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Les Productions Microbiennes

115 Les nouveaux biosurfactants sont surtout des sucres modifiés. Industrial BioProcessing 23 (MAY01) contient un survol des approches actuellement envisagées pour en produire. Dans les biosurfactants étudiés industriellement, le pôle hydrophile est le plus souvent constitué par un sucre ou un acide aminé, et le pôle hydrophobe, est presque toujours constitué par un lipide. Lipases et protéases fonctionnant à l'envers (donc en milieu hydrophobe) sont utilisées. Parfois c'est une production microbienne.

Le Centro de Investigacion y Desarrollo de Barcelona utilise la papaïne pour produire des surfactants par greffe de diverses alkylamines ou alcools sur l'arginine.

L'Institute for Food Research à Norwich utilise une synthèse enzymatique basée sur les sucres pour des émulsifs à usage alimentaire. Ils utilisent une lipase agissant sur le sorbitan (dérivant du sorbitol par déshydratation) qui le greffe sur les acides gras. Tout dépend d'un solvant organique adéquat pour faire fonctionner l'enzyme en réverse. Il faut dissoudre les réactifs sans altérer l'enzyme. Ces chercheurs utilisent un mélange azéotrope de n  hexane et de tert butanol. Ils utilisent également des glucosidases pour former des glycosides éthoxylés, à partir de glycols éthoxylés.

A l'University of Iowa on cyclise le glucose ou le saccharose en sulfite puis sulfate qui est, ensuite couplé à des acides gras ou des acylamines.

Des chercheurs de l'Université de Keio à Yokohama réalise la production d'octyl ß-D-xylobioside avec une enzyme d'Aureobasidium pullulans.

Les rhamnolipides de Pseudomonas sont utilisés à l'University of Arizona à Tucson. Ils sont, au passage, fongicides.###

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117 Le gène RAG4 de Kluyveromyces lactis code un capteur de glucose. La protéine est homologue de deux protéines de Saccharomyces cerevisiae, Snf3p et Rgt2p, qui sont des capteurs de glucose à basse et forte concentrations. Les deux fonctions sont probablement regroupées dans la même protéine chez Kluyveromyces lactis car il n'existe pas d'autres homologues SNF3/RGT2 chez cette levure. Chez les mutants rag4, la répression de plusieurs enzymes inductibles par le glucose est supprimée. S Betina et al.; Genetics 158 (JUN01) 541-548.

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118 CheY est est un prototype de protéine régulant la chimiotaxie bactérienne, agissant dans le cadre d'un récepteur à deux composants (capteur+transmetteur). La phosphorylation d'un aspartate conservé du site actif entraîne un changement conformationnel modulant les interactions avec la kinase CheA, la protéine FliM du moteur flagellaire, et la phosphatase CheZ. On a une signalisation en retour car la fixation de CheA, CheZ et FliM affecte considérablement l'autophosphorylation de CheY par des donneurs de groupements phosphate. L'autodéphosphorylation et l'affinité pour le substrat ne sont, par contre, pas affectées. Les résidus Thr87, Tyr106 et Lys109interviennent dans le mécanisme d'activation mais ne sont pas essentiels au couplage conformationnel. M Schuster et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98 (22MAY01) 6003-6008.

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120 La dynamique des flux métaboliques du galactose chez Saccharomyces cerevisiae lors d'additions ponctuelles (une injection de galactose à 5,58 mM) en culture aérobie en galactose limitant montre que c'est le produit du gène GAL7 qui régule le flux à travers de la voie de Leloir.

La teneur en ATP en présence de galactose est inférieure à celle observée en présence de glucose dans les mêmes conditions (sucre limitant). Le pulse est consommé en 40 minutes. Dès la 7° minutes le flux vers le cycle de Krebs diminue, acétate et ethanol commençant à être excrétés. A 30 minutes la croissance reprend à la moitié de la cadence normale. Quand le galactose a été consommé, la division cellulaire cesse puis reprend au bout d'un délai mais n'atteint que la moitié de la croissance à l'équilibre. Le flux vers le cycle de Krebs dépasse alors la normale. En fait, durant toute cette période la concentration en galactose-1-phosphate est supérieur à la normale, l'affinité de Gal7 étant trop faible, ce qui entraîne la réponse toxique limitant le métabolisme. S Ostergaard et al.; Biotechnology & Bioengineering 73 (20JUN01) 412-425.

