A.«chromatographie liquide haute performance»








télécharger 146.07 Kb.
titreA.«chromatographie liquide haute performance»
date de publication19.01.2018
taille146.07 Kb.
typeDocumentos
b.21-bal.com > comptabilité > Documentos
HPLC

A.« CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE »


(H.P.L.C)

La H.P.L.C., est une technique de chromatographie qui permet de séparer et éventuellement de déterminer la concentration des différents produits d’un mélange.

_ Elle comporte un appareillage simple, constitué d'une colonne de verre remplie de particules de phase stationnaire, le solvant migrant sous le simple effet de la pesanteur. Toutefois, dans de telles conditions, la résolution obtenue est relativement médiocre.

Les progrès sont venus de la possibilité de fabriquer des particules de très faible taille (3 - 10 µm) et de granulométrie homogène, qui permettait de réaliser des colonnes très efficaces, mais au prix d'une augmentation considérable de la résistance au passage du solvant (= perte de charge), impliquant la nécessité d'employer des pompes à haute pression pour pousser les solvants (et des tubes résistants pour y mettre les phases stationnaires) : ainsi naquit la chromatographie liquide à haute performance/pression (C.L.H.P. - ou HPLC en anglais).

Les méthodes de CLHP se sont progressivement diversifiées et répandues dans tous les laboratoires où elles représentent l'outil de séparation chromatographique le plus courant (à l'échelle analytique ou préparative).
Avant de commencer, il nous est nécessaire de nommer les constituants que nous allons étudier : au cours de ce travail nous étudions le comportement chromatographique de divers composés aromatiques décrits dans la publication intitulée « New Synthesis of plant aryl glycosides as potential gene inducers » de D. Delay et F. Delmotte (1990) Carbohydrate Research 198, 223-224.

Ainsi, on va réaliser la séparation de différents composés aromatiques utilisés pour synthétiser les glycopyrannosides décrits dans cette publication.
S18 : Acetovanillone(4’hydroxy-3’methoxyacetophenone)

HOC6H3(OCH3) COCH3 MM=166g/mol. S20 : Acetosyringone(3’,5’-dimethoxy-4’-hydroxyacetophenone)

HOC6H2(OCH3) COCH3 MM=165g/mol.

S21 : Syringaldehyde(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzaldehyde)

HOC6H2(OCH3)2 CHO MM=182g/mol.

S22 : Syringic Acid(4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoïc acid)

HOC6H2(OCH3)2 CO2H MM=198g/mol.

S23 : Acide benzoïque

C6H5COOH MM=122g/mol.

Dans un souci de clarté, on joint un tableau ci-dessous résumant les valeurs importantes des temps de rétention et de surfaces de chaque produit, indispensable pour répondre aux questions :

Temps de retention Surface

(min et 1 /1000 min)
S18 : 7,66 219914
S20 : 8,12 48639
S21 : 6,84 31657
S22 : 4,45 139713
S23 : 11,02 21960



REPONSES AUX QUESTIONS :
1° Concentrations molaires : C=Concentration massique/Masse molaire.

_ C18=0,1.10-3/166=6,02.10-4 mol/L ou 6,02.10-7 mol/ml.

Sur ce même principe :

_ C20=6,06.10-4 mol/L. _ C21=5,49.10-4 mol/L.

_ C22=5,05.10-4 mol/L. _ C23=8,19.10-4 mol/L.

2° _ On injecte les produits dans l’ordre suivant : S18-S20-S22-S21-S23, cet ordre place le produit 22 avant 21 car le 21 possède une fonction aldéhyde qui à tendance à se transformer en fonction acide du 22.

Ainsi il existe 2 produits 21, un jeune et un vieux , on injecte d’abord le vieux ou 21** pour montrer que le détecteur tracera 2 réponses sous forme de courbes distinctes, c’est pour cela qu’avec le produit 21 jeune on peut déterminer son temps de rétention spécifique.

_ Le méthanol est injecté pour caractériser un volume mort par rapport aux autres produits injectés.
3° _On appelle temps de rétention (tr), le temps d’élution au maximum du pic mesuré à partir de l’injection.

