Action d’une protéine sur une molécule unique d’adn








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Action d’une protéine sur une molécule unique d’ADN
V. CROQUETTE, G. CHARVIN, J-F. ALLEMAND, G. LIA, T. LIONNET,

O. SALEH, H. YOKOTA, N. DEKKER, M-N. DESSINGES et D. BENSIMON

Laboratoire de Physique Statistique de l'École Normale Supérieure, Paris et

Département de Biologie de l'École Normale Supérieure, Paris

mél : Vincent.Croquette@lps.ens.fr

Nous décrivons des expériences faites sur une molécule d’ADN qui nous permettent de mieux comprendre le fonctionnement des enzymes agissant sur ce biopolymère au sein de nos cellules. Le principe de ces expériences est d'attacher une molécule d’ADN par une extrémité à une microbille magnétique tandis que l'autre est fixée à une lamelle de verre. En utilisant de simples aimants nous pouvons tirer et tordre cette molécule. A l’aide d’un microscope optique nous mesurons la position de la bille en temps réel. Nous déterminons ainsi la force de traction exercée sur cette molécule et son extension. Les variations de celle-ci reflètent l’action des enzymes qui changent la forme ou la topologie de l'ADN. En utilisant de faibles concentrations d’enzyme nous sommes sensibles à l’action d’une seule enzyme et même, dans certains cas, nous observons les cycles enzymatiques un à un. Nous nous intéressons aux enzymes impliquées dans la réplication de l'ADN et nous suivons l’action d’une polymérase recopiant le message génétique. Nous montrons aussi comment la topoisomérase II enlève deux par deux les torsades qui peuvent se former lors du processus de réplication tandis que la topoisomérase I opère tour par tour.
I - Introduction
Depuis quelques années, plusieurs équipes se sont lancées dans des expériences de micromanipulation de molécules uniques, destinées à élargir le champ d’investigation en biologie moléculaire. Pour mieux comprendre le fonctionnement de nos muscles, il fallait pouvoir observer l’activité d’une seule protéine et montrer qu’en changeant de conformation dynamiquement celle-ci provoquait un mouvement : en utilisant des «pinces optiques» plusieurs groupes ont mesuré la force et le déplacement élémentaire d’une protéine musculaire [1,2]. De même, quelle ne fut pas notre surprise de découvrir l’existence d’un moteur moléculaire rotatif de 10 nanomètres de diamètre, tournant à un rythme effréné (8000tr/min) au sein de nos cellules, comportant un stator et un rotor en forme d'arbre à cames auquel les chercheurs japonais ont réussi à accrocher un marqueur visible au microscope optique [3]. Grâce à un microscope à force atomique (AFM), une équipe allemande a pu mesurer la cinétique de dénaturation d’une protéine soumise à une force de traction [4], et la force de rupture du couple récepteur-ligand biotine/streptavidine est maintenant connue [5,6]. En utilisant la très grande souplesse d’une micro-pipette en verre, des chercheurs français ont déterminé l’énergie d’appariement des bases de l’ADN [7]. Ces magnifiques expériences illustrent une nouvelle approche des problèmes biologiques dans laquelle les physiciens et les chimistes ont mis leur savoir-faire pour mieux répondre aux questions de la biologie moléculaire.
Nous présentons ici une technique de micromanipulation des molécules d'ADN qui nous permet d'observer l'activité des enzymes agissant sur cette molécule. Cet article est en fait le complément d’un article précédent réalisé en 2000 [8] auquel le lecteur a accès libre; nous avons choisi de faire un rappel succinct de notre dispositif expérimental permettant de comprendre les mesures faites sur les enzymes sur lesquels nous nous attarderons un peu plus. Nous suggérons au lecteur désireux de connaître les détails qui ne sont pas présentés ici de consulter la référence [8].


Figure 1: Principe de la micromanipulation d’une molécule d’ADN.

