Mise en place de la technique d'arn interférence chez le lépidoptère

Mise en place de la technique d'ARN interférence chez le lépidoptère Spodoptera frugiperda. Molly Brunner ; Encadrant : Bernard Duvic Laboratoire EMIP Ecologie Microbienne des Insectes et Interaction Hôte-Pathogène, Université Montpellier II, UMR 1133 INRA-UMII, 34095 Montpellier Cedex 5, France Résumé L'immunité des insectes, à la différence de celle des mammifères, est uniquement basée sur des réponses innées. Les trois principaux mécanismes de défense décrits en réponse à une infection bactérienne sont : (i) la mélanisation et la coagulation, activées par des cascades protéolytiques, (ii) la phagocytose et l'encapsulement (mécanisme cellulaire spécifique aux invertébrés), et enfin (iii) la synthèse de novo de peptides antimicrobiens. Une technique d'interférence ARN a été développée chez la noctuelle, Spodoptera frugiperda, afin d'étudier le rôle de certains gènes impliqués dans la cascade protéolytique d’activation des phénoloxydases conduisant à la mélanisation. Après clonage des séquences spécifiques des gènes d'intérêt dans le plasmide L4440 (vecteur contenant deux promoteurs T7 opposés) des ARNs double brins ont été produits in vivo après transformation d'Escherichia coli. Une fois purifiés, les ARNs obtenus ont été injectés à des larves de Spodoptera frugiperda. Différentes études ont alors été réalisées afin d'estimer l'efficacité de la technique. Les premiers résultats obtenus montrent que la survie des larves de Spodoptera frugiperda à une injection de bactéries non-pathogènes (i.e. : E. coli) semble compromise lorsque certains gènes d’intérêt sont inhibés. D’autre part, une analyse par immuno-Western blot indique que la traduction du gène d’intérêt est réduite dans les échantillons traités avec les ARNs db. Cependant, nos essais de PCR semi-quantitatives n’ayant pas été concluants, les résultats précédents n’ont pas pu être corrélés avec une réduction de la transcription des gènes ciblés. Mots clef : RNA interférence, Spodoptera frugiperda, Cascade protéolytique de la phénoloxydase, Immunité Introduction Dans de nombreux pays du pourtour méditerranéen, les cultures (riz, maïs, coton…) sont fréquemment ravagées par les larves de papillons, tels Spodoptera frugiperda (S. f.) [1]. Les traitements actuels contre ces ravageurs sont principalement basés sur l'utilisation d'insecticides chimiques souvent très polluants, ou d'insecticides biologiques comme des toxines bactériennes (toxine de Bacillus thuringiensis, toxine Bt). Les insectes devenant rapidement résistants à ces moyens de protection, la recherche agronomique se tourne donc aujourd'hui vers l'étude de pathogènes naturels de ces insectes ravageurs comme les complexes némato-bactériens du type Steinernema carpocapsae/Xenorhabdus nematophilus, ceci afin de mieux comprendre les interactions hôte/pathogène qui les unissent et de développer, à plus long terme, de nouveaux "insecticides biologiques" plus respectueux de l’environnement. Cette étude s'intéresse à plusieurs protéines de l'immunité de S. f. impliquées dans les phénomènes de reconnaissance de l'agent infectieux (bactérie), ou l'activation de réponses immunitaires telles la mélanisation ou la phagocytose. Les trois familles de protéines étudiées sont impliquées dans une même cascade de signalisation dite système de la phénol-oxydase (Figure 1). Les protéines de reconnaissance des peptidoglycanes (PGRP) en sont les senseurs. Elles activent les protéases d’activation de la prophénoloxydase (PPAE) qui clivent ensuite la prophénoloxydase (proPO) inactive en phénoloxydase (PO) active. Cette dernière est impliquée dans la voie de biosynthèse de la mélanine, et permet d’aboutir au phénomène de mélanisation et à l'inhibition du développement de l'infection bactérienne [2]. Afin de définir l'importance du rôle de ces protéines dans la réponse immunitaire de S. f., une technique d'ARN interférence (ARNi) a été développée. Pour ce faire, à l’aide d’une banque de données