Ces tr ont été déterminés ci-dessus, ces valeurs correspondent à des temps retrouvés sur les graphiques spécifiques des produits au niveau de leur pic maximal.

_ On appelle facteur de capacité, le facteur défini comme le rapport de la quantité de soluté dans la phase stationnaire à la quantité de soluté dans la phase mobile.

k=(Tr (du produit) – Tr’ (du produit non retenu)) /Tr’ (du produit non retenu)

avec : Tr=Temps de rétention de chaque produit.

Tr’=Temps de rétention du méthanol=2,02.
_k(S18)=(7,66-2,02)/2,02=2,79 Sur le même principe : _k(S20)=3,02

_k(S21)=2,38 _k(S22)=1,20 _k(S23)=4,45.
4°_ Les Tr trouvés sont significativement différents de ceux de la publication ; même si les produits sont semblables, un paramètre varie entre les 2 expériences : la longueur de la colonne

L=150mm (experience) L=230mm (publication)

Ainsi, on peut démontrer que plus la colonne est longue et plus les particules mettent longtemps à diffuser.

Retention time (min) Retention time (min)

(experience) (publication)
S18 7,66 14,51
S20 8,12 15,63
S21 6,84 12,85
S22 4,45 7,43



5°_ S23, qui correspond à de l’acide benzoïque, ne peut constituer un bon témoin interne, pour plusieurs critères :

- un témoin interne, ne peut avoir un temps de rétention trop long.

- S23 possède un coefficient d’extinction molaire beaucoup trop petit pour prétendre être un bon témoin interne.
6°_ On utilise des cellules de 0,5cm de trajet optique en quartz car ce matériau est le plus approprié par rapport à des matériaux comme le verre ou le plastique qui engendreraient des problèmes de réfraction-diffraction.
7°_ Déterminons les max, les max et les  à =270nm :

_ En utilisant l’annexe 1, et les formules souhaitées, on peut regrouper les valeurs dans un tableau ci-dessous :

1. Amax max A270 max 270



S18 1,477 272,5 1,447 4906,97 4807,31
S20 1,084 295,9 0,501 3577,56 1653,46
S21 1,117 303,6 0,312 4069,21 1136,61
S22 1,101 266,6 1,095 4360,39 4336,63
S23 0,175 268,6 0,178 427,35 434,67



Un exemple avec S18 : Amax=c.max.l _d’où max=Amax/c.l

_ (S18)=1,477/(6,0210-4.0,5)=4906,97

_ (S18)270=1,447/(6,0210-4.0,5)=4807,31.
8° _ Un détecteur « à barrette de diodes » est un concept moléculaire qui analyse en permanence l’intégralité de la bande passante du spectrophotomètre, celui-ci est tres sensible à toutes les longueurs d’ondes, cependant ici, cela ne serait pas utile, les longueurs d’ondes étant pré-déterminées, cela engendrerait un problème d’échelle sur le graphique, soit une droite inanalysable par rapport à une courbe bien dessinée.
9° _ Déterminons la vitesse de réaction d’oxydation du 21 en 22 : 21 ---------- 22 To----C21 Cm=0,1mg/ml et C=5,4910-4mol/L

COH COOH TTo 21residuel + 22 apparu

V=-d21 /dt=d22 /dt. ------------- (S22/22)/(S21/21)=C21/C22

_ D’où : (31657/4360,39)/(49903/4069,21)=3/5

----------TTo : C21.5/8=0,0625.

----------v=-(0,0625-0,1)/16-0=2,3410-3mg/ml/jr ou 2,7110-8mg/ml/jr.
10°_ Nous avons donc pris un mélange inconnu à analyser, et grâce aux différents temps de rétention déterminés, nous pouvons démontrer la présence des constituants suivants :

-Tr=4,41 d’où Tr(théorique)=4,45 soit le produit S22

-Tr=6,79 d’où Tr(th.)=6,84 soit le produit S21

-Tr=10,90 d’où Tr(th.)=11,02 soit le produit S23.

