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Décembre 2004 n°223

Une version plus complète de ce bulletin est accessible sur le site de l'INRA www.inra.fr. sous son nom dans : Information Scientifique et Technique puis Publications INRA en ligne.

Le signe ### dans cette version papier indique quelques développements supplémentaires ou des commentaires additionnels consultables dans la version électronique. André BERKALOFF

e-mail : andre.berkaloff@igmors.u-psud.fr
Concepts et Techniques

1 On sait maintenant révéler simultanément la présence de cinq ARNs différents dans une seule cellule. La technique mise au point par Molecular Probes (un filiale d'Invitrogen) appelée marquage multiplex dérive de la technique connue FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) et permet de détecter les microRNA dans un embryon de Drosophila, ainsi que jusqu'à sept messagers naissants à leur site de transcription dans le noyau. A Constans; The Scientist 18 (11OCT04) 34. La technique n'est donc pas absolument nouvelle, mais sa résolution a été améliorée et permet, notamment, d'analyser plus de gènes dans une même cellule au lieu de reconstruire les images à partir de plusieurs cellules. Elle consiste à utilise une amplification par des sondes antisens où est incorporé de l'aminoallyl-UTP (plus facile à incorporer) qui est reconnu par des anticorps secondaires marqués par les marqueurs fluorescents Alexa Fluor® de Molecular Probes au lieu d'utiliser la technique de marquage à la digoxigénine suivie d'une révélation enzymatique. Elle comble le fossé entre le révélation in situ à haute résolution avec une ou deux sondes fluorescentes et les réseaux qui couvre une gamme plus large mais à faible résolution.

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2. L Sage; The Scientist 18 (11OCT04) 34, revient sur les avantages de la technique d'amplification linéaire des ARNs. Un minimum de 2 à 5 mg d'ARN est nécessaire à une amplification en sondes pour l'utilisation des réseaux d'expression. L'amplification des ARN pose quand même des problèmes, notamment d'inégalité dans l'amplification entre les divers ARNs récoltés. Une amplification exponentielle aggrave ce problème. Nugen a mis au point un technique d'amplification linéaire sans cycle thermique utilisant des hybrides ADN/ARN appelée Ribo-SPIA (Single-Primer Isothermal Amplification) qui permettrait de résoudre ce problème et donnent la quantité requise de cDNA en quatre heures à partir de 5 ng d'ARN initial.

La technique procède en trois étapes. Une étape initiale est une transcription réverse des messagers, utilisant une amorce chimérique ADN-ARN oligo-dT. Une ADN polymérase donne ensuite un double brin hybride avec la partie 3' du gène (oligo-dT). Cet hybride avec une séquence en 5' est soumis à une RNase H (dégradant uniquement la composante de l'hybride) rendant accessible un site d'hybridation pour une seconde amorce hybride SPIA sur la séquence pêchée. Une ADN polymérase déloge, enfin, la séquence complémentaire en en synthétisant une seconde. On peut, ainsi amplifier environ 10 000 fois le mARN à utiliser.

Mais, comme le composant ARN 5' de chaque ADN est dégradé au cours du processus, seule la copie originale du messager est donc amplifiée. On n'a donc pas à se préoccuper trop des contaminations. L'article original se trouve à A Dafforn et al.; BioTechniques 37 (NOV04) 4-7.

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3. ### Les rôles biologiques des ARNs se sont considérablement élargis depuis le début des années 80s avec la mise en évidence des ribozymes. Sont ensuite apparus les miRNAs et siRNAs avec l'interférence ARN (RNAi) associée. La structure des ribosomes a enfin été décrite et l'ensemble montrent l'importance de la structure des ARNs. Westhof et al.; Science 306 (01OCT04) 62-63, dans un bref point de vue, insistent sur les architectures des ARNs liées à ces fonctions. Ils s'appuient sur l'article d'AS Krasilnikov et al.; Science 306 (01OCT04) 104-107 qui analysent le domaine de spécificité de la RNase P (ribozyme) de Thermus thermophilus.

