THÈse pour obtenir le grade de
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| UNIVERSITE JOSEPH FOURIER – GRENOBLE I SCIENCES & GEOGRAPHIE École Doctorale Chimie et Sciences du Vivant THÈSE Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ JOSPEH FOURIER GRENOBLE I Discipline : Chimie Physique Moléculaire et Structurale Présentée et soutenue publiquement par Nicolas DURAFFOURG le 21 décembre 2006 Détermination de la structure par RMN d’une protéine impliquée dans la biosynthèse de centres [Fe-S] : SufA  Jury : Dr. Jean-Marc LATOUR Président Dr.Françoise GUERLESQUIN Rapporteur Dr. François PENIN Rapporteur Dr. Dominique MARION Co-Directeur de thèse Prof. Marc FONTECAVE Directeur de thèse Remerciements Je tiens à remercier tous les membres du jury d’avoir accepté de juger ce travail. Je remercie le Docteur Françoise Guerlesquin ainsi que le Docteur François Penin d’avoir accepté d’être rapporteur de ce travail ainsi que pour leurs conseils avisés. Je remercie le Docteur Jean Marc Latour d’avoir accepté d’examiner ce travail et de présider le jury de ma thèse. Je remercie le Docteur Dominique Marion, co-directeur de cette thèse de m’avoir accueilli au sein de son groupe, pour sa confiance et ses encouragements au cours de ces années. Je reste toujours admiratif des explications métaphoriques que tu m’as quelques fois distillées me laissant croire que certains aspects de la RMN pouvaient être simples… (en général, ça ne durait pas longtemps). Je remercie le Professeur Marc Fontecave et lui exprime ici toute mon estime de m’avoir accueilli au sein du laboratoire CBCRB ainsi que de la confiance qu’il m’a accordée dès mon arrivée. Cette aventure n’aurait jamais eu lieu sans ton soutien et ton écoute dans les moments délicats. Le présent travail a été réalisé entre le laboratoire CBCRB du CEA Grenoble auquel je suis rattaché et le laboratoire LRMN de l’institut de Biologie structurale. Je voudrais tout d’abord remercier Jean-Pierre Simorre, Directeur du laboratoire LRMN, d’avoir accepté ma présence durant ces dernières années ainsi que tes conseils avisés. Je voudrais maintenant remercier deux personnes pour qui j’ai une très grande estime. Tout d’abord Le Docteur Laurence Blanchard, sans laquelle je n’aurais jamais fait ce travail de thèse. Merci pour ta gentillesse durant toutes ces années, ta patience et ta grande pédagogie. Merci pour tes encouragements et les discussions scientifiques... ou non. Je te souhaite une belle réussite professionnelle dans tes nouvelles fonctions. Tu es quelqu’un de bien ! soit « cool… » La deuxième personne que je ne veux pas oublier est le Docteur Klaartje Houben. Tu es celle qui m’a le plus aidée durant ces années et je t’en suis extrêment reconnaissant. Merci de m’avoir initié au calcul de structure avec notre ami « ARIA » ainsi que pour ta grande patience et ton aide permanente. J’admire ta grande connaissance scientifique et reste surtout admiratif de tes capacités linguistiques, moi qui ne suis pas vraiment doué dans ce domaine. Et surtout, merci pour ton amitié quotidienne ainsi que tous les bons moments partagés en montagne. Espèrons qu’il y en aura d’autres. Je voudrais te souhaiter une grande réussite scientifique et personnelle. Un grand merci à Paul Schanda, brillant Doctorant Autrichien, qui comme Klaartje est un expert linguistique mais surtout un grand sportif avec qui j’ai partagé d’excellents moments que ce soit au laboratoire ou en montagne. Merci pour ta gentillesse et ton aide durant cette thèse. Vivement qu’on retourne se faire une « petite » balade… Merci à toi, Adrien, de m’avoir supporté dans ton bureau et d’avoir supporté les sollicitations fréquentes à propos de petits problèmes informatiques…ainsi que pour tes conseils