Les molécules d’ADN sont introduites dans un capillaire disposé sur un microscope inversé. Des aimants réglables en hauteur et pouvant tourner sur eux-mêmes permettent d’appliquer une contrainte de traction et de torsion sur la molécule par l’intermédiaire d’une microbille magnétique. Une caméra CCD reliée à un ordinateur enregistre les déplacements de la bille (agrandissement). L’ADN est fixé à la bille recouverte de streptavidine par son extrémité biotinilée et à la surface recouverte d’antidigoxigénine par son autre extrémité traitée a la digoxigénine. (Photo issue de Biofutur [9])
La molécule d’ADN est un polymère extraordinaire à plus d’un titre. C’est bien évidemment le support de notre information génétique et pour mieux protéger celle-ci, deux copies complémentaires sont conservées chacune sous la forme d'un polymère : l’ADN simple-brin. Les bases qui constituent l’alphabet de ce code sont accrochées latéralement le long d’un polymère et s’hybrident par des liaisons hydrogène aux bases du second brin. On représente souvent l’ADN double-brin comme une échelle dont les montants sont constitués des squelettes phosphodiesters et les échelons sont des paires de bases complémentaires (AT), (GC). C’est la fameuse double hélice de Watson et Crick, encore appelée ADN-B [10].
La structure de la molécule est liée à la très forte interaction qui existe entre les bases : celles-ci sont hydrophobes et comme elles sont plates, elles préfèrent s’empiler les unes sur les autres comme des assiettes afin de minimiser leur surface de contact avec l’eau. L’épaisseur d'une base est de 3,4 Å, la distance qui sépare deux points d’attache successifs sur le squelette phosphodiester est d’environ de 7 Å. Dans la double hélice, les squelettes phosphodiesters sont donc fortement inclinés, les 7 Å se projettent ainsi en 3,4 Å au prix d’une rotation d’environ 36° entre paires de bases successives.
Pour réaliser des expériences d’élasticité sur une molécule d’ADN, nous attachons une extrémité de la molécule sur une surface de verre tandis que l’autre est accrochée à une microbille. Nous réalisons ainsi un Jokari moléculaire. L’utilisation d’une bille magnétique permet d’exercer une force sur la molécule grâce à des aimants placés au-dessus qui produisent un gradient de champ magnétique. La figure 1 donne le schéma de principe de l’expérience. Les échelles des différents composants ne sont pas respectées ; en effet, le diamètre de la bille est de l’ordre de m tandis que les aimants font quelques millimètres.
Afin d’accrocher chacune des extrémités de la molécule à un substrat différent, nous utilisons le processus biochimique de type clef-serrure. La biotine (plus connue sous le nom de vitamine H) est une petite molécule (une clef) qui peut se loger dans une poche (serrure) d’une protéine nommée streptavidine. Lorsque cette clef est placée dans cette serrure, elle y est maintenue par un très grand nombre de liaisons hydrogène dont l’association produit une liaison presque aussi solide qu’une liaison covalente.

Nous utilisons le code génétique pour greffer à une extrémité des molécules de biotine et de la digoxygénine à la seconde extrémité. L’accrochage de chaque extrémité se fait en plusieurs points, ce qui le rend plus solide mais surtout interdit toute rotation autour des points d’attache, nous permettant ainsi de tordre la molécule. Pour préparer un échantillon, nous absorbons de l’antidigoxigénine sur les parois d’un capillaire, nous y injectons alors une solution de molécules d’ADN attachées à des billes magnétiques et nous laissons incuber. Le Jokari moléculaire se fabrique spontanément. Nous avons choisi des concentrations d’ADN et de billes telles qu’en moyenne il y ait une molécule d’ADN par bille ; cependant, nous n’avons aucun moyen d’empêcher que plusieurs molécules s’accrochent à la même bille. Nous devons donc vérifier a posteriori qu'une seule molécule est attachée à la bille étudiée. Pour cela, nous mesurons la force qu’il faut développer pour l'écarter de la surface du capillaire, celle-ci est minimum quand une seule molécule est impliquée dans la liaison. Nous allons maintenant décrire la méthode de mesure de force que nous utilisons.
II - Mesurer la force d’étirement d’une molécule d’ADN
Rappelons d’abord l’ordre de grandeur des forces mises en jeu à l’échelle d’une molécule. L'énergie typique des phénomènes biologiques est donnée par l’agitation thermique, kBT = 4,21 10-21J, tandis que la distance d'action est le nanomètre. Le rapport de ces deux quantités est une force de quelques picoNewtons, c'est typiquement cette force qu’il faut développer pour étirer une molécule d’ADN. Cette valeur est extrêmement petite et il n’est pas facile de la détecter avec les dispositifs de mesure classiques. Nous avons mis au point une technique de mesure de force qui s’inspire de la méthode proposée par Einstein [11] pour déterminer la raideur d’un ressort.
En effet, lorsque nous appliquons une force sur la bille magnétique grâce à un gradient de champ, la molécule étirée et la bille forment un minuscule pendule. Celui-ci est animé d’un mouvement brownien, qui résulte de l’agitation des molécules d’eau qui l’entourent. On peut modéliser ce phénomène par une force aléatoire qui écarte le pendule de sa position d’équilibre vers laquelle il est ramené par la force de traction exercée sur l’ADN. La raideur de ce pendule k, s’écrit simplement k = F/l (où F est la force de traction et l l’extension de la molécule). L’équipartition de l’énergie nous permet d’écrire que (1/2)kx2 = (1/2)kBT, où x est l’écart de la bille par rapport à sa position l’équilibre dans une direction perpendiculaire à la force (Fig. 2). En explicitant l’expression de la raideur, nous pouvons écrire que F = kBTl/x2. Pour mesurer la force de traction sur la molécule d’ADN, il suffit de déterminer l’allongement l de la molécule et x2, les fluctuations quadratiques moyennes. La détermination de x2 se fait en suivant les déplacements de la bille par un programme informatique qui analyse en temps réel son image vidéo avec une précision de 10nm. La détermination de l'extension de la molécule requiert la mesure de sa position dans la direction de propagation de la lumière. Nous y parvenons en observant la forme des anneaux de diffraction qui décorent l'image de la bille en éclairage parallèle.