_ Pour calculer les différents points suivants, on pose un témoin interne proche des produits du mélange : S22 avec C=0,025mg/ml

donc : S22corrigée=S22/22= 8,29 C21=(S21c.CE)/(SEc)

a) S21corrigée=S21/21= 12,26 d’où C21=1,6910-2mg/ml


S23corrigée=S23/23= 22,28 d’où C23=4,610-2mg/ml.

_ Calcul des points importants suivants :

_ Nombre de plateaux théoriques, N=16(Tr/)^2

Avec =largeur des pics à la base en mm ( pour déterminer cette largeur, il suffit soit de prendre les tangentes à la courbe et de mesurer, soit de trouver la largeur des pics à mi-hauteur et de la multiplier par 2)

Soit : -S22 : N=16(4,41/4)^2=19,4481.

-S21 : N=16(6,79/5)^2=29,50.

-S23 : N=16(10,90/6)^2=52,80.

_ Efficacité de la colonne, E=1/H avec H=L/N

Avec L =longueur de la colonne(mm), N=nb de plateaux théoriques et H=hauteur équivalente à un plateau théorique.

Soit : H22=150/19,4481=7,72 d’où E=0,13min^2.mm-3

H21=150/29,50=5,08 d’où E=0,19min^2.mm-3

H23=150/52,80=2,84 d’où E=0,35min^2.mm-3
_ Sélectivité, Facteur de séparation, F=Tr2/Tr1

Soit : Tr23/Tr22=10,90/4,41=2,47.
_ Résolution, R=2((Tr2-tr1)/(2+1))

Soit : R=2((10,90-4,41)/(6+4))=1,298.
11°_ On injecte maintenant ce mélange en prenant trois débits différents : 1,1-0,9-0,8ml/mn et on relève les différentes pressions de travail, soit

0,8ml/mn, P=86Bar 0,9ml/mn, P=96Bar

1,0ml/mn, P=107Bar 1,1ml/mn, P=116Bar.

On trace ainsi la droite P=f(débit) sur l’annexe 2, on se rend compte alors qu’il existe une proportionnalité directe entre le débit et la pression, on peut donc dire que plus on augmente le débit et plus les temps de rétention sont courts.
12° Pour relier la valeur des pressions au coefficient de viscosité des solvants employés, on peut employer la loi de Drancy :

P=(h.L.v.)/tc° avec : P=perte de charge, différence de Pression.

Tc°=constante de perméabilité de la colonne. h= viscosité de la phase mobile. v=vitesse linéaire de la phase mobile.
ANNEXE HPLC

Questions Subsidiaires :

L'essor de la chromatographie liquide coïncide avec l'apparition des détecteurs à circulation, il en existe plusieurs dont le réfractomètre différentiel.

L'indice de réfraction est l'une des constantes physiques des composés. Le réfractomètre différentiel mesure en continu la différence d'indice de réfraction entre la phase mobile et l'effluent de la colonne. La sensibilité est d'autant plus grande que la différence d'indice de réfraction des solutés à séparer et de la phase mobile est grande. Il existe deux types de réfractomètres :

_ le réfractomètre différentiel à déviation : il permet de mesurer la déviation d'un faisceau lumineux, provoquée par le changement d'indice de réfraction de la partie mesurée par rapport à celui de la partie référence.

_ le réfractomètre différentiel à réflexion : il permet de mesurer le déséquilibre d'énergie lumineuse provoquée par l'introduction d'un soluté dans la phase mobile traversant l'une des cuves .

_ La détection universelle du Détecteur à Diffusion de Lumière élimine les problèmes de détermination qualitative des produits, en effet pour l'ensemble des composés moins volatils que la phase mobile, la réponse de ceux-ci est quasiment proportionnelle à leur masse injectée dans le système chromatographique (à 20% près en moyenne). Ainsi, avec le Détecteur à Diffusion de Lumière, la réponse des composés peut être quantifiée par rapport à un étalon interne ajouté en quantité connue dans les solutions injectées, en outre avec cette méthode, l'utilisation de gradient rapide ne provoque aucune dérive de ligne de base.