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122 On trouvera dans un article australien RJ van Wegen et al.; Biotechnology & Bioengineering 74 (05JUL01) 70-81, une analyse de la cinétique de production de poly(3-hydroxybutyrate) ou PHB par des E.coli recombinantes, ainsi que du métabolisme correspondant. Le flux de PHB est très sensible au rapport acétyl-CoA/CoA à la concentration totale acétyl-CoA+CoA et au pH. Il est beaucoup moins sensible au ratio NADPH/NADP et insensible à la concentration NADPH+NADP. Aucune enzyme en particulier n'est limitante. La carence en oxygène permet un démarrage rapide de la production et initie une série de changements métaboliques comme l'arrêt du flux dans le cycle de Krebs et un accroissement du ratio acétyl-CoA/CoA.

Le flux des publications sur la production du PHB ne se tarît pas malgré l'abandon par Monsanto (qui a transféré le bébé à Metabolix) et d'ICI qui est probablement dû au fait que c'est la faiblesse de la production qui la rend, actuellement, non rentable (y compris dans les plantes) et que le nœud du problème réside dans le pilotage du métabolisme général pour l'adapter qui avait été trop négligé dans les premières versions des outils de production.

L'US Patent 6,248,862 (19JUN01) déposé le 17 Août 2000, de Monsanto, décrit la production de polyhydroxyalcanoates relativement thermostables et pouvant être ramifiés car hydroxylés à leur extrémité, en cultivant un organisme producteur en présence de diols ou polyols.

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123 La plupart des microalgues sont des photoautotrophes obligés. Leur exploitation comme des producteurs de différents produits biologiques utiles a été vantée par plusieurs firmes qui avançaient la possibilité de cultures en plein air dans des étangs, sans apport d'énergie, etc… On sait, par ailleurs, transformer plusieurs d'entre elles.

Malheureusement le "plein air" se contamine facilement (et les microalgues très halo- et thermorésistantes sont une parade à ce danger), et les densités cellulaires ne sont pas extraordinaires, ce qui complique la culture et surtout la collecte, même si des souches ou des espèces comme Phaeodactylum tricornutum (diatomée) cultivables à fortes densités existent.

Ceci explique que la firme Martek vient de rendre cette diatomée cultivable en présence de glucose, et bien à l'abri dans un fermenteur en implantant un transporteur de glucose humain (glut1 ou hup1). LA Zaslavskaia et al.; Science 292 (15JUN01) 2073-2075.

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124 Nestec a breveté la production de dextranes à partir de saccharose pour la cosmétique et l'alimentation par un Leuconostoc mesenteroides ssp. Cremoris. US Patent 6 242,226 (05JUN01) déposé le 12 Novembre 1999 et faisant suite au brevet européen 97/201628 (31MAY97). On y retrouvera une longue liste des procédés brevetés pour la production des polysaccharides. Les fructosyltransférases sont utilisées pour préparer des quantités commerciales de glucose à partir de saccharose. Des polyfructanes produits durant l'excision du glucose par des fructosyltransférases et des glucosyltransférases peuvent donner des polyglucanes lors de la libération de fructose.

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125 Pseudomonas aeruginosa, un pathogène opportuniste des animaux, donne des biofilms dans certains tissus, mais également en liberté. Ces biofilms font intervenir les composants de la voie des chaperone/usher (chaperone périplasmique et la protéine usher (huissier) mentionnées dans le bulletin de Mai). Les gènes correspondants ont été identifiés par un groupe de Marseille et de Harvard en les inactivant par Tn5. Ces gènes ont été dénommés cupA1-A5. Il existe des homologues (CupB et CupC) dans le génome mais ils ne semble pas utilisés dans l'adhésion. Il est vraisemblables que ces gènes sont utilisés selon le milieu ou le biofilm se développe. I Vallet et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98 (05JUN01) 6911-6916.