Cette enzyme avec une composante ARN et une protéique induisant la maturation de la partie 5' des ARNs de transfert. AS Krasilnikov et al. ont déterminé comment des structures relativement différentes peuvent reconnaître un même substrat.

Il existe deux types de RNases P bactériennes distinguées par leurs séquences de l'ARN type A ( d'Escherichia coli et T. thermophilus) et type B (Bacillus subtilis).

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4. La protéine Argonaute 2 (Ago-2) est la seule protéine requise pour l'activité du complexe RISC (double strand RNA-Induced Silencing Complex). Elle co-précipite avec la RNase III, Dicer. Les protéines Argonaute sont des protéines très fortement basiques d'environ 100 kDa contenant les deux domaines PAZ et PIWI (nettement différents bien que PAZ veuille dire Piwi-Argonaute-Zwille). La fixation de l'ARN guide ciblant l'action de Dicer est assurée par le domaine PAZ, mais la fonction du domaine Piwi n'était pas encore bien définie. La reconnaissance de cette fonction a été réalisée biochimiquement à partir d'une lignée cellulaire de Drosophile. Les auteurs ont repéré dans le domaine Piwi d'Ago-2, les acides aminés du site actif probable, qui présente une homologie avec l'endonucléase V. Les aspartates 965 et 1037 font partie de ces sites et y sont présents dans les homologues mammaliens et de l'archée Pyrococcus furiosus. TA Rand et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (05OCT04) 14385-14389. Voir également J Liu et al.; Science 305 (03SEP04) 1437-1441 pour le complexe RISC des Mammifères.

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5. Une séquence de 1 à 9 uridines est ajoutée aux intermédiaires du clivage des messagers à la suite de l'intervention des miRNAs. Cette addition accélère la dégradation des fragments de messagers. B Shen et al.; Science 306 (05NOV04) 997. Ceci a été montré chez Arabidopsis, la souris et le virus d'Epstein-Barr. Chez Arabidopsis, les deux fragments engendrés par le clivage au milieu de la séquence reconnue par le miRNA, sont en effet dégradés par des exonucléases 3'-5' (exosome) et 5'-3' comme AtXRN4.

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6. ### La spécificité "molle" de l'interférence ARN (RNAi) pose quand même des problèmes de dégâts collatéraux comme disent les militaires à propos des frappes dites "chirurgicales". Comme pour toutes les autres techniques basées sur les ARNs, pleines de promesses à leurs débuts, on commence à avoir des ennuis quand on passe de la théorie à une utilisation pratique, que ce soit en recherches fondamentales ou thérapeutiques. Le siRNAs inactivent beaucoup plus de gènes que prévus. Ceci jette un froid sur ces applications. Une analyse est parue avec J Couzin; Science 306 (12NOV04) 1124-1125.

Rosetta Inpharmatics (une filiale de Merck) a été le premier groupe à lever (difficilement, vus les dogmes) le lièvre lors de travaux avec des siRNAs chez les mammifères. Ces siRNAs se sont révélés beaucoup moins spécifiques que les agents pharmacologiques "témoins" visant les mêmes cibles. AL Jackson et al.; Nature Biotechnology 21 (JUN03) 635-63, voir également AL Jackson et al.; Trends in Genetics 20 (NOV04) 521-524. Ce groupe de Dharmacon en dénombre 40 en moyenne par les réseaux d'expression au lieu d'un seul. Mais ceci ne prouve pas pour autant qu'il en est de même au niveau des protéines qui peuvent être affectées ou non au niveau de la traduction. C'est ce que recherchent les scientifiques de Dharmacon. Phil Sharp a d'ailleurs constaté qu'un changement de deux fois de la transcirption peut se traduire par des différences de 10 fois au niveau de la protéine. Mais, au fond, la cellule sait corriger de telles variations et seul le phénotype cellulaire est important, et ces effets collatéraux ne sont peut être pas si gênants que cela.