III – Mesure d’élasticité d’une molécule d’ADN


Nous enregistrons la courbe d’élasticité d'une molécule en analysant ses fluctuations et son extension pour différentes distances séparant les aimants de la bille (Fig. 3). La force varie ainsi depuis quelques dizaines de femtoNewtons jusqu’à quelques picoNewtons, l’extension de la molécule évolue sur une large gamme qui nous permet de comparer la courbe expérimentale au modèle théorique du ver (worm-like chain en anglais) [12-14].




Figure 2: Enregistrement du mouvement brownien d’une bille de 2,8 m de diamètre pour différentes forces appliquées. En un point, l’intensité de gris est proportionnelle au logarithme de la probabilité de visite de la bille. En rapprochant les aimants de la bille on augmente la force de traction sur la bille ; plus celle-ci est grande, plus la molécule s’allonge, et plus le mouvement brownien est restreint.

Cette comparaison nous permet de garantir que nous étirons une molécule unique. Cette courbe dépend très fortement de la structure moléculaire de l'ADN : ainsi si nous accrochons la bille à son substrat par une molécule d'ADN simple-brin, la courbe force/extension est complètement différente. Nous utiliserons cette propriété pour étudier la polymérase.


Figure 3 : Courbe de force obtenue grâce aux fluctuations browniennes (avec les barres d’erreur). En trait plein, courbe théorique du modèle du ver ajustant au mieux les points expérimentaux.
IV - L’élasticité d’une molécule d’ADN soumise à une torsion
Le champ magnétique de nos aimants est perpendiculaire à la direction d’extension de la molécule d’ADN. En faisant tourner les aimants, nous imprimons une rotation à la direction du champ, en gardant constante la force appliquée. La bille magnétique suit le champ, comme le ferait une boussole. Comme la molécule d’ADN est attachée à ses extrémités en plusieurs points, la rotation de la bille contrôle la torsion de la molécule d’ADN. Évidemment, cette contrainte de torsion n'existe que si la molécule est fixée en plusieurs points à la surface mais surtout qu’elle ne présente aucun nick, c’est-à-dire aucune coupure simple-brin. Ce type de défaut permet de relaxer toute contrainte de torsion puisque la molécule peut tourner librement autour du brin intact. Dans notre expérience, ces nicks sont assez fréquents et il n’y a que peu de molécules qui présentent une chaîne sans coupure sensible à la contrainte de torsion.