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126 Ajinomoto a breveté des souches de Klebsiella, Erwinia ou Pantœa dont les enzymes intervenant dans les embranchements greffés sur la voie de la synthèse de l'acide glutamique sont inactivées pour canaliser le metabolisme dans cette direction sous l'US Patent 6 197 559 (06MAR01).

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Les Protéines et les Enzymes

127 La structure cristalline d'une des kinésines, KIF1A, une enzyme permettant un déplacement unidirectionnel le long des microtubules vient d'être établie. M Kikkawa et al.; Nature 411 (24MAY01) 439-445 . L'enzyme fonctionne grâce à l'hydrolyse de l'ATP, et réalise des changements de conformation cycliques, comme le fait la myosine sur l'actine. Les auteurs ont cristallisé la molécule sous deux états, avec l'ADP et avec un analogue de l'ATP. Cette kinésine a la particularité de fonctionner à l'état de monomère, contrairement à beaucoup d'autres qui sont à plusieurs sous-unités, ce qui ne facilite pas l'étude structurale. Ceci se traduit d'ailleurs par des différences dans quatre des boucles de la protéine (L2, L3, L10 et L12).

Chez la myosine et la kinésine, le site fixant le nucléotide est flanqué par deux structures, les switch I et II, comme chez les protéines G (fixant le GTP). On connaissait la structure cristalline de la myosine et des protéines G dans les deux états, chargé et non chargé et on avait identifié les conséquences de l'hydrolyse de l'ATP qui entraîne l'inactivation des protéines G et le déplacement de la myosine. Ce qu'il y a d'intéressant dans cette dernière étude, c'est qu'une hélice  située face au microtubule dans la "tête" de la kinésine, s'allonge de deux tours au dépens d'une boucle adjacente, et tourne de 20° quand le nucléotide lié est l'ADP. La torsion de la molécule est alors communiquée au "cou" qui est l'élément essentiel du moteur. Les auteurs suggèrent que, quand l'ATP est présent, le tour de 20° permet l'agrafage de la kinésine sur les microtubules, comme les capsules sur certaines bouteilles. Voir également le commentaire de M Schliwa et al.; p. 424-425.

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128 Les protéases à sérine forment un abondante famille dont l'évolution a été analysée par MM Krem et al.; The EMBO Journal (15JUN01) 3036-3045.

On distingue, grâce à des marqueurs moléculaires comme les acides aminés et les codons utilisés pour la sérine, trois branches dans cette évolution: les chymotrypsin-like, subtilisin-like et hydrolases à plis /ß. Toutes regroupent une triade Ser–His–Asp dans le site actif, et la configuration peut évoluer, mais doit rassembler ces trois acides aminés, avec une sérine ou une cystéine stabilisant la triade (Ser214, Ser125 et Cys341respectivement dans chacune des branches). On peut interpréter ces résultats en envisageant des duplications de domaines suivies par un clivage du gène.

Ceci devrait permettre une amélioration de la prévision des relations structure/fonction et être utilisé pour d'autres familles d'enzymes.

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129 La substitution d'acides aminés chargés positivement par des acides neutres dans la fente accueillant le substrat d'une protéase de type subtilisine améliore son efficacité dans les détergents. US Patent 6 197 589 (06MAR01), octroyé à Henkel.

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130 Industrial BioSystems s'intéresse aux traitements enzymatique dans l'industrie du papier. L'une des utilités des xylanases est d'éviter la reprécipitation des xylanes sur les fibres de cellulose où ils piègent les restes de lignine.La société vient de breveté sous l'US Patent 6 200 797 (13MAR01) une xylanase bactérienne (xylanase B230) utilisable comme aide au blanchîment de la pulpe mécanique, kraft et dans l'industrie de la viscose. Elle a un pHopt très large (5 à 9) et fonctionne jusqu'à 70°. Elle ne remplace pas les produits chlorés, mais en réduit l'usage de 50%. Une des qualités de cette xylanase serait de ne pas avoir d'activité cellulasique résiduelle.

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131 L'US Patent 6,197,070 (06MAR01) de Procter & Gamble couvre l'utilisation d'une combinaison d'-amylases pour l'élimination de mauvaises odeurs, quand elles sont incorporées dans des mélanges détergents pour le linge. L'US Patent 6 204 234 (20MAR01) octroyé à la firme couvre l'utilisation d'oxygénases à soufre ou fer pour le nettoyage des taches protéiques sur les surfaces et le linge.