avisés à propos des calculs de structures. Merci pour les pauses café. Je remercie Catherine, Béate, Isabelle, Bernhard, Martin, Jérome, Pierre, du laboratoire LRMN pour leur symphatie et disponibilité. Merci aussi à tous les étudiant(e)s et post-doc de ce laboratoire pour leur gentillesse et leur aide : Hélène, Rodolpho ,Ewen, Thomas , Guillaume , Rémy, Julien ainsi que Denis. Du côté du laboratoire CBCRB je voudrais particulièrement remercier le Docteur Sandrine Ollagnier de Choudens de m’avoir permis de travailler sur cette protéine et de m’avoir toujours fourni efficacement les échantillons nécessaires. Je voudrais aussi te remercier pour ta grande rigueur au cours de la lecture de ce document et pour tes précieux conseils. Tu es donc la troisième fée qui s’est penchée sur moi et sans laquelle ce travail ne serait pas ce qu’il est. Je voudrais aussi remercier le Docteur Vincent Nivière avec qui j’ai débuté ce travail de thèse. Merci pour ta pédagogie et de m’avoir initié à la purification de protéine. Je voudrais, ici, associé le Docteur Jacques Gaillard, pour qui j’ai le plus profond respect. Merci à toi Jacques d’avoir accepté de me diriger au début de cette thèse. Merci pour ton humanité et tout ce que tu m’as appris. Je te souhaite de bien profiter de ta nouvelle vie. Je remercie le Docteur Stéphane Ménage, avec qui j’ai commencé cette aventure dans le laboratoire de chimie et avec lequel je partage un certain gôut de la répartie…j’avoue que tu es un peu meilleur que moi mais je progresse. Bref, j’espère que l’on retravaillera ensemble. Merci à tous les autres membres du laboratoires pour toutes les discussions autour du café comme pour les franches rigolades et les bonnes eng…….. Bref, merci pour cette bonne tranche de vie au laboratoire. Je ne regrette pas d’être là et compte bien y rester encore un peu. Merci à tous les Thèsards et post-Doct du laboratoire passé et présent pour leur bonne humeur, leur sympathie et les bonnes discussions pas toujours très sérieuses. Vu le nombre, si je dois en citer une, c’est toi Maïté de m’avoir fourni des échantillons et pour les discussions intéressantes que nous avons pu avoir sur le sujet. Merci à toi Olivier, pour ton amitié et ton soutien permanent. Pour ta présence dans les moments forts, voir difficiles de ces dernières années, aussi bien professionnels que personnels. Pour terminer, je voudrais remercier le CEA pour son accompagnement permanent au cours de cette longue aventure de formation, pour la confiance qui m’a été témoigné aussi bien sur les centres CEA de Valduc et de Grenoble. Pour les mêmes raisons je remercie l’université de Bourgogne et l’université Joseph Fourier de Grenoble. Je ne pourrais pas être digne si j’oubliais de remercier ma famille, parents et frères, qui m’ont toujours encouragé et soutenu au cours de toutes ces années. Bien entendu, si il y une personne que je ne peux oublier c’est toi, Alexandre, mon garçon qui ne m’a pas beaucoup vu ces derniers temps. Je te dédie cette thèse et suis fier de toi. Merci à toi, Emmanuelle pour ton soutien, ton aide et tes encouragements au cours de cette rédaction, d’avoir supporté quelques nuits blanches et bien entendu pour tout ce que nous avons partagé… Avant-propos Cette thèse est l'aboutissement d'une démarche entamée voilà maintenant presque dix ans. Suite à l'obtention en 1999 d'une Maîtrise en Sciences et Techniques " Contrôle et Analyse Chimique " de l'Université de Bourgogne, et après avoir obtenu le DEA " Chimie-Physique Moléculaire et Structurale " l'année suivante, j'ai intégré le laboratoire Chimie Biologie des Centres Rédox Biologiques du Professeur Marc Fontecave au CEA Grenoble, au sein duquel j'assume la maintenance et développement du spectromètre