La thèse 3ème Cycle en Microbiolgie Marine








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VI- Valorisation des sous-produits de l’AgroIndustrie Oléicole


Apès mon retour du Mexique, j’ai été sollicité d’abord par des collègues du Cirad pour travailler sur la désamérisation biologique des olives de table et quelques mois plus tard, par des collègues marocains pour participer à un projet PRAD (Programme de Recherche en Agronomie pour le Développement). Je me suis donc rendu au Maroc, en mission d’une semaine pour visiter les laboratoires du Professeur Mustapha ISMAILI-ALAOUI, responsable du laboratoire de Biotransformations au Département Sciences des Aliments de l’Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan –2 à Rabat. Après cette mission en 1995, j’ai commencé une longue coopération avec ce jeune partenaire marocain, qui venait d’obtenir son doctorat d’Etat es Sciences Agronomiques et qui avait été laureat de meilleur chercheur marocain de l’année. Donc, il a été très facile obtenir un projet bilatéral et nous avons réalisé un premier projet sur l’enrichissement en protéines des grignons d’olive. Par la suite, nous avons obtenu deux autres projets qui seront décrits en détail :

(Projet PRAD N°02-13)

« Sélection des champignons filamenteux thermophiles isolés au Maroc pour la production d’enzymes thermostables (lipases, phytases, tannases) en FMS sur des sous produits de l’insustrie oléicole»
Ce projet de recherche fait suite au projet PRAD 97-3 sur la valorisation des sous produits agricoles au Maroc. En particulier l'équipe du Prof. ISMAILI-ALAOUI a été formée aux techniques de Fermentation en Milieu Solide (FMS) pour valoriser les grignons d'olive et la bagasse de canne à sucre, en produisant un aliment pour le bétail. Bien que techniquement faisable, cette valorisation bute sur les coûts de production élevés. Par ailleurs, il a été prouvé que la production d'enzymes fongiques thermostables comme les lipases, les phytases et les tannases représentent des produits à haute valeur ajoutée et de ce fait la valorisation des sous produits agricoles parait plus attractive. L'utilisation potentielle de ces enzymes est évidente pour le Maroc: les lipases pourront être utilisées en biocatalyse des huiles essentielles marocaines pour la production de molécules aromatiques naturelles à très haute valeur ajoutée; les tannases pourraient être utilisées en tannerie pour le traitement des effluents liquides et les phytases comme complément à l'alimentation de poulets ou en aquaculture pour la mobilisation du phosphore contenu dans le phytate.

Le Maroc avec des biotopes très particuliers (désert, Atlas, tempéré), constitue un pays potentiellement très riche en biodiversité où la sélection naturelle des espèces s'est faite d'une manière naturelle. C'est dans cette optique que l'IRD en collaboration avec l'IAV-Hassan II a démarré un programme sur la biodiversité des champignons thermophiles isolés des maasra au Maroc. Une collection importante de souches de champignons thermophiles a été constituée ces trois dernières années. Grâce au projet actuel, on vise également la sélection d'un nombre limité de souches thermophiles très performantes pour étudier la production de trois enzymes clefs en biotechnologie: les phytases, les tannases et les lipases qui potentiellement ont des perspectives d'utilisation énormes. En particulier les phytases thermostables seront de plus en plus utilisées comme aide digestives pour dégrader l'acide phytique contenu dans les tourteaux d'oléagineux (tourteaux d'arachide, soja etc). Actuellement, l'utilisation des farines animales est strictement interdite en France et en Europe et de ce fait les tourteau d'oléagineux pour l'alimentation du bétail seront utilisés pour l'apport protéique d'origine végétale.

Isolement des souches thermophiles des maasra

La première partie du travail consiste à isoler de nouvelles souches de champignons filamenteux thermophiles à 50°C, capables de sporuler et de se développer sur différents substrats utilisés comme seule source de carbone (glucose, saccharose, amidon, caséine, carboxyméthylcellulose, tween80, acide phytique, acide tannique) afin de mettre en évidence leurs activités enzymatiques.