_ Ainsi, en conclusion on peut dire que la séparation par HPLC est un procédé moléculaire principal permettant de séparer aujourd’hui des produits indétectables ; cependant, il ne faut pas en conclure pour autant que la chromatographie à basse pression a disparu.

_ Dans de nombreux cas, malgré sa plus faible efficacité, elle s'avère suffisante pour résoudre les problèmes posés et son très faible coût devient un atout majeur pour ce choix. C'est particulièrement vrai dans les méthodes préparatives utilisées dans les premières étapes du fractionnement des échantillons biologiques complexes.

Introduction


La chromatographie liquide à haute performance est une technique de séparation et de détermination des concentrations des différents constituants d’un mélange.

Ici, elle se compose d’une colonne d’acier inoxydable remplie de particules de phase stationnaire, le solvant qui migre sous l’effet élémentaire de la pesanteur. Cependant, dans de telles conditions, la résolution obtenue est relativement médiocre.

On a amélioré cette technique en fabriquant des particules de très faible taille (3 à 10 µm) et de granulométrie homogène, ce qui permettait de réaliser des colonnes très efficaces, mais en contrepartie, on augmentait considérablement la résistance au passage du solvant (c'est-à-dire une perte de charge), ce qui implique la nécessité d’employer des pompes à haute pression pour pousser les solvants dans des tubes résistants pour y mettre les phases stationnaires. A l’instant initial, le mélange à séparer est injecté à l’entrée de la colonne où il se dilue dans la phase mobile qui l’entraine à travers la colonne.

La HPLC est aujourd’hui l’une des techniques de chromatographie les plus utilisées avec la chromatographie en phase gazeuse (CPG), la chromatographie en couche mince (CCM), et bien d’autres (affinité, échangeuse d’ions)

L’inégale rétention des différents constituants du mélange qui traversent la colonne peut se faire si la phase stationnaire est bien choisie. Cette rétention entraine la différence entre la grande vitesse de déplacement de la phase mobile et celle des constituants, mais aussi entre les constituants eux-mêmes. On injecte le mélange, les points du mélange sont séparés, si les temps de rétention sont assez différents les uns des autres.

L’enregistreur intégrateur enregistre les données communiquées par le détecteur en sortie de colonne, et permet de les traiter, et de les interpréter. C’est ainsi qu’on obtient le chromatogramme, car au passage d’un produit séparé du mélange, le chromatogramme indique un pic. C’est à partir de ces pics que l’on peut déterminer les aires de surface délimitée, indicateur de la proportion du produit dans le mélange. Il permet aussi de déterminer les temps de rétention de chaque produit élué de la colonne, caractéristique de chaque produit.

Pour cette expérience, nous avons étudié le comportement chromatographique de divers composés aromatiques décrits dans la publication New Synthesis of plant aryl glycosides as potential gene inducers de D. Delay et F. Delmotte en 1990, Carbohydrate Research 198, 223-224. Nous avons ensuite dosé ces produits dans un extrait inconnu qui nous a été fourni. Nous avons donc étudié par HPLC la séparation de différents composés aromatiques utilisés pour synthétiser les glycopyrannosides décrits dans la publication. Tout ce travail a été fait dans les conditions suivantes :

  • Le travail a été effectué en mode isocratique c'est-à-dire que l’on a utilisé le même éluant tout au long de l’analyse

  • Pression de sécurité : Pmax = 250 Bar Pmin = 10 Bar

  • Colonne C18 – longueur 150 mm – diamètre 4,6 mm (phase inverse, apolaire)

  • Solvant C** : Eau/Acétonitrile/Acide Acétique – v/v/v/ 42/7/1 ; solvant A : Méthanol

  • Débit : 1 mL.min-1

  • Volume de la boucle d’injection : 20 µL

  • Détection en continu : spectrophotomètre UV (λ = 270 nm)

Nous avons programmé l’appareil de HPLC en mettant en marche la pompe, le spectrophotomètre et l’intégrateur, nous avons ouvert l’alimentation d’hélium, nous avons édité un programme pour la pompe dans les conditions suivantes :