Figure 4: Courbes de l’extension relative en fonction du degré de sur-enroulement à force constante. Elles ont été baptisées «courbes en chapeau» du fait de leur forme à basse force.
La contrainte de torsion est un paramètre biologique important. Pour le caractériser, on compare le nombre de tours n ajoutés ou enlevés à la molécule au nombre de tours Lk0 que présente celle-ci en l’absence de contrainte, à savoir un tour toutes les 10,5 paires de bases. Le rapport de ces deux nombres  = n/Lk0 permet de comparer des molécules de tailles différentes.
L’effet de la torsion sur une molécule d’ADN a été étudié avec soin par White [15]. Il se comprend facilement si nous le transposons au cas d'un tube de caoutchouc. Si nous tordons ce tube régulièrement en maintenant une force de traction constante, celui-ci oppose un couple proportionnel à l’angle de torsion. Si maintenant nous relâchons la force de traction en maintenant l’angle de torsion constant, une instabilité ne tarde pas à apparaître sous forme de «tortillons», bien connus sur les fils des combinés téléphoniques. Lors de leur formation, le couple de torsion diminue de façon notable. Les tortillons absorbent une part importante de la contrainte. En fait, cette instabilité est le résultat d’une compétition entre deux mécanismes dont les contributions énergétiques sont la torsion pure et la courbure. Pour les faibles contraintes, le tube reste droit afin de minimiser son énergie de courbure. Aux fortes contraintes, l'énergie de torsion est trop grande et il devient rentable de courber la molécule afin de former des boucles qui réduise la torsion. A l’échelle de la molécule d’ADN, les mécanismes sont presque équivalents, il faut seulement ajouter des fluctuations thermiques importantes qui adoucissent l’apparition de l’instabilité d’entortillements (encore appelés plectonèmes). Ces tortillons produisent un raccourcissement de la molécule. Ainsi, si nous appliquons une faible force sur une molécule d’ADN et si nous portons son allongement en fonction du nombre de tours n qui lui est appliqué, nous observons une courbe en cloche. L’extension est maximale pour une contrainte nulle, elle diminue lorsque n augmente et ce, quel que soit son signe. Ce comportement correspond à la courbe symétrique de la figure 4, qui est en excellent accord avec les prédictions théoriques [16-18].
Lorsque nous répétons cette mesure avec une force de traction plus importante (de 1pN) nous observons un comportement dissymétrique en fonction de . Pour  > 0, la molécule se raccourcit comme précédemment. En revanche, pour  < 0, cette longueur ne semble plus dépendre de . Cette dissymétrie relative au signe du degré de torsion est prévisible puisque la molécule d’ADN est chirale. La transition que nous décrivons correspond à l’apparition d’une «bulle de dénaturation». En sous-enroulant la double hélice, nous provoquons l’apparition d’une petite région où les liaisons hydrogène qui maintiennent les bases complémentaires des deux brins cèdent sous la contrainte (voir fig. 4) [19-22]. Le même phénomène est observé sur une corde à deux torons que l'on déroule.
IV - La réplication de l’ADN nécessite des opérations mécaniques
Dans leur article relatant la découverte de la double hélice, Crick et Watson ont proposé au détour d'une phrase anodine que cette structure permettait facilement de recopier le message génétique : il suffit simplement de séparer les deux brins et de les recopier en se servant de chacun comme modèle pour associer les bases complémentaires. Ce mécanisme, séduisant dans son principe, nécessite cependant la coopération de plusieurs enzymes dont la découverte ne tarda pas. Il faut d'abord ouvrir une bulle de dénaturation en brisant les liaisons hydrogène entre les bases. Cette opération, qui consomme de l'énergie, est assurée par les hélicases (qui cassent la double hélice). Les ADN simple-brin qui apparaissent ainsi sont pris en charge par des ADN polymérases qui recopient la molécule d’ADN transformant le simple-brin en une molécule double-brin en associant à chacune des bases de la molécule simple-brin les bases complémentaires. Ces enzymes sont évidemment fonda-mentales. Elles sont toutes les deux des moteurs moléculaires qui se déplacent à la jonction séparant une molécule double-brin d'une simple-brin, l'hélicase convertissant le double-brin en simple-brin et la polymérase faisant l'inverse. Finalement, la séparation des deux brins provoque le déroulement le l'ADN qui s'entortille fortement. Pour démêler cet écheveau, la cellule utilise les enzymes de la famille des topoisomérases qui sont capables de changer la topologie de l'ADN que nous discuterons également.