Les résultats préliminaires ont permis d’isoler environs 500 souches de champignons filamenteux thermophiles réparties selon les régions étudiées du Maroc et appartenant au moins à 8 espèces différentes : Aspergillus fumigatus, Rhizopus miehei, Thermomyces lanuginosis, Myceliophthora thermophila, Thermoascus aurantiacus, Poecilomyces sp, Malbranchea sulfurea, Humicola grisea.

Les souches des espèces Aspergillus fumigatus, Rhizopus miehei et Poecilomyces sp ont été classées comme étant des champignons thermotolérants , alors que les espèces Thermomyces lanuginosis, Myceliophtora thermophila, Humicola grisea ont été clasées comme étant des champignons thermophiles.

Enfin, les souches des espèces Aspergillus fumigatus, Rhizopus miehei, Myceliophthora thermophila et Humicola grisea ont montré les indices de sporulation les plus élevés. Les meilleures vitesses de croissance apicale ont été obtenues sur les milieux contenant les protéines, les sucres simples, la cellulose, les lipides comme unique source de carbone et d’énergie. Par ailleurs, toutes les souches isolées présentent les activités enzymatiques suivantes: Amylolytique, protéolytique et cellulolytique. Une sélection de souches performantes pour la production d’enzymes (lipases, phytases, tanases) a été réalisée pour la valorisation des grignons d’olive par Fermentation en Milieu Solide. Cependant les souches de Aspergillus fumigatus potentiellement productrices de mycotoxines, ont été écartées de l’étude de criblage.

Sélection des champignons filamenteux thermophiles pour la production des phytases sur grignon d’olive

L’acide phytique est la forme majeure du stockage du phosphore dans les graines des plantes supérieures. Cependant, il constitue un antinutriment lorsqu’il est en concentration élevée dans les tourteaux d’oléagineux. Il peut être hydrolysé par la phytase en produits métabolisables : le myo-inositol et le phosphate inorganique. Mais jusqu'à ce jour, aucune phytase microbienne thermostable n’est disponible pour complémenter la nourriture des animaux monogastriques. Notre étude vise à isoler des souches de champignons filamenteux thermophiles hyperproductrices de phytases thermostables ayant des propriétés spécifiques .

Plus de 125 échantillons prélevés dans différentes régions oléicoles du Maroc ont été utilisés pour l’isolement des souches. Environ 500 souches de champignons filamenteux thermophiles ont été isolées et identifiées provenant de divers biotopes naturels du Maroc (Figure 1). Cinq souches productrices de phytases sur milieu Acide Phytique (MAP) ont été cultivées à 19°C et à 55°C pour évaluer la croissance apicale (CA) et l’Indice de sporulation (Is).



Figure 1 : Répartition des genres des champignons filamenteux thermophiles isolés.
Parmi les 5 souches sélectionnées (M. thermophila, H. lanuginosa, Th. aurentiacus, Rh. oligosporus, P. variotii), on a retenu Myceliophthora thermophila qui se développe bien sur le milieu MAP à 5g/L. Cette souche est thermotolérante (de 19 à 55°C). Elle a une croissance apicale de 0,8 mm/heure et un indice de sporulation élevé (4,15.108 spores/gramme de substrat). De plus les spores germent rapidement (6 heures d’incubation à 45°C). A partir de 500 souches isolées au Maroc, Myceliophthora thermophila a été retenue pour la production des phytases en FMS sur grignons d’olive.

Optimisation des conditions de culture en FMS pour la production de spores des Champignons filamenteux producteurs d’enzymes (lipases et tannases) sur grignons d’olive

La sporulation d’un champignon filamenteux consiste à la formation et la libération de spores, qui sont des formes de résistance et de reproduction. Le but de cette étude est de produire une quantité très importante de spores de Champignons filamenteux (de l’ordre de 1012) qui peuvent servir comme inoculum (starter ou ferment) pour démarrer diverses applications en biotechnologie. Pour la production massive de spores de champignons filamenteux, on utilise la fermentation en milieu solide qui consiste à cultiver le mycélium sur des substrats solides. Pour nos expériences, la bagasse de canne à sucre (80 g) a été utilisée comme support solide et les grignons d’olive (20 g) comme substrat vu qu’ils sont riches en sucres, protéines, lipides et sels minéraux.