Tout ceci n'est quand même pas clair dans le cas des animaux, et une compagnie comme Alnylam (fondée par Phil Sharp du MIT, voir le §111) n'hésite pas à développer une traitement à base RNAi contre la dégénérescence maculaire de la rétine. Cette pathologie est également abordée en essais cliniques par Acuity Pharmaceuticals depuis l'automne dernier. Le traitement direct de l'œil permet, en effet, d'éviter d'autres effets gênants.

Ceci n'est pas le cas dans les essais de traitement d'hépatites étudié par ailleurs, car on traite le foie qui est un remarquable amplificateur de dégâts, sans compter la distribution dans d'autres organes.

L'asymétrie des deux brins (ils sont complémentaires) est détectée par le complexe entre la protéine R2D2 et Dicer qui joue ici un rôle supplémentaire par rapport à celui de RNase III découpant les ARNs interférants (Y Tomari et al.; Science 306 (19NOV04) 1377-1380). L'orientation du complexe hétérodimérique définit lequel des deux brins va être associé à la protéine Argonaute 2 du complexe RISC. Une fixation efficace de R2D2 utilise le phosphate en 5' du brin qui va être exclu de RISC et cette protéine est à la fois un capteur de l'asymétrie thermodynamique de l'appariement à cette extrémité et une autorisation d'incorporation dans RISC des siRNAs qu'elle reconnaît. Mais si le complexe entre Dicer 2 et R2D2 est nécessaire, il n'est pas suffisant pour permettre le déroulement du double brin. C'est le RISC Loading Complex (RLC) qui s'en charge).

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7. Un quart des miRNAs naturels humains sont codés à partir de séquences introniques. Ils ont donc la même orientation que les pré-messagers. Ils peuvent donc utiliser les promoteurs des gènes dans lesquels ils sont insérés. Les autres séquences codant ces miRNAs sont regroupées et donnent probablement des transcrits polycistroniques. Dans tous les cas, le précurseur des miRNAs est un ARN en épingle à cheveux. Le complexe Microprocessor intervient dans la production des miRNAs. L'enzyme Drosha est, comme Dicer, une RNase III et elle clive les deux brins de la tige de l'épingle (voir le Bulletin de Juin 2004 §10), mais on ne sait pas trop bien si Drosha suffit à elle seule, ou si elle est associée à d'autres protéines.

. La Drosha humaine fait partie de deux complexes multiprotéiques. Le plus gros contient de nombreuses protéines dont des hélicases et des protéines de la famille du sarcome d'Ewing (facteur stimulant la réplicase réverse des télomères). Le plus petit, Microprocessor, est composé de Drosha et de DGCR8 (alias Pasha (Partner of Drosha), une protéine se liant aux ARNs doubles brins. RI Gregory et al.; Nature 432 (11NOV04) 235-240 et AM Denli et al.; p.231-235.

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8. Le complexe multienzymatique RecBCD traite les coupures doubles brins. C'est une hélicase bipolaire qui sépare les deux brins et qui digère chacun de ces brins jusqu'à ce qu'elle rencontre un point chaud de recombinaison (site Chi de séquence 5’-GCTGGTGG- 3’, toutes les ~5 kb chez E.coli). L'activité nucléasique diminue et RecBCD charge RecA sur la partie 3' de l'ADN. On vient de décrire la structure cristallographique de RecBCD lié à son substrat. L'ADN est déroulé à travers RecC en donnant les deux brins qui se dirigent vers deux sous-unités hélicases différentes où elle s'enfonce dans un tunnel et débouchent sur le domaine nucléase de RecB. Le passage de la partie 3' permet de reconnaître la séquence Chi par RecC. Le pilotage de ce tunnel permettrait la régulation du système. MR Singleton et al.; Nature 432 (11NOV04) 187-193.