  • Pression maximale : 250 Bars

  • Pression minimale : 10 Bars

  • 100% du solvant du flacon C

  • Débit : 1 mL.min-1

Nous avons alors lancé ce programme, et fait passer du solvant jusqu’à ce que la pression se stabilise et que l’appareil nous indique qu’il est prêt. Nous avons ensuite réglé la λ de travail (270 nm), et la vitesse de défilement du papier à 0,25 cm.mm-1. Nous avons alors utilisé une atténuation de 8 au début, puis nous l’avons réduite à 2 quand c’était nécessaire.
Temps de réaction, facteur de capacité et spectre d’absorption

Nous avons injecté successivement dans la colonne du méthanol, et les solutions S18, S20, S21**, S22 et S23. C’est le méthanol qui est utilisé dans la première injection car c’est un produit très polaire, qui n’absorbe pas vraiment à 270 nm, et se contente plutôt de « troubler » la solution ; la colonne est une phase inverse, apolaire, puisque composée de silice greffée de chaines linéaires de carbones, et donc elle retient plus fortement les produits apolaires. Il est donc juste d’utiliser un solvant très peu retenu, et donc très polaire, c’est le cas du méthanol.

En étudiant les pics obtenus pour les solutions S22 et S21**, on remarque quelques similitudes, à savoir l’apparition de produit 22 dans la solution S21**. Nous allons essayer de confirmer cette hypothèse grâce aux temps de rétention.

B.Temps de rétention


Les temps de rétention que l’on obtient sont l’image du temps nécessaire à l’élution et à la détection d’un composé dans la colonne, et sont symbolisés par un pic.

Produit

Temps de rétention Tr (minutes décimales)

18

8,37

20

8,95

21**

4,78 et 7,45

22

4,85

23

12,14

méthanol

1,84


On remarque que S21** est la seule solution à avoir 2 pics significatifs. C’est donc que la solution n’est pas pure, et qu’un autre produit est présent. On remarque alors que le premier pic a un temps de rétention très proche de celui de la solution S22 (4,78 et 4,85 minutes). On peut alors affirmer que la solution S21** contient du produit 22. Ce produit 22 s’est formé à partir de la S21 au cours du temps. Nous devons donc refaire une solution pure de S21, qui ne contiendra pas de trace de produit 22 dans sa composition.

On a alors déterminé un nouveau temps de rétention pour notre nouvelle solution S21 ; le pic est mesuré à 7,39 minutes, et on peut noter que le deuxième pic de la solution S21** était à 7,45 minutes.

Il nous faut maintenant calculer les facteurs de capacité k pour chaque produit.

C.Facteur de capacité


k = (Tr (du produit) – Tr’ (du produit non retenu))/ Tr’ (du produit non retenu)

Ici, le produit non retenu est le méthanol.

On peut donc réécrire notre formule :

k = (Tr (du produit) – Tr’ (du méthanol))/ Tr’ (du méthanol)

Solution

Facteur de capacité

Solution 18

3,55

Solution 20

3,86

Solution 21**

3,05

Solution 21

3,02

Solution 22

1,64

Solution 23

5,60


Nous obtenons de bons facteurs de capacité, compris entre 1 et 10, comme l’impose la pratique. Il y a un lien mathématique entre le Tr et le k, qui se traduit par un lien entre Temps de rétention et Facteur de capacité : plus le Temps de rétention est élevé, plus le Facteur de capacité est élevé.

La colonne étant apolaire, elle retiendra plus les produits apolaires, et donc les produits apolaires auront un Tr et un k plus élevé que les produit polaires. De plus, notre colonne mesure 15 cm et celle de la publication en fait 23, donc il est normal que les Tr soient différents entre les nôtres et ceux de la publication.

On peut alors hiérarchiser les produits selon leur ordre de sortie et donc suivant leurs temps de rétention :

  1. S22

  2. S21

  3. S21**

  4. S19

  5. S20

  6. S23

Ceci définit aussi une hiérarchie des plus polaires aux plus apolaires.