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132 La spécificité de longueurs de chaînes des acides gras hydrolysables par les lipases peut être modifiée. Celle de Rhizomucor miehei a été modifiée par substitution au hasard de la Phe94 dans la fente qui accueille la chaîne acyle. Quatorze des 19 mutants possibles ont été identifiés et exprimés dans Pichia pastoris qui sécrète l'enzyme, ce qui facilite l'étude. La mutation Phe94Gly est six fois moins active sur l'ester de resorufine mais est 3-4 fois plus active sur des esters d'acides butyrique, nettement plus courts. La structure de la molécule étant connue, les chercheurs de l'Institute of Food Research à Norwich ont interprété cette nouvelle donnée en termes structuraux. DJ Gaskin et al.; Biotechnology & Bioengineering 74 (20JUN01) 433-441.

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133 La fracturation des roches-mères des gisement pétroliers est entreprise quand il faut libérer le plus possible de pétrole en fin d'exploitation. On injecte des gommes et du sable qui empêche les fissures de se refermer. Les gommes et polysaccharides divers utilisés servent à obtenir un mélange fluide qui peut être plus facilement injecté et maintient le sable en suspension. Mais les gommes ont tendance à boucher les cavités étroites, et il faut pouvoir s'en débarrasser quand elles ne sont plus utiles. On peut donc ajouter des enzymes pour les dissoudre. L'US Patent 6 197 730 (06MAR01) couvre l'utilisation d'-galactosidases et de ß- mananases agissant respectivement sur les liaisons -1,6 et les liaisons ß-1,4 du guar. Ces enzymes sont issues de microrganismes thermophiles dont une longue liste est citée, mais avec une insistance sur Thermotoga, Thermococcus et Pyrococcus, qui sont plus accessibles. La thermophilie est recherchée, car les enzymes ne doivent pas s'attaquer à la gomme pendant le stockage à la surface, mais devenir actives en profondeur dans le sol, au delà de 80°.

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134 L'amélioration de la stabilité thermique d'une phytase a été l'occasion pour des chercheurs de Roche Vitamins d'un exercice de construction de chimères. L Jermutus et al.; Journal of Biotechnology 85 (23JAN01) 15-24. Ils ont comparé les phytases d'Aspergillus terreus et d'Aspergillus niger relativement plus thermostable. Ils ont comparé les techniques de mutations dirigées et la création de chimères à l'échelle de structures secondaires comme les hélices, etc…en les transférant de l'enzyme d'A.niger dans celle d'A.terreus. Ainsi l'hélice comprenant les acides aminés 66 82, a amené la thermostabilité au niveau de celle d'A.niger. Au contraire des modifications rationnelles de la surface de l'enzyme en renforçant ponctuellement des liaisons ioniques ou des hydrogènes comme c'est le cas chez A.niger n'ont pas donné les résultats attendus.

Des chercheurs allemands et espagnols ont caractérisé une phytase acide de germes de fève. R Greiner et al.; Journal of Agricultural & Food Chemistry 49 (MAY01) 2234-2240. Les phytases microbiennes sont connues, mais on ne connait que peu de phytases de plantes (du maïs par exemple), et les industriels souhaiteraient en avoir plus à leur disposition car ils pensent que, provenant de plantes, elles seraient mieux acceptées par les consommateurs.

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135 Novo Nordisk a breveté sous l'US Patent 6 242 237 (05JUN01) déposé le 21 Août 1998 et faisant suite à deux brevets danois sur des galactanases de Myceliopthora thermophila et Humicola insolens (deux Sordariales) ayant un pHopt supérieur à 5,9. C'est le point faible de nombreuses galactanases qui ont été isolées et qui sont toutes à pHopt acides. De plus seul le cDNA de la ß-1,4-galactanase d'Aspergillus aculeatus a été cloné et séquencé par la firme (brevet mondial WO 92/13945 d'Août 1992). Les auteurs ont identifié deux motifs qui leur permettraient d'identifier d'autres gènes de galactanases des Sordariales.
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