appelée « SpodoBase » [3] construite à partir d’EST (Expressed Sequence Tag) de S. f., de longs fragments de séquences codant nos molécules d’intérêt (PGRP, GNBP pour Gram negative binding protein, PPAE et proPO) ont été clonés dans le vecteur L4440 (voir "Matériel et Méthodes"). La production des ARNs double brins (ARNs db) a été réalisée dans la bactérie E.coli souche HT115. Une fois produits, ces ARNs db ont été injectés à des larves de S. f. La quantité d'ARN et de protéines d'intérêt chez les insectes traités a été suivie par RT-PCR semi-quantitative et Western blot. Enfin, une étude de la survie des insectes a été réalisée après traitement par des ARNs anti-PPAE puis injection de E. coli, une bactérie non pathogène pour S. f. Matériel et méthodes Matériel Plasmides pTriplEx (Clontech, TAKARA BIO Company) - plasmide contenant : (i) un gène de résistance à l'ampicilline permettant la sélection du plasmide dans E. coli, (ii) un promoteur et un opérateur lacZ permettant, après induction à l'IPTG et en présence -galactose, la sélection des colonies contenant l'insert à l’aide du test blanc/bleu dans des bactéries exprimant le répresseur lacIq. L4440 (ADDGENE) - vecteur contenant deux promoteurs T7 convergents et en sens opposés séparés par un site multiple de clonage, permettant la production d'ARN double brin après induction par de l’IPTG. Souches bactériennes XL1-Blue MRF´ (STRATAGENE) : Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac {F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)}d. HT115 : W3110, rnc14::ΔTn10 [4, 5]. Tn10 confère une résistance à la tétracycline. Les souches ont été modifiées afin d'exprimer une RNA polymérase T7 sous promoteur inductible à l'IPTG [6]. Insectes L'insecte modèle de cette étude est une noctuelle, le lépidoptère Spodoptera frugiperda (S. f.). Des chenilles de début du dernier stade larvaire (L5) précédent l'empupement, c’est à dire le passage à l'état de chrysalide, ont été utilisées. Méthodes Amplification des inserts, clonage dans le plasmide L4440 et transformation des bactéries XL1blue MRF' (exemples : PGRP et GNBP) Les ESTs des gènes d'intérêt PGRP et GNBP, issus de la SpodoBase, ont été amplifiés par maxiprep après culture bactérienne d’E.coli XL1blue transformées par électroporation [7a]. Les ADN plasmidiques ont été purifiés sur colonne AX100 (Nucleobond) selon le protocole du fournisseur. La présence des séquences d’intérêt a été vérifiée par PCR à l’aide d’amorces dessinées sur le vecteur pTripLex (amorce 5’ sens : CGGGAAGCGCGCCATTGTGTT ; amorce 3’ antisens : CGAATTGCGGCCGCATGCATA) et bordant le polylinker de clonage. Les fragments d’ADN pour la production d’ARN double brin anti-GNBP ont été préparés par digestion enzymatique Kpn I. Dans le cas de PGRP, une PCR avec des amorces spécialement dessinées et contenant des motifs de restriction Xba I et Pst I (amorce 5’ sens : gggggggTCTAGAATGAAGTTATTT ; amorce 3’ antisens : ccCTGCAGGTTCTTCAGT GA) a été nécessaire [7b] afin d’introduire des sites de restriction enzymatique absent dans la séquence ADN de PGRP. Après purification des fragments sur colonne QIAquick (QIAGEN, PCR Purification Kit Protocol), les restrictions enzymatiques Xba I/Pst I ou Kpn I ont été effectuées sur les ADNs PGRP ou GNBP, respectivement. Parallèlement, le vecteur L4440 a été digéré par les mêmes enzymes [7c]. Les constructions L4440/PGRP et L4440/GNBP ont été obtenues par ligation à la T4 DNA ligase [7d]. L'amplification de ces constructions a été effectuée par transformation de bactéries XL1blue (vérifiée par PCR) puis miniprep et purification. Production des ARN db Des bactéries HT115 ont été transformées par électroporation avec les constructions préparées ci-dessus. Après culture en milieu 2xYT (200 ml contenant de l’ampicilline à 100 µg/ml et de la tétracycline à 12,5 µg/ml), la production des ARNs a été induite par de l'IPTG (0,4 mM). Les ARNs ont ensuite été purifiés par la technique du TriZol, puis quantifiés au spectrophotomètre et enfin analysés sur gel