La thèse 3ème Cycle en Microbiolgie Marine








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II. Ecologie et Taxonomie de Bactéries des Sols Tropicaux


1.- La microflore de la rhizosphère du riz

La distribution des bactéries hétérotrophes aérobies, des actinomycètes et des champignons filamenteux a été estimée dans trois échantillons représentatifs du sol rhizosphérique (SR), du rhizoplan, et de l’endorhizosphère (ER) obtenus à partir d’un pied de riz cultivé pendant 4 mois sur un sol gris de Casamance. Les densités de microorganismes observées étaient importantes et du même ordre de grandeur pour les trois échantillons. Par contre, nous avons démontré que la structure et par conséquent les potentialités métaboliques des populations bactériennes changeaient en fonction des échantillons.

2.- Les bactéries dénitrifiantes des sols de rizières

La taxonomie numérique basée sur l’étude des caractères morphologiques, physiologiques, biochimiques et nutritionnels a été utilisée pour étudier les bactéries sporulées thermophiles et les bactéries dénitrifiantes isolées sur benzoate dans les sols de rizières. Nous avons démontré que les Bacillus thermophiles dénitrifiants se rattachent au groupe Bacillus kaustophilus. De même, nous avons observé, pour une souche, une résistance extrême à des températures élevées. Elle est capable de se développer à 80°C !

3.- Les bactéries fixatrices d’azote libre

Vingt souches fixatrices libres d’azote, isolées de l’endorhizosphère du riz, dans des sols de rizières de Sénégal, ont été étudiées sur la base de 259 caractères morphologiques, physiologiques, biochimiques et nutritionnels. Ce travail taxonomique nous a permis de mettre en évidence la faculté de fixer l’azote chez des espèces du genre Pseudomonas, Alcaligenes, et Aeromonas qui ne présentaient pas d’espèces fixatrices jusqu’à ce jour.

III – Fermentation en milieu solide des substrats lignocellulosiques


La Fermentation en Milieu Solide (FMS) est un procédé microbien où la culture des microorganismes se développe non seulement en surface mais aussi à l’intérieur d’une matrice poreuse solide en absence d’écoulement libre de liquides. La matrice poreuse peut être constituée d’un substrat humide ou d’un support inerte capable d’absorber les nutriments qui se trouvent dissous en solution. La biomasse végétale est essentiellement constituée de matières lignocellulosiques, insolubles dans l’eau qui constituent un substrat de prédilection pour la culture et le développement des champignons filamenteux, lignocellullolytiques. Lorsque j’ai été recruté à l’ORSTOM en 1979, j’ai eu comme thème de recherche : l’hydrolyse de la cellulose par des moisissures : production de cellulases par FMS. En fait, je continue à travailler directement ou indirectement sur cette thématique depuis 30 ans déjà. Mon travail consiste à valoriser les bioressources, en utilisant la richesse et les particularités de la biodiversité fongique.

Objectifs

La cellulose, constituant majeur des végétaux, représente la principale ressource de carbone organique continuellement renouvelable grâce au mécanisme de la photosynthèse. Sa décomposition en sucres simples, permettrait de résoudre de nombreux problèmes tels que la pollution de l’environnement (par la bioconversion des déchets urbains et agroindustriels) ainsi que des problèmes énergétiques (par la production d’énergie: alcools, méthane).

Certains sous-produits agricoles (cossettes de betterave, bagasse de canne à sucre, paille de blé, déchets d’ananas, pulpe de café, grignons d’olive) peuvent être utilisés pour l’alimentation du bétail, la fertilisation des sols et la production d’énergie par combustion. Toutefois, leur valorisation pourrait être améliorée par de nouveaux procédés permettant une exploitation plus approfondie de l’énergie potentielle que représente cette biomasse. Ceux-ci nécessitent la disponibilité des sucres simples obtenus par hydrolyse chimique ou enzymatique de la cellulose. Les cellulases, enzymes capables de réaliser cette hydrolyse, peuvent être obtenues par la croissance de microorganismes sélectionnés, sur les substrats lignocellulosiques eux-mêmes. L’intérêt d’une telle orientation est d’autant plus importante que les applications des cellulases sont très variées. Outre leur utilisation dans l’industrie agroalimentaire et pharmaceutique, la voie la plus prometteuse, dans le contexte économique actuel, semble être la production de carburants. Les résidus cellulosiques hydrolysés par les cellulases, fournissent un mélange de sucres qui par fermentation, conduisent à des produits tels que l’acétone, le butanol, l’éthanol ou le méthane. Actuellement, les travaux de recherche visent le développement industriel des cellulases de champignons filamenteux cultivés en FMS ou en milieu liquide, car dans les années 80 cette technique n’avait pas encore franchi le stade pilote et présente entre autres inconvénients, une limitation des contacts substrat/microorganismes et une forte viscosité des milieux de culture.