Aussi importante que puisse être le fonctionnement de ces enzymes, personne ne sait actuellement précisément comment ces moteurs moléculaires agissent sur l'ADN. Leurs propriétés dynamiques sont évaluées à l'aide d'expériences en tube à essai qui ne donnent accès qu'à des moyennes d'ensemble. Les expériences faites sur des molécules uniques tentent d'apporter des réponses plus pertinentes à ces questions. Expérimentalement, nous utilisons le jokari moléculaire pour mieux comprendre ces enzymes.


VI - Réplication d’une molécule d’ADN par une ADN polymérase
Dans le cas des polymérases nous plaçons cette fois une molécule d’ADN simple-brin entre la bille et la plaque de verre. La polymérase reste cependant inactive sur une molécule purement simple-brin. Elle a besoin d'un point d’amorçage de la réaction constitué par une jonction entre le simple-brin et le double-brin. Pour obtenir cette jonction, nous ajoutons à la solution un petit morceau d’ADN simple-brin complémentaire en un seul endroit de la molécule reliant la bille au substrat. En s’hybridant ce morceau d’ADN forme la petite région d’ADN double-brin qui va servir de point de démarrage pour la polymérase. Il suffit alors d’ajouter dans le milieu la polymérase et les bases de l’ADN pour que la synthèse puisse démarrer.
Dans cette expérience, la longueur de la molécule va nous permettre de suivre l’avancement de la réaction : ceci est possible parce que l’ADN simple-brin possède une courbe allongement/force très différente de celle de l’ADN double-brin. En effet, à basse force l’ADN simple-brin à tendance à réaliser des appariements fortuits entres bases conduisant à une molécule courte. Par contre à haute force, l’ADN simple-brin peut s’allonger beaucoup plus que l’ADN double-brin qui s’enroule en double hélice. À haute force la molécule simple-brin est donc plus longue que la molécule double-brin tandis que le comportement est inversé à basse force. Comme on peut le constater sur la figure 5, les deux courbes de force sont en quelque sorte «perpendiculaires» se croisant à une force de 5 pN. Dès lors que nous appliquons une force constante sur une molécule différente de ces 5 pN, la longueur de la molécule va dépendre de la proportion d’ADN simple-brin et double-brin. À basse force une molécule se transformant de simple-brin à double-brin sous l’action d’une polymérase s’allonge tandis qu’elle se raccourcit à haute force. La mesure de la longueur de la molécule en temps réel nous permet ainsi de suivre la progression de l’ADN-polymérase. Par construction il n'existe que deux jonctions simple-brin – double-brin sur notre molécule et une seule possède la polarité requise pour le fonctionnement de la polymérase ; nous sommes ainsi sensibles à l'activité d'une seule enzyme à la fois.

Nous observons que la synthèse du second brin se fait par à-coups avec de longues pauses. La vitesse de polymérisation dépend de la séquence répliquée et également de la polymérase employée. Par ailleurs, en exerçant une force de traction sur l’ADN simple-brin, dans un premier temps nous aidons la polymérase probablement en linéarisant l’ADN simple-brin, puis lorsque la force de traction devient plus importante nous ralentissons la progression de l’enzyme pour finalement l’arrêter à une force traction d’environ 20,pN (Fig. 6) [23]. Des expériences analogues ont été réalisées par le groupe de C. Bustamante [24].