de résonance magnétique nucléaire (RMN) Brüker Avance 300, ainsi que diverses responsabilités administratives. En accord avec ma formation, je me suis naturellement orienté vers l'activité chimie du laboratoire, principale utilisatrice du spectromètre RMN, et plus particulièrement vers l'étude par RMN du proton (1H) et du carbone (13C) de diastéréoisomères de complexes de Fer. Une des spécificités du laboratoire est d’associer chimistes et biologistes afin de mieux appréhender certains mécanismes biochimiques fondamentaux mais aussi de développer de nouveaux catalyseurs chimiques capables d’effectuer, par exemple de l’oxydation énantiosélective ; cette collaboration passe pour les chimistes par la synthèse de composés inorganiques via une approche biomimétique originale. Dans ce cadre Ménage S et collaborateurs ont synthétisé un certain nombre de complexes mononucléaires et binucléaires à Fer. Associé à cette problématique, j’ai débuté mon étude par la synthèse de complexes mononucléaires de Fer par auto-assemblage avec des ligands organiques polyaromatiques du type bipyridine, phénantroline... L’objectif était de pouvoir discriminer les deux énantiomères et , issus de la chiralité au métal, via la formation de diastéréoisomères, que l’on espérait pouvoir séparer. Cette étude reposait essentiellement sur l'analyse de spectres 1D, parfois 2D (2D COSY), comme la plupart des analyses RMN effectuées par les chimistes. A l'issue de mon DEA, j'ai émis le vœu de poursuivre en thèse, mais il me semblait alors plus pertinent, étant rattaché à la Direction des Sciences du Vivant du CEA, de m'orienter vers l'analyse d'entités biologiques, telles que les protéines et plus précisément les métallo-enzymes étudiées au laboratoire. Ceci devrait me permettre d’élargir mes compétences, et par conséquent en apporter de nouvelles au laboratoire. Abréviations 1D, 2D, 3D Spectre à 1, 2, 3 dimensions ADN Acide désoxyribo nucléique ARIA Ambiguous Restraints in Iterative Assigment aniso anisotropique ARN Acide ribonucléique CaCl2 Chlorure de calcium CSA Anisotropie du déplacement chimique CSI Index des déplacements chimiques CNS Cristallography and NMR Systeme nDIS Couplage dipolaire à n liaisons entre le spin I et le spin S Da Dalton : poids moléculaire (1 Da ≈ 1g/mol) EDTA Ethylène diamine tétra-acétate ENH Electrode normale à hydrogène H-bound Liaison hydrogène HCl Acide chlorhydrique HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Hz Hertz IPTG IsoPropylThioGalactoside Isc Iron sulfur cluster iso Isotrope nJIS Couplage scalaire à n liaisons entre le spin I et le spin S Kd Constante de dissociation mA milliampère MgCl Chlorure de magnésium mg milligramme min minute mL millilitre mV millvolt μM micromolaire NaCl Chlorure de sodium NH4Cl Chlorure d’ammonium NiNTA Nickel NitriloTriAcitic acid nm nanomètre nOe Nuclear Overhauser Effect NOESY Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PCR polymerase Chain Reaction PDB Protein Data Bank ppm partie par million RDC Residual Dipolar Coupling RMN Résonance Magnétique Nucléaire RPE Résonance Para-Electronique rpm tour par minute SDS Sodium DodécylSulfate SOR SuperOxydeRéductase Suf protéine Suf (pour Sulfure) TALOS Torsion Angle Likelihood Obtained from Shift and sequence similarity TROSY Transverse Relaxation-Optimized Spectroscopy UV Ultra-Violet V Volt Table des Matières  Introduction 1 P remière partie - La protéine SufA Chapitre I – BIOSYNTHESE DES CENTRES [Fe-S] 3 INTRODUCTION 3 I-LES DIFFÉRENTS CENTRES [Fe-S] 4 I.1-Structure atomique des centres Fe-S 4 I.1.1-Les centres [1Fe] 5 I.1.2-Les centres [2Fe-2S] 6 I.1.3-Les centres [4Fe-4S] 8 I.1.4-Les centres [3Fe-4S] 9 I.1.5-Les centres complexes 10 II-FONCTIONS DES PROTÉINES [Fe-S] 11 