Dans le cadre des recherches sur l’enrichissement en protéines des substrats amylacés, Raimbault et Alazard, deux chercherus de l’ORSTOM, ont mis au point une technique originale de culture de champignons filamenteux en milieu solide. Ce type de fermentations appliquées aux substances cellulosiques, donne des résultats prometteurs pour la production de cellulases ainsi que des protéines pour l’alimentation du bétail. En effet de très nombreux champignons filamenteux (Trichoderma) produisent des cellulases en grande quantité, au cours de leur croissance. Par ailleurs, la quantité des d’éléments nutritifs indispensables pour leur développement est très faible, d’autre part leur équipement enzymatique varié les prédispose particulièrement à ce type de culture en milieu solide.

La thèse d’Etat

J’ai obtenu ma thèse d’Etat es Sciences à l’Université de Provence le 18 décembre 1985 sur le sujet suivant : « Croissance de Trichoderma harzianum par fermentation en milieu solide : Physiologie, sporulation et production de cellulases ». Le travail de recherche a été réalisé successivement au Laboratoire de Microbiologie ORSTOM à l’IRCHA, au Laboratoire de Biotechnologie et de Microbiologie Appliquée de l’ORSTOM à Fort de France ainsi qu’au Département de Biotechnologie de la UAM-Iztapalapa au Mexique. C’est à cette occasion que j’ai pu apprécier l’importance de la formation permanente dans l’évolution d’une carrière professionnelle. Une série d’études et des stages de formation m’ont permis d’amener à bon terme ce travail professionnel qui a aboutit à la soutenance d’une thèse.

Une étude préliminaire m’a permis de sélectionner , parmi des souches de champignons filamenteux cellulolytiques de notre collection, une souche de Trichoderma harzianum. Cette souche présente des caractéristiques intéressantes dans l’optique de produire des cellulases par FMS. En effet elle produit des quantités importantes de cellulases, elle possède une croissance apicale élevée (1,2 mm/h), ce qui lui permet d’envahir des surfaces solides du substrat et elle produit en surface des quantités élevées des conidiospores . En plus, T.harzianum est un antagoniste puissant vis-à-vis d’un certain nombre de champignons phytopathogènes. Egalement on a découvert que cette souche produit une série de peptides nouveaux, présents dans les conidiospores. Le pouvoir antibiotique de peptides a été également démontré. Il était donc intéressant de disposer de données précises sur la physiologie de croissance et de sporulation de ce microorganisme prometteur.

L’étude physiologique de croissance de T.harzianum a montré qu’il s’agit d’un microorganisme prototrophe aérobie stricte doté d’une grande flexibilité d’adaptation. Il est capable de se développer dans des conditions extrêmes ( pH : 2-8 ; Température de 10 à 35°C ; Salinité de 0 à 80 g de NaCl/l). Aussi, l’utilisation d’un milieu synthétique a permis de démontrer qu’il est prototrophe capable d’assimiler correctement le nitrate, l’urée, les sels d’ammonium, et un peu moins le nitrite. De la même manière, il assimile comme unique source de carbone et d’énergie les sucres suivants : D-glucose, D-fructose, lactose, D-ribose, xylose, cellobiose, galactose, saccharose, amidon, cellulose et mannitol.

L’étude physiologique de la sporulation, en relation avec la production quantitative de conidiospores de T.harzianum, a permis de définir les conditions d’environnement et d’optimiser la composition du milieu de culture pour la production massive de conidiospores.