Figure 5: Courbes de forces d’ADN simple-brin (ADNsb), d’ADN double-brin (ADNdb) et d’une molécule partiellement répliquée (hybride ADNsb et ADNdb) . Dans ce dernier cas, la courbe force extension correspond à la combinaison linéaire des courbes de force de l’ADN simple-brin et double-brin. Imagettes en haut, comparaison d’un segment de 18 bases [AT]9 en simple-brin et double-brin. Le simple-brin est complètement étendu, sa longueur est 2,1 fois plus grande que la molécule double-brin. (Image R. Lavery IBPC)
L'hélicase fait en quelque sorte le travail inverse de la polymérase : pour détecter son activité nous utilisons une molécule double-brin possédant une seule coupure simple-brin : un nick. L'hélicase trouve ainsi un point d'entrée dans la double hélice, elle peut séparer les deux brins à partir de cette brèche. Comme pour la polymérase, l'hélicase opère avec une polarité bien définie ce qui ne permet qu'à une seule enzyme de travailler à la fois. Cependant l'hélicase ne fait que séparer les deux brins de la double hélice, a priori rien n'empêche ceux-ci de reformer la molécule double-brin après le passage de l'enzyme [25]. Pour éviter cette situation, nous appliquons une force de traction importante (F > 30 pN), ce qui conduit l'ADN simple-brin à présenter un allongement notable par rapport à sa forme double-brin. Dans ces conditions, l'hybridation des deux parties simple-brin est rendue impossible tant que l'hélicase est présente à la jonction. Par ailleurs, au fur et à mesure que l'hélicase progresse, l'extension de la molécule augmente, permettant ainsi une mesure en temps réel de l'activité enzymatique. L'hélicase finit par se détacher de la molécule, permettant alors au deux brins de reformer la double hélice comme on ferme une fermeture Éclair. Cette étape très rapide correspond à un raccourcissement de la molécule qui retrouve sa longueur originale. L'observation des bouffées d'activités en temps réel est riche d'information biologique : la montée régulière de la bille permet d'accéder à la vitesse de l'hélicase, leur durée définit le temps d'activité typique et l'amplitude de ces bouffées nous donne la processivité de cette enzyme. Nous obtenons des vitesses d'enzyme nettement supérieures à ce qui est mesuré dans les expériences faites en tube à essai. Ceci n'est guère étonnant car ces mesures font la moyenne entre les phases d'activité et de réhybridation qu'elles ne peuvent distinguer.
VIII - Les topoisomérases enlèvent les nœuds d’une molécule d’ADN
Dans la cellule, la molécule d’ADN d’un chromosome mesure une dizaine de centimètres de long tandis qu’elle est empaquetée dans le noyau qui fait au plus dix microns de diamètre. Pour dupliquer cette molécule, un ensemble d’enzymes en attrape les deux brins et les écarte afin d’ouvrir des bulles d’ADN dénaturé, chaque brin étant alors recopié. Si vous essayez de faire une opération équivalente sur une longue corde possédant deux torons, vous obtenez rapidement un paquet de nœuds inextricables. Au sein de nos cellules, le même phénomène se produit transitoirement, mais les enchevêtrements et les nœuds sont rapidement démêlés par d’étonnantes enzymes appartenant à la famille des topoisomérases qui, comme leur nom l’indique, peuvent modifier la topologie de la molécule d’ADN. Cette famille est divisée en deux groupes, les topos de type I qui sont capables de couper temporairement un seul des brins de l’ADN et celles de type II qui coupent les deux brins.
En ouvrant une brèche dans la double hélice, les topos de type I permettent à la molécule de tourner autour du brin intact et relâchent ainsi la contrainte de torsion existant sur une molécule, elles n’ont pas besoin d’énergie (ATP) pour faire cette opération. En revanche, les topoisomérases de type II se fixent au point de jonction de deux molécules d’ADN, coupent les deux brins de l’une d’elles et passent la molécule intacte à travers cette coupure tout en tenant les deux extrémités qu’elles recollent parfaitement après le passage de la molécule. Cette opération peu banale permet d’enlever les nœuds et de déconcaténer des molécules enchevêtrées. Elle nécessite la présence d’un cofacteur énergétique : l’ATP. La topoisomérase II est très importante au cours du cycle cellulaire [26], ses inhibiteurs sont fréquemment utilisés comme agents anticancéreux puisqu’ils conduisent à l’impossibilité de démêler les chromosomes filles lors de la réplication entraînant le suicide de la cellule. Ces inhibiteurs provoquent ainsi la mort des cellules qui se reproduisent beaucoup.