L’inoculation du mélange solide a été faite à raison de 2 107 par g de matière sèche à une humidité initiale de 90%. La germination des spores à été évaluée par le calcul de la vitesse de la germination (temps compris entre la mise en contact de la spore avec l’eau et l’émission du tube germinatif). La production de spores à été calculée via l’indice de sporulation qui représente le nombre de spores produites par gramme de matière sèche initialement présente dans le milieu de culture. Les deux souches utilisées (Aspergillus niger et Rhizopus microsporus) ont été sélectionnées pour la production d’enzymes (tannases, lipases, etc.).

Les résultats ont monté que les grignons d’olive constituent un excellent substrat pour la culture de ces deux champignons et permettent d’avoir à 47°C une germination rapide de spores au bout 9 heures et un indice de sporulation de 2,03 108 pour Rh. microsporus Pour A. niger cultivé à 30°C la germination est terminée après 12 heures et l’indice de sporulation a été de 10,4 108 spores. La production de spores en FMS de champignons filamenteux sur GO est très intéressante et prometteuse en particulier pour la préparation de starter à grande échelle, destinés à la production d’enzymes.
Projet PRAD N° 04-15

Biodiversité des moisissures dans les maasras au Maroc: Amélioration des conditions d’hygiène pour une huile d’olive de qualité (Moisizero) ;
L’objectif spécifique du projet Moisizero consistait à faire l’inventaire des moisissures et de leur capacité toxinogène dans les moulins à huile (maasra), moisissures dont la présence est liée à des conditions de stockage et de trituration déficientes.

Les travaux réalisés ont trait à quatre volets importants : (1) Isolement et identification de moisissures mésophiles et thremophiles à partir de différents échantillons prélevés dans les maasra des différentes régions oléicoles du Maroc au cours de trois campagnes oléicoles successives (2003-2004 ; 2004-2005 et 2005-2006). (2) Mise au point des techniques pour la quantification des mycotoxines et des tests d’immuno-affinité pour l’extraction sélective et l’identification des mycotoxines. (3) Organisation du 1er Séminaire international sur les Biotechnologies de l’Olivier et la qualité des produits (Olivebioteq-2004) participation à l’organisation de la deuxième édition Olivebioteq 2006 en partenariat avec l’équipe du Dr Luca Sébastiani à Marsala-Mazara del Vallo, 5-10 November, 2006 (4) formation des étudiants et thésards de l’équipe marocaine.

(1). Isolement et identification des moisissures sur olives. Durant les campagnes oléicoles 2003-2004et 2004-2005, 171 échantillons d’ollives, d’huile d’olive et des grignons d’olive ont été analysés pour la recherche de moisissures et des mycotoxines. 311 souches de moisissures ont été isolées en culture pure dont 193 souches mésophiles appartenant à 10 genres Aspergillus, Penicilium, Geotrichm, Rhizopus, Mucor, Trichoderma, Humicola, Alternaria, Acremonium, Ulocladium et 118 souches thermophiles appartenant à 6 espèces : Aspergillus fumigatus, Paecelomyces varioti, Mucor pusillus, Thermomyces lanuginosis, Humicola grisea, et Thermoascus auriantiacus. Aucune souche de Fusarium n’a pas contre été isoléesur dses échantillons analysés. Les Penicillium et les Aspergillus isolés représentent la majorité des souches (54%).
2. Quantification des mycotoxines. Comme l’essentiel des souches isolées sont des Aspergillus ou des Penicillium, notre étude de toxinogénèse a été orientée essentiellement sur la recherche des Aflatoxines (Af) et de l’Ochratoxine A (OTA), en laissant de côté la recherche des fumonisines et de la zéaralenone. L’ensemble des souches isolées d’ A.flavus (9 souches) et d’ A.niger (34 souches) ont été étudiées pour mettre en évidence leur pouvoir à produire respectivement les mycotoxines et l’ochratoxine A sur des milieux amylacés. Toutes les souches d’ A.flavus se sont avérées productrices d’Aflatoxines B à des quantités allant de 60 à 95 mg/Kg de poids sec de riz. Pour les souches d’ A.niger, 70% ont produit de l’OTAà des quantités allant de traces jusqu'à 360 mg/Kg de poids sec de blé. Une étude préliminaire réalisée sur des olives noires à la façon grecque salées et contaminées artificiellement avec des spores d’ A.flavus et de Geotrichum sp., a montré que les souches d’ A.flavus et de Geotrichum sp., n’étaient pas capables de se développer sur ces substrats en présence de sel à 25%. De ce fait, il n’y a pas eu production de mycotoxines sur des olives salées et contaminées artificiellement. Les analyses de 35 échantillons d’huile d’olive provenant de la Maasra mobileont montré qu’aucun échantillon ne contenait pas des aflatoxines ou de l’Ochratoxine A.