On remarque alors que S23 est la solution la plus apolaire, et donc la plus retenue dans la colonne. L’utilisation de cette solution est alors discutable. En effet, n’étant pas fondue dans la masse, on peut douter de son intégrité par rapport aux autres solutions. De plus, la détection de composé 23 n’est pas très performante, le pic de S23 étant le plus court et le plus large. Cependant, dans le cas d’un mélange inconnu ne présentant pas de composé 23, on se verrait dans l’obligation de l’utiliser.

D.Spectre d’absorption


Comme demandé au cours du TP, nous avons utilisé des cellules de 1 cm de trajet optique, et on a fait une dilution au quart plutôt qu’à moitié pour mesurer l’absorbance des produits à différentes longueurs d’onde (de 250 nm à 350 nm). Or, d’après la loi de Beer-Lambert :

A = ε x l x c

On devait donc avoir A = ε x 0,5 x 0,5 x 0,1 mais on a A = ε x 1 x 0,25 x 0,1. Or 0,5 x 0,5 = 0,25, et 0,25 x 1 = 0,25, donc on retombe sur les bons résultats.

Nous utilisons de plus des cellules en quartz, car elles sont les seules à laisser passer la lumière à 270 nm, contrairement aux cellules en verre et en plastique.

Nous avons tracé les spectres d’absorption de λ = 340 nm à λ = 250 nm, des différents produits, en utilisant la nouvelle solution S21. Nous avons alors déterminé ε à 270 nm, ce qui nous servira à corriger les surfaces des pics mesurés par la HPLC. On obtient les valeurs suivantes :

Solution

A à 270 nm

λmax (en nm)

Amax à λmax

Solution S18

1,355

274,4

1,383

Solution S20

0,733

293,5

1,328

Solution S21

0,439

301,4

1,253

Solution S22

1,095

265,2

1,139

Solution S23

0,227

270,1

0,227


Ces valeurs nous permettent alors de déterminer les ε à 270 nm et les εmax, car, d’après la loi de Beer-Lambert :

A = ε x l x c

Ici l x c = 0,025 et A = A à 270 nm ou A = Amax. Donc ε = A / 0,025 et εmax = Amax / 0,025

Donc on obtient les résultats suivants :

Solution

ε

εmax

Solution S18

54,20

55,32

Solution S20

29,32

53,12

Solution S21

17,56

50,12

Solution S22

43,80

45,56

Solution S23

9,08

9,08


On travaille avec un détecteur qui ne détecte qu’à une seule longueur d’onde. C’est un inconvénient par rapport à un détecteur à barrette de diodes, car si l’on travaille avec des produits qui n’ont pas dans leurs spectres d’absorption des parties communes, on ne pourrait pas les détecter. Heureusement pour nous, ici, ça fonctionne. De plus, notre outil ne permet pas de déterminer l’absorbance maximale ni la valeur de λ pour cette absorbance, contrairement à un détecteur à barrette de diode qui en est capable.

II.Vitesse de réaction


A partir de la solution S21**, on peut déterminer la vitesse de la réaction d’oxydation du produit 21 en produit 22. En effet, dans une réaction, on a :

A + B  C + D

La vitesse est appelée v : v = -d[A]/dt = -d[B]/dt = +d[C]/dt = +d[D]/dt

Ici, on a : 21  21 + 22

A t0 (t = 0), on n’a que du 21 (on appelle la concentration [21]0, et à t ≠ 0, on a du produit 21 ([21]) et du produit 22 ([22]). Donc la vitesse de réaction est la suivante :

v = |([21]0 – [22]) / (t – t0)|

De plus, dans la solution 21**, on calcule la proportion en produit 22 en faisant le rapport des aires des pics. On a dans cette solution 21** 15,122% de produit 22. Or la concentration de base fait 0,1 mg.mL-1. On a donc 15,122 x 0,1 / 100 = [22] = 0,0151 mg.mL-1.