d'agarose 1,5%, TAE 0,5x. Parallèlement, les ARNs purifiés ont été incubés 15 minutes en présence de RNAse A (20 µg pour 0,1 µg d’ARN). Un aliquot des échantillons est ensuite séparé sur gel d’agarose 1,5% afin de vérifier l’efficacité du traitement. Test de stabilité des ARNs double brins Pour tester la stabilité des ARNs, ceux-ci ont été aliquotés puis ont subit une succession de cycles « décongélation, agitation, recongélation à -80°C » allant de 1 à 10. Les échantillons ont ensuite été séparés sur gel d'agarose 1,5% afin d'analyser leur niveau de dégradation. RT-PCR semi-quantitative Après injection des ARN db, les larves de S. f. ont été congelées à -80°C puis broyées dans du TriZol afin d’extraire les ARNs totaux. Ces derniers ont ensuite été traités à la DNAse I afin d'éliminer d’éventuels ADN co-purifiés. Les ADNc ont été produits par reverse transcription à l’aide de Superscript II (Invitrogen). Enfin, une PCR à l’aide d’amorces spécifiques pour les différents gènes a été réalisée et les produits PCR obtenus ont été analysés sur gel d’agarose. Electrophorèse SDS-PAGE et immuno-Western L'hémolymphe des larves de S. f. a été prélevée 6 h ou 24 h après injection des ARN db. Les hémocytes ont été séparés du plasma par centrifugation, et les concentrations en protéines des échantillons ont été déterminées par la méthode de Bradford [7e]. Les échantillons ont été soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide et en présence de SDS [7f], puis les protéines ont été transférées sur membrane de PVDF (Amersham, Pharmacia Biotech). Après transfert, la membrane a été colorée au bleu de Coomassie [7g] puis une immunodétection avec des anticorps de lapin anti-prophénoloxydase (dilués au 1/5000ème) suivie d’une incubation avec des anticorps de mouton anti-IgG de lapin marqués à la péroxidase (dilués au 1/1000ème) a été réalisée. Un kit ECL Western blotting analysis system (Amersham, Pharmacia Biotech) a été utilisé pour révéler la présence des anticorps secondaires [7h, 7i]. Test de survie Les ARNs db (100 ng dans 20 µl) ont été injectés à des larves de S. f. au stade L5. Les ARNs des deux PPAE ont été co-injectés afin d'éviter un phénomène de sauvetage dû à la redondance des molécules. Six heures après l'injection, des bactéries E. coli ont été injectées (10 000 bactéries/larves). Différents témoins ont été nécessaires : PBS, ARNi seuls ou PBS puis injection avec E.coli. Les insectes ont été suivis pendant 1 mois. Résultats Production des ARNs db La production d’ARNs db a été réalisée selon le protocole développé par Timmons et al. (2001)[8] et utilisé chez Caenorhabditis elegans. L’une des étapes clé est le clonage des ADNc d’intérêt dans le vecteur L4440. La préparation du vecteur et des fragments d’ADN a fait appel à des techniques classiques de biologie moléculaire (maxipreps, PCRs avec amorces spécifiques, digestions enzymatiques simple, Kpn I ou double, Xba I/Pst I et enfin, purification sur gel de « low melting » agarose) et n’a posé aucun problème. Des préparations d’ADN de bonne qualité et en quantités importantes (jusqu’à plusieurs µg) ont ainsi pu être obtenues. L’étape de ligation des inserts d’intérêt dans le vecteur d’expression a, par contre, nécessité quelques mises au point. En effet, sur un grand nombre de manipulations, les bactéries transformées semblaient ne contenir que le vecteur vide. Plusieurs hypothèses ont été avancées : vecteur mal digéré, re-ligué sur lui-même, mauvais rapport insert/vecteur. La ligation a donc été réitérée après déphosphorylation du vecteur évitant ainsi que ce dernier se referme sur lui-même. Aucune amélioration des résultats n’a été constatée. D’autre part, une analyse sur gel a permis d’éliminer une mauvaise digestion du vecteur. En effet, la linéarisation et la perte des structures super-enroulées du vecteur sont facilement visualisables sur gel. Enfin, le rapport insert/vecteur dans le milieu réactionnel de la ligation a été modifié. Une quantité d’insert multipliée par trois, soit un rapport