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9. Les riboswitches sont à la mode (voir le Bulletin de Juin 2004 §22). Ces éléments régulateurs sont contenus dans la partie amont non traduite de messagers. Ces éléments jouent un rôle dans l'expression de gènes métaboliques de plus de 2% des gènes de Bacillus subtilis. Cette région est présente dans de nombreux gènes du métabolisme des purines et sont sensibles à la présence de guanine, interrompant la voie métabolique au niveau de la transcription quand la guanine (ou hypoxanthine ou xanthine) est abondante. On vient de décrire la structure à 1,95 Å du domaine reconnaissant les purines du riboswitch de l'opéron xpt–pbuX de B. subtilis lié à l'hypoxanthine. RT Batey et al.; Nature 432 (18NOV04) 411-415. Elle révèle une poche de l'ARN enveloppant presque complètement le ligand hypoxanthine qui stabilise la structure et favorise ainsi la formation d'un élément terminateur de la transcription.

Ceci est une invention de la nature faisant pendant aux tentatives d'aptamères artificiels basés sur les ARNs que l'on cherche à utiliser (voir le Bulletin d'Août 2004 §93, par exemple).

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10. Le "contrôle qualité" des messagers est plus connu et le NMD (Nonsense-Mediated mRNA Decay) est l'un d'entre eux qui repère les messagers contenant un codon de terminaison intempestif. Par contre si le NMD est universel, les mécanismes sous-jacents présentent des différences appréciables. On vient de décrire une astuce du système chez la Drosophile. MA Valencia-Sanchez et al.; Trends in Cell Biology 14 (NOV04) 594-597, font le point sur ce sujet.

Cette reconnaissance dépend de la traduction. Chez les Mammifères, elle ne peut avoir lieu qu'au premier round de traduction du messager juste après sa transcription. Dans ces conditions le messager est encore lié à la CBP80 (Cap Binding Protein). Plus tard, au cours des cycles ultérieurs de traduction, le messager est lié au facteur d'initiation de la traduction (eIF4E), et n'est plus sujet au NMD.

Chez S. cerevisiae, la NMD s'attaque aux messagers aussi bien juste après transcription qu'au cours des rounds suivants. La reconnaissance des codons stop intempestifs est réalisée en fonction de sa position par rapport au complexe jonction des exons en aval (EJC, qui indique que le messager déjà épissé n'est pas "terminé" à ce niveau). Ce complexe est éliminé au moment où eIF4E remplace CBP80. Le complexe ne semble pas être utilisé en NMD par les autres organismes

Chez tous les eucaryotes le NMD fait intervenir les protéines Upf1, Upf2 et Upf3 que l'on retrouve chez D.melanogaster plus les facteurs Smg1, Smg5 et Smg6, qui, avec Smg7, sont présents partout, sauf chez S.cerevisiae. Par contre, la reconnaissance des cibles est beaucoup plus proche de celle de la levure. Généralement la dégradation NMD par l'exosome a lieu aux deux extrémités du messager. D Gatfield et al.; Nature 429 (03JUN04) 575–578 ont montré que, chez la Drosophile, la dégradation des messagers délabrés lieu grâce à un clivage endonucléasique au niveau du codon stop intempestif, suivie par une dégradation exonucléasique du fragment aval par Xrn1 et par l'exosome pour la partie amont.. Voir également D Gatfield et al.; EMBO Journal 22 (01AUG03) 3960-3970. Les auteurs ont inactivé les participants normaux de la NMD par RNAi et ont eu la surprise que rien ne correspondait au schéma général des eucaryotes. La Drosophile utilise de façon combinatoire des composants de plusieurs systèmes différents de NMD.

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11. R Sablowski; Trends in Cell Biology 14 (NOV04) 605-611, se penche sur le fait qu'animaux comme plantes ont besoin de disposer de cellules de remplacement (cellules souches) mais qu'ils répondent à ce besoin de façon différente.

Dans les deux cas, le maintien du statut indifférencié dépend d'interactions cellulaires disponibles dans des niches spéciales, comme le germarium dans le cas des cellules souches germinales de la Drosophile. Il semble qu, dans les deux cas, la détermination du sort cellulaire soit assurée par des mécanismes très comparables et a probablement précédé l'apparition des organismes multicellulaires.

L'auteur se concentre sur la comparaison de cellules souches germinales de la Drosophile, des cellules souches hématopoïétiques de la souris et les cellules méristématiques caulinaires et racinaires des plantes.