De plus, la solution a été préparée le 09/02, et nous l’avons étudiée le 21/02. Il y a donc 12 jours qui se sont écoulés. On veut exprimer cette vitesse en moles par minutes, donc on remplace les 12 jours par des minutes :

12 x 24 x 60 = 17 280 secondes

On peut alors calculer la vitesse :

v = |([21]0 – [22]) / (t – t0)|= |(0,1– 0,0151) / 17 280| = 4,913.10-6 moles/minutes

III.Le mélange inconnu


Nous avons pris un mélange inconnu constitué à partir des produits dont nous avons déterminé les Tr dans les parties précédentes. Nous avons ainsi comparé les Tr du mélange et des différents produits, et nous avons mis en relation les valeurs :

Produit

Tr du produit seul

Tr du produit dans le mélange

18

8,37

8,2

20

8,95

8,87

21

7,39

7,38

22

4,85

4,73

23

12,14

Aucune correspondance

Nous pouvons ainsi conclure que le mélange inconnu est constitué des produits 18, 20, 21 et 22. Seul le 23 n’entre pas dans sa composition. Nous avons donc utilisé le produit 21 comme témoin interne, car la solution S21 est la plus pure. De plus, la concentration exacte est simple à déterminer, puisque le mélange inconnu est constitué de 4 produits, donc la concentration en S21 vaut 0,1/4 = 0,025 mg.mL-1.

A.Les concentrations


Nous devons alors corriger les aires grâce aux ε mesurés précédemment. En effet, puisqu’on connaît les aires des produits, et leurs ε, on peut établir un rapport entre les produits et le témoin :

(ε18/ε21 (témoin)) x 100 = 308,65

Donc l’aire corrigée du pic de la solution 18 vaut : 35741 x 100 / 308,65 = 11580

Celle de la solution 20 vaut : 51465 x 100 / (ε20/ε21 x 100) = 30823

Celle de la solution 22 vaut : 63055 x 100 / (ε22/ε21 x 100) = 25280

On calcule alors les concentrations en faisant les rapports des aires, en se basant sur le fait que l’aire du produit 21 équivaut à 0,025 mg/ml-1 :

Aire18 x [21] / Aire21 = [18] [18] = 11580 x 0,025 / 12645 = 0,023 mg.mL-1

On fait de même pour les autres produits : [20] = 0,061 mg.mL-1 [22] = 0,050 mg.mL-1

B.Nombre de plateaux théoriques


N = 16 (Tr / ω)2

ω est la largeur du pic à la base. Pour l’obtenir, on a mesuré la largeur du pic à sa moitié, et on a multiplié cette valeur par 2 (théorème de Thalès).

On obtient alors les valeurs suivantes :

Solution

Nombre de plateaux théoriques (N)

18

86,49

20

80,10

21

97,09

22

94,09



C.Efficacité de la colonne


Efficacité = 1 / H

H = L / N H est la hauteur équivalente à un plateau théorique

L est la longueur de la colonne en mm (ici 150 mm)

N est le nombre de plateau théoriques

Donc l’efficacité vaut N / L.

On obtient donc les valeurs suivantes :

Solution

Efficacité de la colonne (en min2.mm-3)

18

0,577

20

0,534

21

0,647

22

0,627



D.Sélectivité


Facteur de séparation = Tr1 / Tr2. On étudiera ici les sélectivités en prenant à chaque fois pour Tr2 le Tr du produit 21.

Solution

Efficacité de la colonne (en min2.mm-3)

18

1,13

20

1,21

22

0,66



E.Résolution


R = 2 [(Tr2 – Tr1) / (ω1 + ω2)]

De même, on fera toutes les résolutions en fonction du produit 21 :


Solution

Efficacité de la colonne (en min2.mm-3)

18

-0,297

20

-0,446

22

1,016



IV.Variabilité des résultats


Nous avons ensuite renouvelé une fois l’expérience sur ce même mélange inconnu. Nous avons obtenu des valeurs sensiblement différentes. La pression valait alors 113 Bars. Les variations vont par exemple de 0,15 minutes de Tr pour le produit 21 à par exemple aucune différence entre les Tr des produits 20 et 22. Les aires sont elles aussi sensiblement différentes.