insert/vecteur de 9 pour 1, a alors permis d'obtenir des clones bactériens contenant les constructions. Le tableau 1 ci-dessous résume les résultats obtenus pour les différents ARNs db produits : Echantillons A260 nm A280 nm A260/A280 Conc (µg/µl) ARN db PO1 0,309 0,216 1,43 3,09 ARN db PO2 0,330 0,228 1,45 3,30 ARN db PPAE1 0,303 0,209 1,45 3,03 ARN db PPAE3 0,298 0,207 1,44 2,98 ARN db PGRP 0,409 0,254 1,61 4,09 Tableau 1 : Détermination de la concentration en ARN des préparations obtenues par production dans E. coli souche HT115 après induction à l’IPTG et purification par la méthode au TriZol. Les différents culots d’ARN obtenus ont été repris dans un volume final de 1 ml d’H2O. PO : Prophenoloxidase, PPAE : Prophenoloxidase activating enzyme, PGRP : Peptidoglycan binding protein Les ARNs db purifiés sont issus d’une production in vivo dans E. coli. La méthode de purification au TriZol ne permettant pas de discriminer entre les différents ARNs (simples ou doubles brins, un traitement à la RNase A bovine pancréatique a donc été nécessaire pour nettoyer nos échantillons des ARNs bactériens. La Figure 2 présente les résultats obtenus. Figure 2 : Effet d’un traitement à la RNase bovine pancréatique sur les ARNs db. (A) 100 ng ou (B) 1 µg d’ARNs db (1 & 2 : PO1; 3 & 4 : PO2; 5 & 6 : PPAE1; 7 & 8 : PPAE3) ont été incubés à 37°C pendant 15 min en absence (1, 3, 5 et 7) ou en présence (2, 4, 6 et 8) de 20 µg de RNase bovine pancréatique. Les échantillons ont été déposés sur un gel d’agarose à 1,5 % dans du TAE 0,5 x puis soumis à électrophorèse. Le gel a été coloré au bromure d’éthydium. M : Eurogenetec SmartLadders small fragments. Nous constatons que, dans ces conditions expérimentales, le traitement de 0,1 µg d’ARN totaux à la RNase permet d’obtenir un échantillon presque totalement dépourvu d’autres ARNs. Toutefois, lorsque la quantité d’ARN à traiter est 10 fois supérieure, l'efficacité de ce traitement paraît significativement réduite. La stabilité des ARNs db a été analysée par un test de congélation/décongélation. La Figure 3 montre qu’il n’existe aucune dégradation visible des échantillons ayant subit ce traitement jusqu’à dix fois (piste 5). Figure 3 : Effet de la congélation/décongélation sur la stabilité d’ARNs double brin. M : Eurogenetec SmartLadders small fragments. 100 ng d’ARNs db ont subi de 1 à 10 cycles de congélation/décongelation/vortex/ recongélation puis les échantillons ont été analysés par électrophorèse sur gel d’agarose à 1,5 % en TAE 0,5 x. (1) 0 cycle ARN contrôle, (2) 1 cycle, (3) 2 cycles, (4) 5 cycles et (5) 10 cycles. Effet de l’inhibition par ARNi des gènes de prophénoloxydases (PO) et des gènes d’enzymes d’activation des prophénoloxydases (PPAE) sur l’immunité de Spodoptera frugiperda Des larves de S. frugiperda, préparées dans différentes conditions expérimentales, ont été soumises à une injection de bactéries non-pathogènes (E. coli) et la mortalité des insectes a été suivie pendant 1 mois. Les résultats ont été les suivants : Traitement PBS ARNi PPAE PBS + E. coli ARNi PPAE + E. coli Nb de morts 0 1 1 3 La sensibilité à E. coli du lot traité par ARNi semble légèrement supérieure à celle des autres lots. Toutefois, ce résultat est à considérer avec prudence car aucun test statistique n'a pu être réalisé en raison du faible nombre d'insectes dans les différents lots (n=5). Enfin, aucune augmentation significative du taux de mortalité n’est observée entre les trois autres lots expérimentaux (PBS, ARNi PPAE, et PBS+E.coli). L’effet des ARNi PO ou PPAE sur la présence de PO dans les deux compartiments hémolymphatiques (plasma et hémocytes) de S. frugiperda a été analysé par western blot à l’aide d’anticorps de lapin dirigés contre la PO de l’orthoptère, Locusta migratoria. Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 4 ci-dessous. Figure 4 : Effet des ARNi PO ou PPAE sur la présence de phénoloxydase hémolymphatique. (a) coloration au bleu de Coomassie, (b) marquage immunologique à l’aide d’anticorps polyclonaux de lapin anti-phénoloxydase de Locusta migratoria. Pl : plasma, Hé : Hémocytes. Différentes observations peuvent être faites : Les charges en protéine des différents échantillons ne sont pas identiques (Figure 4a). Ce paramètre devra être pris en considération afin de pouvoir comparer des quantités de PO révélées par le marquage immunologique. Les anticorps reconnaissent les POs des deux insectes : le lépidoptère, S. frugiperda et l’orthoptère, L. migratoria (Figure 4b). Une injection de PBS ne provoque pas de diminution significative du taux de PO ni dans le plasma, ni dans les hémocytes par rapport au témoin n’ayant subit aucun traitement (T = 0 h). Un traitement ARNi PO semble induire une diminution de la PO dans le plasma entre 6 h et 24 h. En effet, la coloration au bleu de coomassie est plus intense pour le plasma ARNi PO 24 h alors qu’au contraire, la révélation immunologique est plus marquée pour l’échantillon 6 h correspondant. Pour ce qui est des hémocytes, une disparition est observable entre 0 h et 6 h puis la protéine réapparaît à 24 h. Concernant les ARNi PPAE 6 h, une diminution du taux de PO dans les hémocytes apparaît alors que le taux de cette dernière dans le plasma semble inchangé. Lors d’une expérience préliminaire, nous avons cherché à analyser, par PCR semi-quantitative avec des amorces spécifiques des différents gènes, l’effet des injections des ARNs db PO ou PPAE sur les taux d’ARNm des POs et des PPAEs. Aucun résultat exploitable n’a pu être obtenu. En effet, aucune amplification n’a été observée y compris chez les insectes témoins traités au PBS. Une PCR de contrôle avec ces différentes amorces sur les EST utilisés pour préparer nos constructions a permis d’éliminer la possibilité d’une mauvaise qualité des amorces, l’amplification de fragments, présentant les tailles attendues, ayant été obtenue. Discussion Le travail réalisé au cours de ce stage avait pour objectif la mise au point de la technique d’ARN interférence chez un insecte, le lépidoptère Spodoptera frugiperda, afin d’inhiber spécifiquement certains gènes connus de l’immunité des insectes, et pour en évaluer le rôle dans le contexte de recherche du laboratoire qui est l’étude des interactions entre le complexe nématobactérien, Steinernema carpocapsae/Xenorhabdus nematophila et l’insecte. Cet outil a déjà été largement utilisé sur d’autres modèles biologiques, cultures cellulaires ou organismes entiers (plantes ou animaux). Récemment, un protocole de production in vivo d’ARNs double brin a été publié par Timmons et al. (2001). Ce travail a inspiré notre étude et les résultats obtenus appellent les commentaires suivants : La production d’ARN db, étape cruciale de la technique, nécessite encore des améliorations. Le clonage des inserts GNBP et PGRP dans le vecteur d’expression L4440 s'est avéré relativement compliqué. La taille de l'insert et la variabilité du rendement des clonages en général sont probablement, en partie, responsables des difficultés rencontrées. La technique a donc nécessité des adaptations par rapport au protocole initial (déphosphorylation du vecteur à la phosphatase alcaline, modification du rapport insert/vecteur). D’autre part, les préparations d'ARNs obtenues étaient fortement contaminées par des ARNs bactériens co-purifiés. Pour remédier à cela, les échantillons ont été traités à la RNase A normalement spécifique des ARN sb. Bien qu’efficace pour des quantités d'ARN faibles, ce traitement, dans nos conditions expérimentales, n’a pas permis de traiter, en une seule fois, les quantités importantes d'ARN nécessaires à l’étude biologique envisagée. Aussi, afin d'obtenir des échantillons d'ARN db de meilleure qualité, une nouvelle approche utilisant une T7 RNA polymérase commerciale pourrait permettre la production in vitro d'ARNs, éliminant ainsi toute contamination par des ARNs bactériens. Dans une étude récente [9], réalisée sur un autre lépidoptère, Manduca sexta, les auteurs ont analysé, par ARNi, le rôle d’autres molécules immunitaires soit