La niche est définie par le rayon d'action des signaux émis par un tout petit nombre de cellules. Les cellules filles finissent, à la suite de divisions asymétriques ou non, par s'éloigner assez du centre d'émission pour ne plus pouvoir y répondre, elle se déterminent ensuite et se différencient.

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12. La levure Schizosaccharomyces pombe se contente d'un seul type des trois classes de protéines indispensables à la RNAi: la nucléase découpant les ARNs Dicer (Dcr1), l'ARN polymérase ARN-dépendante (RdRP; Rdp1) amplifiant les ARNs et Argonaute (Ago1). Elles assurent le "silencing" au niveau des centromères et la formation de l'hétérochromatine au niveau du locus du type sexuel.

Plantes et animaux codent, eux, de multiples exemplaires de ces protéines. Cette diversité semble indiquer qu'elles sont utilisées dans des voies distinctes. Ainsi la Drosophile possède cinq protéines Argonaute différentes, l'homme en possède huit et Caenorhabditis vingt sept (pour quoi faire ???).

Chez l'homme, seule Ago2 est efficace pour le clivage des ARNs cibles. Les autres pourraient être spécialisées dans la répression traductionnelle des messagers ou transcriptionnelle de l'hétérochromatine. Chez Arabidopsis AGO1 permet le fonctionnement des miRNAs et le "silencing" post transcriptionnel (PTGS), tandis qu'AGO4 cible la chromatine ("silencing" transcriptionnel) et non les messagers. Inversement, Saccharomyces ne possède, apparemment, aucune protéine Argonaute et ne s'en porte pas plus mal.

Chez S. pombe, comme chez les autres eucaryotes, le "silencing" est déclenché par des ARNs doubles brins relativement longs. Chez S.pombe Ago1 fait partie du complexe RITS (RNA-induced Initiation of Transcriptional Silencing). Ago1 y est associé à des siRNAs correspondant aux séquences centromériques. On admet, actuellement, que RITS entraîne, avec ses siRNAs, une méthylation de la lysine 9 de l'histone H3 de la chromatine centromérique, ce qui entraîne son hétérochromatinisation. Cette modification fait intervenir la nucléase Dicer 1 (codée par Dcr1 et l'ARN polymérase ARN-dépendante (codée par Rdp1). Dcr1 est supposée être découpée à partir de longs ARNs doubles brins copiés sur l'ADN centromérique pour donner des doubles brins plus courts (siRNA).

La question était donc de déterminer si le PTGS existe chez S.pombe en l'absence de "silencing" transcriptionnel (TGS).

On ne sait pas si le "silencing" dans ce cas est transcriptionnel, comme dans le cas de l'ADN centromérique ou post-transcriptionnel comme dans l'interférence ARN des plantes et de animaux. Chez S.pombe, on a des indications contradictoires. Les auteurs montrent que ces trois protéines interviennent bien dans l'interférence ARN, mais ne nécessitent pas les protéines de RISC associées au "silencing". Ces trois protéines doivent donc bien intervenir sur les deux mécanismes mais par des voies différentes.

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13. Quatre nouveaux facteurs de Saccharomyces cerevisiae interviennent dans la surveillance des messagers au cours de leur exportation hors du noyau. Le facteur de surveillance Rrp6 et la protéine de réparation de l'ADN Lrp1, sont des composants nucléaires de l'exosome, interagissant entre eux. Lrp1 assure la dégradation spécifique de mesagers transcrits sur un ADN endommpagé. Lrp1 a besoin de Rrp6 pour trouver dans le génome, les sites endommagés, car Rrp6 se trouve à proximité des sites en cours de transcription.

De plus, Rrp6 et Lrp1 sont tous deux indispensables à la réparation des dommages causés par les UV. H Hyeronimus et al.; Genes & Development 18 (01NOV04) 2652-2662

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14. La télomérase maintient une longueur convenable des télomères en y ajoutant des copies ADN d'une partie de l'ARN modèle associé à la composante protéique TERT de l'enzyme. Si l'enzyme est relativement conservée, les séquences copiées ne le sont pas, dès qu'on sort du voisinage évolutif très étroit d'un organisme. Leur longueur est variable (de 150 nucléotides chez les ciliés étudiés par le groupe d'E Blackburn à 1300 nucléotides chez les champignons, notamment Saccharomyces cerevisiae). Il a, en particulier, été difficile de trouver une "raison" à la très longue séquence ARN observée chez la levure.

