne laisse qu'un film d'hématies entre lui-même et la paroi du tube, ce qui permet d'examiner cette zone à l'aide d'un dispositif adapté (porte-tube, microscope à fluorescence ou adaptateur sur j'objectif).
La sensibilité est de l'ordre de celle de la technique du frottis-goutte épaisse pour des infestations supérieures à 100 hématies parasitées par microlitre (mais inférieure en dessous de ce taux). Elle permet de distinguer les différentes espèces mais nécessite un appareillage ainsi que des réactifs coûteux et demande une certaine expérience.
3. Recherche d'antigènes (technique des bandelettes)
Plusieurs techniques sont disponibles actuellement : Parasight* (Becton Dickinson), ICT Malaria P.f. Test (ICT Diagnostics, distribué en France par les laboratoires Fumouze), OptiMal* (Flow). Elles sont basées sur la mise en évidence soit de l'Histidine Rich Protein 2, spécifique de P. falciparum (Parasight* et ICT Malaria*) soit de la Parasite Lactate Déshydrogénase (OptiMal*). Des anticorps monoclonaux dirigés contre ces enzymes sont fixés sur une bandelette de nitrocellulose ; après la mise en contact avec le sang, la présence de l'antigène est visualisée par action d'un deuxième anticorps révélateur (mono- ou polyclonal selon le test utilisé). La réponse est rapide (moins de 15 minutes), visuelle sous forme d'un trait sur la bandelette et ne nécessite donc pas de compétence particulière.
Parasight* et ICT Malaria* ne mettent en évidence que P. falciparum, alors que les quatre espèces peuvent être retrouvées avec le test OptiMal*. Ce dernier présente l'intérêt d'une possibilité de suivi (l'enzyme n'étant présente que chez le parasite vivant). La sensibilité, comparée aux techniques de coloration par le Giemsa, est bonne pour les parasitémies supérieures à 50 hématies parasitées par microlitre mais diminue pour un taux inférieur. Des réactions croisées sont possibles avec le facteur rhumatoïde (test Parasight*) mais un des principaux obstacles est le coût (environ 40 FF par test).
4. Détection d'acides nucléiques spécifiques (PCR)
Il s'agit certainement de la technique la plus sensible mais qui ne peut en aucun cas répondre au diagnostic d'urgence. Elle est très coûteuse, nécessitant un équipement et une compétence très particuliers. Elle permet une différenciation de souches et on la réserve essentiellement à l'étude des mutations et des gènes impliqués dans la résistance. Les techniques de biologie moléculaire sont devenues indispensables sur le plan fondamental mais ne sont pas utilisables pour le diagnostic biologique d'accès palustre.
III. Conclusion
Le diagnostic biologique du paludisme devrait pouvoir être effectué devant chaque suspicion clinique, afin de traiter de manière appropriée les individus parasités et limiter ainsi les traitement abusifs.
Des techniques indirectes ont fait leur apparition : la sérologie n'est pas adaptée au diagnostic d'accès palustre, les techniques de biologie moléculaire doivent être réservées à des laboratoires de recherche, la technique QBC nécessite un matériel approprié et une habitude pour la lecture, quant aux techniques par bandelettes, elles sont apparemment très attractives mais présentent un certain nombre d'inconvénients dont un des principaux est le coût.
Pour toutes ces raisons, la méthode de référence reste encore l'examen microscopique d'un frottis-goutte épaisse coloré par le Giemsa.


Développement et Santé, n° 138, décembre 1998

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