réceptrices (hémoline, immulectine-2 ou PGRP) soit effectrices (cécropine, attacine, moricine, lébocine ou lysozyme) lors d’une infection bactérienne. Ils ont ainsi pu montrer que cet insecte devenait plus sensible à E. coli, bactérie non pathogène, après extinction des gènes de l’immulectine ou de ceux des peptides antimicrobiens cécropine, attacines ou moricine. Nos résultats semblent indiquer qu’une autre molécule, la prophénoloxidase (proPO), pourrait être impliquée dans la résistance de notre insecte, Spodoptera frugiperda, à une infection par E. coli. L’injection d’ARN db dirigés contre le gène codant la proPO induit un taux de cet enzyme, dans les hémocytes, plus faible à 6 h comparé à un insecte contrôle (0 h). Cette diminution ne survient dans le plasma qu’entre 6 h et 24 h. Cette observation pourrait s’expliquer par le fait que la proPO est synthétisée dans les hémocytes puis relarguée dans le plasma. La technique d’ARNi, ciblant la synthèse protéique, il n’est pas surprenant que les protéines disparaissent en premier lieu au niveau de leur site de synthèse, en l’occurrence les hémocytes. Un autre de nos résultats indique que la sensibilité de Spodoptera ne semble pas affectée par l’injection seule d’ARNi PPAE. En effet, la présence d’un seul insecte mort dans le lot ayant subit ce traitement (idem pour le lot traité PBS+E. coli) pourrait être dû à l’effet piqûre. Par contre, le nombre d’insectes morts dans le lot ayant reçu les ARNi puis E. coli est plus important que pour les autres lots. Il semble donc que la réduction du taux de protéine PPAE soit à l’origine d’une augmentation de la sensibilité de Spodoptera à E. coli. Si ce résultat se confirme lors des prochaines expériences menées au laboratoire, nous seront à même de montrer (en combinaison avec une analyse par Western blot de la conversion de la proPO en PO) que la PPAE présente dans la SpodoBase est effectivement une des protéases d’activation de la prophénoloxydase. L’objectif fixé au début de ce stage a été en partie atteint. Le protocole pour la production d’ARN db, sous réserve de quelques modifications, est valide. D’autre part, bien que toutes les conditions expérimentales ne soient pas encore optimisées, la technique d’ARNi semble utilisable pour l’étude générale des gènes immunitaires chez Spodoptera frugiperda. Enfin, ce verrou technologique levé, des études comparatives de la réponse immunitaire de notre insecte face à des infestations par des microorganismes pathogènes comme Xenorhabdus nematophila ou non-pathogènes comparables à celles développées chez Manduca sexta [10] pourrons être développées. Conclusion Cette technique d'ARN interférence présente déjà des résultats encourageants. Cependant, elle nécessitera encore quelques améliorations avant d’être pleinement utilisable. Par exemple, une étude cinétique plus précise de la disparition des d'ARNs sera nécessaire pour déterminer le moment le plus adéquate pour injecter les bactéries. De même, le traitement d'un plus grand nombre d'insectes devrait permettre de confirmer et d’affiner les résultats préliminaires obtenus. Enfin, les molécules étudiées étant présentes de façon constitutives dans l’hémolymphe de l’insecte, leur épuisement préalable par injection de billes de latex devrait permettre une observation plus aisée de la disparition de leurs ARNm respectifs. L'étude de mécanismes telle la phagocytose, mécanisme dans lequel ces molécules (PO, PPAE ..) semblent impliquées, pourra alors être envisagée . Ainsi, une étude plus approfondie du système immunitaire de Spodoptera frugiperda va pouvoir voir le jour à partir de cette technique d'ARN interférence, menant à une meilleure compréhension des mécanismes qui le lie à ses pathogènes et permettant à plus long terme le développement de nouveaux outils de lutte biologique contre ce ravageur de culture. Bibliographie [1]http://www.ird.fr/fr/actualites/fiches/2004/fiche214.ht [2] R. Dziarski and D. Gupta (2006). 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