Quatre articles récents proposent une structure secondaire de l'ARN télomérasique (AS Chappell et al.; Molecular & Cellular Biology 24 (SEP04) 7720–7736, AT Dandjinou et al.; Current Biology 14 (13JUL04) 1148–1158, J Lin et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (12OCT04) 14713-14718 et DC Zappulla,et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 101 (06JUL04) 10024–10029.

On dispose des séquences génomiques de huit Saccharomyces, et on peut essayer de reconstruire la structure des ARNs télomérasiques et les comparer avec ceux des ciliés et des Vertébrés. Ceci a été réalisé, avec des techniques différentes, par les quatre équipes.

Cette structure comporte plusieurs régions hélicoïdales connues pour reconnaître la protéine télomérasique Est1 et l'hétérodimère Ku70/80. Des appariements sur des distances assez grandes permettent le repli de la molécule. Les paires de base permettant l'appariement interne des séquences peuvent varier, mais pas la structure du cœur de la structure.

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15. On admet qu'il n'y a que deux stratégies de renouvellement des télomères chez la levure et les mammifères, la transcription réverse par la télomérase et, en désespoir de cause, la recombinaison avec des séquences télomériques ou subtélomériques. Les cellules dépourvues de ces mécanismes se divisent bien mais entrent en sénescence. Les extrémités chromosomiques sont une sorte de coupure doubles brins et les réparations de ces coupures peuvent intervenir, mais une fois que leur raccourcissement est suffisant pour leur faire perdre leur propriétés de "capping". Un dernier système de réparation de secours des télomères est un emplâtre basé sur une copie de séquences palindromiques relativement conséquentes qui permettent une prolifération post-sénescence en l'absence d'activité télomérasique. L Maringele et al.; Genes & Development 18 (01NOV04) 2663-2675.

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16. EA Bennett et al.; Genetics 168 (OCT04) 933-951 ont mesuré le niveau de variation génétique entraînée par les innombrables transposons et séquences répétitives apparentées. Ils l'ont fait chez l'homme, mais il n'y pas de raisons que cela ne soit pas la même chose chez d'autres mammifères.

Ils ont identifié 606 093 indels (insertion and deletion) entraînant un polymorphisme chez différents individus. Ils ont ensuite criblé ces polymorphismes pour détecter ceux qui sont créés par des insertions de novo de transposons. Ils ont ainsi détecté 605 insertions non redondantes de ce type chez 36 individus.

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17. ### La famille des caryophérines (également appelée importine ) est constituée de transporteurs solubles assurant le trafic bidirectionnel des protéines et ARNs entre noyau et cytoplasme à travers le pore nucléaire. On a, de plus, démontré leur rôle dans l'assemblage du complexe du pore nucléaire dans la réplication et la mitose, le tout via les composants transportés. .

La direction du flux dépend de la petite GTPase Ran (voir le Bulletin de Juillet 2004 §10). La revue de N Mosammaparast et al.; Trends in Cell Biology 14 (OCT04) 547-556 présente les avancées récentes dans ce domaine et examine les interactions impliquées dans ces fonctions, notamment celles impliquées dans la mitose et l'assemblage de la poche périnucléaire.

En ce qui concerne le transport on sait que les caryophérines sont utilisées, soit dans un sens, soit dans l'autre mais il en existe quelques unes utilisées dans les deux sens (Msn5 de la levure et importine 13 humaine).

Comme ces caryophérines sont finalement peu nombreuses, elles doivent reconnaître de nombreuses cargaisons différentes, et la question se pose de savoir comment elles le font. Les études dans ce domaine se sont concentrées sur l'importine (alias caryophérine 1).

On a décrit la structure de cette caryophérine chargée avec trois cargaisons différentes et constaté que c'est par des
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