3. Olivebioteq-2004, le premier séminaire international de Biotechnologie et Qualité des produits de l’olivier, a eu lieu à Errachidia du 22-24 novembre 2004 et a regroupé 200 experts des principaux pays oléicoles du pourtour méditerranéen. Ce séminaire a été initié grâce aux financements des projets PRAD et l’aide logistique de l’IAV-Hassan II et de l’IRD. Une convention de collaboration a été signée entre l’IOOC (International Olive Olil Council) et les deux organisateurs (IAV-Hassan II et l’IRD). La deuxième édition a eu lieu à Marsala-Mazara del Vallo, Palerme, 5-10 Novembre 2006 et nous avons donné deux conférences.

Pour la deuxième et troisième année du projet PRAD, nous avons étudié la Biodiversité des moisissures dans les maasras au Maroc ainsi que le pouvoir toxinogène des souches d’Aspergillus cultivées sur céréales. Durant la compagne oléicole 2004/2005, 107 échantillons d’olives, de grignons d’olives et d’huile d’olive ont été prélevés directement des maàsras localisées dans plusieurs régions du Maroc. L’échantillonnage des moisissures au niveau des maasras a été effectué en tenant compte de l’aspect typologique des maasras (Traction animale, traction diesel ou électrique.etc.) et de la localisation géographique. L’analyse mycologique des échantillons d’olives et de grignons d’olives nous a permis d’isoler au total 189 souches dont 109 souches mésophiles et 80 souches thermophiles et thermotolérantes. L’identification des souches mésophiles a montré une dominance des genres Penicillium (32 %), Aspergillus (26 %) et Geotrichum (26 %). L’identification des souches thermophiles ou thermotolérantes a montré que la majorité des souches appartiennent aux espèces : Thermoascus aurantiacus (30 %), A. fumigatus (25 %), Paecilomyces variotii (22 %) et Mucor pusillus (15%). L’ensemble des souches isolées d’A. flavus (3 souches) et d’A. niger ( 20 souches) ont été étudiés pour mettre en évidence leur pouvoir à produire respectivement les aflatoxines et de l’ochratoxine A sur milieux amylacés. Toutes les souches d’A. flavus se sont avérées productrices d’aflatoxine B1 à des quantités allant de 60 à 95 µg/kg de poids sec de riz. Pour les souches d’A. niger 70 % ont produit de l’ochratoxine A à des quantités allant de traces à 360 µg/kg de poids sec de blé.

La capacité des souches toxinogènes à produire des mycotoxines sur des olives a été testée en réalisant une contamination artificielle des olives noires préparées « Façon Grèce » avec un taux de sel de 25 %. La contamination a été faite par A. flavus, A. niger et avec Geotrichum sp. Le but de la contamination par Geotrichum sp était d’étudier l’effet de l’antagonisme. Au bout de 6 mois de stockage des échantillons à l’air ambiant et à 25°C, l’effet antifongique du sel à une concentration de 25% s’est avéré efficace jusqu’à la fin du 4ème mois de stockage à l’air libre. Pour les échantillons stockés à une température de 25°C, le salage à 25% a été efficace pendant les 6 mois de stockage. La recherche des mycotoxines dans les olives salées et contaminées artificiellement a montré l’absence de toute trace d’ochratoxine A et d’aflatoxines.

Enfin, 21 échantillons d’huile d’olive ont été soumis à la recherche des deux types de mycotoxines. Aucun échantillon ne s’est révélé contaminé par l’une ou l’autre des mycotoxines.
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