Figure 6: a) à 3 pN la polymérase progresse régulièrement. En étirant l’ADNss à 24 pN on arrête complètement la réplication. b) à 16 pN la polymérase progresse plus lentement mais plus régulièrement qu’à 1 pN.
Les mécanismes moléculaires mis en jeu lors du cycle catalytique des topoisomérases sont loin d’être complètement compris. Les expériences permettant de les caractériser sont délicates. En effet il est difficile de changer la torsion d’une molécule dans un tube à essai. En tordant une molécule d’ADN grâce à une bille magnétique manipulée par des aimants, nous avons la possibilité de réaliser très rapidement et de façon contrôlée des torsades comme celle des cordons téléphoniques. Leur apparition s’observe par le raccourcissement de la molécule. C’est précisément sur ces molécules qu’agissent ces enzymes. En les ajoutant dans la solution aqueuse où baigne la molécule d’ADN torsadée, nous pouvons observer leur action. Les deux types d’enzymes vont relâcher la contrainte de torsion provoquant un allongement sensible de la molécule. Cependant, les modes d’action des deux types d’enzymes sont différents ce qui se met facilement en évidence avec les pinces magnétiques.
Pour des raisons qui vont apparaître par la suite, les topos II s’avèrent plus simples à présenter. Nous commencerons donc par elles. Nous ne détectons leur activité que pour des molécules dont l’extension est réduite par la rotation des aimants. Par contre, elles n’agissent pas tant que le nombre de tours est inférieur au seuil d’apparition des tortillons sur l’ADN. Ceci signifie que la topo II agit sur les entortillements de l’ADN et pas directement sur la torsion de la molécule. La topo II est active aussi bien sur des molécules sur-enroulées que sous-enroulées. Sa vitesse d’action V augmente linéairement avec la concentration d’ATP jusqu’à une certaine concentration au-delà de laquelle cette vitesse ne change plus. Cette dynamique est dite Michaelis-Menten d’ordre 1, typique d’une réaction enzymatique. L’action de l’enzyme conduit à un relâchement des torsades que nous observons par l’allongement de la molécule. Chaque fois que l’enzyme réalise un passage de brins, elle enlève en fait deux tours de torsion à la molécule. À très faible concentration d’enzyme et d’ATP, nous avons réussi à observer un à un le passage de brins d’une seule topoisomérase II sur une molécule d’ADN. Dans ces conditions, l’allongement de la molécule se fait par pas discrets de 90 nm (voir fig. 7) correspondant au relâchement de deux supertours (ou torsades) [27].
Notre dispositif offre des possibilités d’investigations nouvelles : nous avons mis en évidence la diminution de vitesse de relaxation des supertours avec la force de traction. C’est une indication sur l’étape limitante du cycle enzymatique : elle correspond probablement au recollage des deux morceaux d’ADN coupés qui doit se faire lorsqu’une fluctuation d’origine thermique les rapproche suffisamment.
En omettant d’ajouter de l’ATP dans le milieu expérimental, nous contrarions le fonctionnement de la topoisomérase II. En fait, le cycle catalytique commence, l’enzyme s’accroche à un croisement d’ADN mais elle est alors incapable de continuer et se détache après quelque temps. Cette association entre l’enzyme et l’ADN est observable avec notre méthode de mesure. Si la torsion de la molécule est ajustée juste au seuil d’apparition de la première torsade, nous observons une succession d’associations et de dissociations enzyme/ADN, conduisant à des sauts de longueur de la molécule de 45 nm. Nous pouvons ainsi mesurer les temps d’association de la topoisomérase avec son substrat.
Nous nous sommes intéressés à la topo Ia qui est l’enzyme de type I que l’on trouve dans le monde bactérien. L’ADN des bactéries présente un léger sous-enroulement établi par les gyrases, qui font aussi partie de la famille des topoisomérases. Le contrôle de ce sous-enroulement qui résulte de l'équilibre entre les gyrases et les topos Ia, permet à la bactérie de séparer plus facilement les deux brins de l’ADN. Comme les eucaryotes que nous sommes ne possèdent pas de gyrases, ses inhibiteurs neutralisent les bactéries et constituent des antibiotiques. La topo Ia des bactéries ne relâche la torsion que lorsque le sous-enroulement devient trop fort et provoque l’apparition de bulles de dénaturation dans l’ADN.