Un nouveau procédé de production de spores de champignons filamenteux a été mis au point non seulement pour T.harzianum, mais aussi pour d’autres microorganismes comme Penicillium notatum, P.camemberti et Aspergillus niger. Ce procédé présente l’avantage de cultiver les champignons filamenteux en surface, sur un milieu solidifié, dans un fermenteur à disques. Le fonctionnement de ce fermenteur a été fondamentalement modifiée afin d’obtenir une grande surface aérienne à la sporulation tout en maintenant des conditions d’aération et d’asepsie strictes. Dans le fermenteur à disques, la production optimale de conidiospores de T.harzianum a été obtenue après 7 jours d’incubation à 29°C avec une production de 7,3x10^11 conidiospores par fermenteur. L’Indice de sporulation (Is) a été particulièrement élevé (Is=3,5x10^11 conidiospores produites par gramme de substrat).

La technique de FMS est basée sur le pré- conditionnement du substrat cellulosique (broyage, traitements chimiques, humidification avec une solution nutritive, inoculation avec une suspension homogène de conidiospores du champignon filamenteux, utilisation de réacteurs particuliers et définition des conditions de culture). On a étudié l’effet de la température, de l’humidité, du pH, de l’aération, et de la taille de l’inoculum sur la croissance de T.harzianum de manière à optimiser les principaux paramètres dans des conditions de culture non stériles.

Les observations microscopiques sur des échantillons de culture solides ont démontré le développement sélectif du mycélium de T.harzianum. Aussi, l’utilisation de divers substrats cellulosiques (paille et son de blé, cossettes de betterave, bagasse de canne à sucre) a permis de généraliser cette méthode de culture (FMS) à un ensemble de sous produits lignocellulosiques. Les cinétiques comparées de biosynthèse de cellulases en milieu solide et en milieu liquide n’ont pas montré de différences significatives au niveau des rendements de production pour ces enzymes. Ces résultats encourageants nous autorisent à considérer la production de cellulases de T.harzianum cultivé en milieu solide comme une alternative intéressante.

Les applications possibles de ces résultats ainsi que les connaissances acquises tout au long de cette étude, nous ont permis de définir un nouveau procédé de FMS sur support pour la valorisation des substrats ligno-cellulosiques. Ce procédé consiste à cinq étapes :

  1. Prétraitement du substrat (broyage et traitement thermique)

  2. Inoculation avec une suspension concentrée de conidiospores

  3. Fermentation aérobie avec une aération contrôlée à travers la masse du substrat

  4. Extraction des exoenzymes et des métabolites solubles par simple pressage du produit fermenté et obtention de deux fractions (Fraction soluble –FS ; Fraction insoluble – FI),

  5. Conditionnement des deux fractions (par évaporation de la FS on obtient les enzymes et les métabolites sous forme sèche ; par ensilage de la FI on stabilise ce sous produit qui est destiné en alimentation animale, probiotique).

Les résultats obtenus au laboratoire ont été confirmés par les études faites au niveau pilote expérimental, en utilisant un nouveau fermenteur statique appelé Zymotis. Ce dernier a été mis au point à l’IRCHA et breveté par les deux organismes (Publi-brevets).

Des sous produits agricoles tropicaux (bagasse de canne à sucre, déchets d’ananas, pulpe de café) peuvent être utilisés comme substrat pour la croissance de champignons filamenteux par FMS de la bagasse en utilisant T.harzianum on obtient une production moyenne de 20.000 UI d’activités Carboxyméthyl cellulases et 2.000 UI d’activités papier filtre pour 100 grammes de substrat poids sec. A la fin de la fermentation l’ensemble du produit fermenté est pressé et on récupère ainsi 80% de la fraction soluble contenant les enzymes et les métabolites dans une solution concentrée. D’autres applications de ce procédé de FMS sur support cellulosique, ont été réalisées par la suite, en vue de produire des pectinases, des amylases, des antibiotiques, des phytohormones et d’autres métabolites fongiques. Un brevet d’invention ORSTOM-UAM-I a été déposé à l’ANVAR. Par ailleurs trois certificats d’invention ont été déposés par la SECOFI au Mexique en copropriété avec l’ORSTOM.
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