Ces différences peuvent être expliquées par la marge d’erreur des machines, ou encore des variations dans l’injection, ou le moment où l’intégrateur est déclenché, ou encore une quelconque souillure, etc... Cependant, ces petites variations sont minimes, et on pourra quand même mener des études avec ces différences.

V.La Pression


Nous avons ensuite réinjecté ce mélange à des débits différents, en commençant par un débit à 0,8, puis à 0,9 et enfin à 1,1 mL.min-1. On note alors des différences de pression, regroupées dans le graphique suivant :


On observe que la pression augmente de façon linéaire avec l’augmentation du débit. C’est donc que le débit influe directement sur la pression, ce qui est normal, puisque quand le débit augmente, les molécules doivent passer plus vite dans la colonne, et donc elles sont plus poussées, et donc la pression augmente.

On remarque aussi que les Tr diminuent avec la pression, ce qui est aussi normal, puisque les produits sont plus poussés, et donc ils doivent aller plus vite dans la colonne, et ils sont donc moins retenus.

Enfin, on peut dire que la viscosité fait augmenter la pression, puisqu’une substance plus visqueuse est donc peu fluide, il faut alors la pousser plus fort pour qu’elle se déplace à une même vitesse que les autres.

VI.Questions subsidiaires

A.Le réfractomètre différentiel


Un réfractomètre différentiel est un appareil basé sur les indices de réfraction. On fait passer une solution dans le réfractomètre différentiel, de façon à étudier les son indice de réfraction, avec la possibilité d’ignorer le solvant. C’est un appareil assez similaire à ceux utilisés en HPLC, à ceci près que l’on n’étudie pas l’absorbance. Cependant, les indices de réfraction sont peu différents d’une solution à une autre, cet appareil est peu sensible.

B- Le détecteur à diffusion de lumière

Le détecteur à diffusion de lumière est un très bon appareil. En effet, on fait évaporer des produits dans une colonne, traversée par un faisceau laser. Le produit qui traverse ainsi le faisceau fait diffuser la lumière, et le détecteur interprète ces diffusions. Son grand intérêt est qu’il est quasiment universel. Cependant, ça ne fonctionne pas avec des tampons salins qui saturent la colonne, ou des produits trop volatiles, invisibles par le détecteur. Il coute environ 15 000 €.
Annexes


Solution S18


Solution S20


Solution S21**


Solution S21


Solution S22


Solution S23


Méthanol


Mélange inconnu, 1ère expérience


Mélange inconnu, 2ème expérience


Mélange inconnu à un débit de 0,8 mL.min-1

c:\aurel\cours\techniques en biologie moléculaire\numériser0010.jpg

Mélange inconnu à un débit de 0,9 mL.min-1



Mélange inconnu à un débit de 1,1 mL.min-1



Spectres d’absorption des différentes solutions

similaire:

A.«chromatographie liquide haute performance» iconChromatographie d’échange ionique

A.«chromatographie liquide haute performance» iconPurification de la lectine concanavaline a par chromatographie d’affinité

A.«chromatographie liquide haute performance» iconPurification de la Concanavaline a de la farine de la fève Jack par chromatographie d’affinité

A.«chromatographie liquide haute performance» iconSolutions de haute-disponibilité, pra et Datacenter

A.«chromatographie liquide haute performance» icon2. Ouvrir la haute fonction publique aux docteurs

A.«chromatographie liquide haute performance» iconPerformance de dessin et danse à Bourges

A.«chromatographie liquide haute performance» iconI. les éléments qui altèrent la performance

A.«chromatographie liquide haute performance» iconAdresse : 32 route de la Haute Corniche, 29280 plouzane
«Le tour du monde» (samedi soir) : 10 € au restaurant «Le Chenal» (dimanche midi): 15 €

A.«chromatographie liquide haute performance» iconRecherche Une université visant une haute qualité scientifique, reconnue au niveau international

A.«chromatographie liquide haute performance» iconCœur : homme et différences entre groupes d’animaux
...








Tous droits réservés. Copyright © 2016
contacts
b.21-bal.com