Figure 7: Relaxation de la longueur d’une molécule d’ADN torsadée. a) lorsque l’ATP est à basse concentration on observe une relaxation par pas de 90 nm correspondant à chaque cycle catalytique d’une seule enzyme qui enlève deux tours. b) avec une concentration normale d’ATP, la relaxation se fait par bouffées rapides (Trelax), séparées par de longues phases d'attente (TA), ce qui montre que nous avons bien l'action d'une seule enzyme à la fois. Pour observer à nouveau l'activité de l'enzyme il nous suffit de faire tourner les aimants (Trot.) ce qui raccourcit l'extension de la molécule.
La caractérisation de la topo Ia est de ce fait un peu moins facile que celle de la topo II. D’abord cette enzyme n’a pas besoin d’ATP, nous ne pouvons donc pas l'en priver pour ralentir son activité. D’autre part, elle agit dès que des bulles de dénaturation apparaissent. Or nous avons vu que celles-ci empêchent la formation des tortillons détectables par le raccourcissement de la molécule. Lorsque nous déroulons une molécule d’ADN à basse force, après quelques tours son extension décroît fortement lors de la formation des tortillons. Si nous ajoutons la topo Ia, rien ne se passe dans ces conditions. Si nous augmentons la force de traction, nous étirons les tortillons, l’extension de la molécule augmente et des bulles de dénaturation se forment. Dans ces conditions la topo Ia peut travailler, mais l’extension de la molécule reste maximale puisqu’il n’y a plus de tortillons. Pour observer le relâchement effectué par l’enzyme, il suffit de ramener la force appliquée à sa valeur initiale avant étirement. Lorsque l’enzyme a agi le nombre de tortillons a baissé et l’extension de la molécule a augmenté par rapport à sa valeur initiale. Ces observations confirment que la topo Ia agit bien sur les bulles de dénaturation et qu’elle est inactive sur l’ADN sur-enroulé. Pour pouvoir observer directement l’activité de l’enzyme en temps réel, nous avons dû préparer une molécule d’ADN spéciale qui contient juste en un seul endroit une bulle de dénaturation artificielle : nous avons inséré deux simples brins qui ne sont pas complémentaires sur 12 bases, cette bulle est donc toujours ouverte. Elle le reste lorsque nous sur-enroulons la molécule sur laquelle se forme alors des tortillons qui provoquent la diminution de l’extension de la molécule. Nous obtenons ainsi une molécule où la topo Ia peut agir sur une seule petite bulle et qui forme des tortillons qui nous permettent de suivre le degré de torsion de l’ADN. La petite taille de la bulle garantit par ailleurs qu’une seule enzyme peut travailler à la fois. En tirant sur la molécule, nous refermons la bulle et nous gênons l’entrée d’une topo Ia. C’est en utilisant cette molécule et en ajustant la traction que nous avons pu ralentir l’activité de la topo Ia et observer le relâchement des super-tours un à un. Cette observation permet de confirmer que le mécanisme moléculaire impliqué par la topo Ia contrôle le passage des brins et ne correspond pas à une libre rotation de la molécule autour d’un brin [28].
La famille des topoisomérases est riche et il reste encore beaucoup à faire : comment la gyrase déroule-t-elle la double hélice ? Comment la topoisomérase IV reconnaît-elle le sur-enroulement du sous-enroulement ? Ce sont là des questions qui méritent des expériences précises.
VIII - Conclusions
Nous venons de montrer que de simples aimants placés au-dessus d’un microscope permettent de manipuler des molécules uniques d’ADN, pourvu qu’elles soient attachées à une microbille magnétique et à un substrat. L'observation de l'image de cette bille fournit le moyen de suivre son mouvement brownien et de déterminer la force de traction exercée tandis qu'il est possible de mesurer l'extension de la molécule sans qu’aucun contact mécanique ne soit nécessaire. Nous avons pu étudier le comportement élastique d’une molécule d’ADN soumise à une contrainte de torsion qui provoque la formation de structures torsadées réduisant l'extension de la molécule. Lorsque nous déroulons la double hélice, nous observons l'apparition de bulles de dénaturation dans lesquelles les deux brins d’ADN sont séparés.
En utilisant ces propriétés élastiques, nous pouvons détecter l'action des enzymes ADN polymérases et hélicases qui se déplacent le long de la molécule. Par ailleurs, nous observons l'action enzymatique d’une seule topoisomérase dont nous détectons les cycles individuels. Ces expériences illustrent à quel point les protéines sont des objets dynamiques dont les changements de forme sont impliqués dans leur mode de fonctionnement.
Remerciements
Nous remercions l'ARC, le CNRS, l'ENS, les universités de Paris VI et de Paris VII et la communauté européenne (par son contrat MolSwitch IST-2001-38036) pour leur support financier.

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