II.1-Les centres [Fe-S] dans le transfert d'électrons 11 II.2-L'activité enzymatique des centres [Fe-S] 12 III-BIOSYNTHESE DES CENTRES [Fe-S] 14 III.1-Introduction 14 III.2-Le système SUF 16 III.2.1-Analyse physiologique 16 III.3-Les protéines Suf 17 III.3.1-Le complexe SufSE 17 III.3.2-Le complexe SufBCD 20 II.3I.3-La protéine SufA 20 III.4-Mécanisme d’assemblage de centre et transfert 23 III.4.1-L'assemblage de centre 23 III.4.2-Le transfert de centre 25 Chapitre II - Etude par RMN d’une protéine de grande taille 27 I-ÉTUDE PAR RMN D’UNE PROTÉINE DE MASSE MOLÉCULAIRE ÉLEVÉE 29 I.1-Limites imposées par la méthode de la RMN 29 I.1.1-Limites liées aux propriétés de l’échantillon biologique 29 I.1.2-Limites liées à la taille de la protéine étudiée 29 I.2-Les principales avancées visant à repousser les limites de la RMN 30 I.2.1-Les spectromètres 30 I.2.2-Les cryosondes 31 I.2.3-Le marquage isotopique des échantillons pour une RMN multidimensionnelle 31 I.2.4-La deutération 32 I.2.5-La spectroscopie TROSY 35 II-ETAPES DE L’ÉTUDE PAR RMN DE PROTÉINE DE GRANDE TAILLE 37 II.1-Expression de protéines recombinantes et marquées pour la RMN 37 II.1.1-Optimisation d’un système d’expression 38 II.1.2-Le milieu de production 39 II.1.3-Les techniques de marquage isotopique 39 II.1.4-Préparation de l’échantillon RMN 40 II.2-Attribution des raies de résonances d’une protéine marquée 41 II.2.1-Attribution de la chaîne principale et des C 42 II.2.2-Attribution des chaînes latérales 46 II.3-Recueil des contraintes structurales 48 II.3.1-Les contraintes mesurables classiques 48 II.3.2-Les contraintes orientationnelles 51 II.3.2.1- Interaction dipolaire 52 II.3.2.1.1- Aspect théorique 52 II.3.2.1.2-Les bactériophages filamenteux 55 III-MODÉLISATION MOLÉCULAIRE 56 III.1-Introduction 56 III.2-Le calcul de structure 57 III.2.1-Le champ de force 58 III.2.2-Méthode de calcul – ARIA1.2 60 IV-ETUDE DE DYNAMIQUE 62 Chapitre III - Production et attribution de la protéine SufA 67 I-PRÉPARATION DE L’ÉCHANTILLON DE LA PROTÉINE SufA 67 II.1-Résultats de production de la protéine SufA 68 II-CARACTÉRISATION PRÉLIMINAIRE DE SufA 68 III.1-Caractéristiques de SufA d’E. coli 69 III.2-Prédiction de structures secondaires de SufA 70 III.3-Echantillon RMN 71 III-ATTRIBUTION DES RÉSONANCES 72 III.1-Stratégie d’attribution des résonances de la chaîne principale 73 III.2-Attibution séquentielle et CSI 74 III.3-Analyse de mutants 76 III.4-Analyse de la protéine SufA avec son centre [Fe-S] 78 III.5-Attribution des chaînes latérales 82 III.6-Attribution des aromatiques 84 III.7-Note d’attribution 86 III.8- Échange de protons amides 86 Chapitre IV - Détermination de la structure de SufA 88 I-CONTRAINTES DE DISTANCES 88 I.1-Extraction des nOe courtes portées 90 I.2-Extraction des nOes inter-brins β et moyenne portée 90 I.3-Extraction des nOe longue portée 92 II-CONTRAINTES D’ANGLES DIÈDRES 96 III-CONTRAINTES ORIENTATIONNELLES 96 III.1-Préparation du milieu cristal liquide et des échantillons 97 III.1.1-SufA dans les bactériophages Pf1 97 III.1.2-Mesure de couplages dipolaires résiduels le long de la chaîne polypeptidique 98 III.1.2.1-Principe de la mesure 98 III.1.2.2-Expériences enregistrées sur SufA 99 III.1.2.3-Extraction des couplages dipolaires résiduels 99 IV-CONTRAINTES DE LIAISONS HYDROGÈNE 100 IV- CALCUL DE STRUCTURE DE SufA 101 IV.1- Calcul avec ARIA/CNS 101 V- ANALYSE DE LA DYNAMIQUE DE SufA 108 Chapitre V- DISCUSSION 110 S econde partie - La SOR de Treponema pallidum 120 |
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| | «capricieuse»!!! Merci également de m’avoir permis d’être impliqué dans des collaborations (eth zurich) et dans un programme Européen... | |
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