La cellule : organisation generale et diversite cellulaire








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Acquisition du manteau

Une fois que ces protéines G sont fixé dans la membrane elles vont servir de récepteurs de ligands pour s’associé aux protéines qui vont constituer le futur manteau de la vésicule. Ce manteau vésiculaire est un complexe moléculaire pré-assemblé dans le cytosol (Caotomère). Ces protéines de manteau pré-assemblé vont reconnaitre les protéines G de la membrane et vont venir s’y fixer. Les protéines de manteau vont interagir avec des protéines transmembranaires qui sont des récepteurs qui vont servir à recruter à l’intérieur de la future vésicule les protéines qui vont être exporté du compartiment donneur. Simultanément, les protéines de manteau vont s’assembler ensemble et se polymériser et acquérir une forme en coquille, cela aura pour conséquence de tirer la membrane et impose une courbure à la membrane. Les protéines à exporter vont se concentrer localement et donc va favoriser l’interaction et donc la sélection et le trie moléculaire des protéines à exporter.
Fission

Etape contrôle par d’autre type de protéines comme par exemple la « Dynamine », qui est une protéine G elle est capable de lié du GTP. Cette protéine va être capable de former un anneau spiralé à la base du bourgeon et elle va provoquer la fission et le détachement de la vésicule par rapport au compartiment initiale. La Dynamine est visible en MET. Après la fission on retrouve le transporteur membranaire qui est intégralement recouvert de son manteau.
Perte du manteau

Au niveau du compartiment accepteur

La protéine GAP (GTPase Activating Protein) vient toujours s’associé à la protéine G. Elle est capable de stimuler l’activité GTPase de la protéine G. En effet la plupart des protéines G est capable d’hydrolysé le GDP en GTP mais cette hydrolyse est souvent très lente et a besoin d’être stimulé. La protéine GAP s’associe a la protéine G favorise l’activité hydrolyse. La protéine G va retrouver sa conformation initiale, la queue lipidique ancrée dans la membrane va rétracter dans la protéine et l’ensemble du manteau vésiculaire va pourvoir se dépolymériser et retourner à l’état soluble pour pouvoir être réutiliser pour une nouvelle étape de trafic. Remarque : Il ne faut pas que l’hydrolyse du GTP ne soit trop précoce sinon le manteau va se détacher, elle doit se produire tardivement mais néanmoins que cette hydrolyse ce produise, tout cela grâce à la protéine GAP qui va contrôler positivement au moment venu.
Attachement

La vésicule est maintenant nue, elle est débarrassée de son manteau. Au voisinage de la membrane cible la vésicule doit être reconnu par un système de récepteur. L’accostage ou l’attachement va mettre en jeu des interactions protéine-protéine entre la vésicule et le compartiment accepteur qui va permettre d’immobiliser la vésicule. Cette immobilisation va permettre de mettre en jeu la deuxième étape qui consiste à faire entrer en interaction les protéines qui vont assurer la fusion : V-SNARE (Vesicule SNARE) et T-SNARE (Target SNARE). Une V-SNARE interagit avec 3 T-SNARE. Cette interaction est possible à très courte distance. Lorsque les SNAREs sont face à face elles vont permettre la fusion en établissant un canal central qui va former de façon transitoire une continuité entre la membrane vésiculaire et la membrane accepteur. C’est au niveau de ce canal central que les phospholipides des 2 membranes vont être suffisamment approchés. Le contenu de la vésicule qui a été prélever au niveau de la citerne du compartiment donneur va pourvoir être diffuser dans la lumière du compartiment accepteur. La cellule est donc capable de transporter du matériel, des protéines et les différents éléments contenus dans la vésicule.
Recyclage des SNARE

Une fois que la fusion est effectuer ont se retrouve dans la membrane du compartiment accepteur avec des complexes qui vont associer V-SNARE T-SNARE. Ces complexes ne sont pas réutilisable tels quel, l faut d’abord les dissocier et renvoyer les protéines SNARE au compartiment donneur par un trafic rétrograde et récupérer les SNAREs pour une nouvelle étape de fusion. Il existe un dispositif spécifique qui va permettre de provoquer la dissociation des SNAREs. Ce dispositif est constitué de 2 protéines : la protéine NSF qui joue un rôle de co-facteur et la protéine SNAP qui assure la dissociation. La protéine SNAP est une enzyme qui va exerce une activité ATPase, elle utilise l’énergie fournie par l’hydrolyse de l’ATP pour dissociation les complexes. Donc lorsque l’ATP est hydrolysée en ADP + P la dissociation s’opère et le complexe NSF-SNAP-SNARE est rompu. NSF et SNAP pourront être réutilisé pour une nouvelle dissociation. Donc au niveau du compartiment accepteur il est possible de récupérer la V-SNARE initiale pour la renvoyer au niveau du compartiment donneur.
Spécificité d’une étape de trafic

Protéine G

On peut se demander comment une étape de trafic entre le RE et Golgi ne se mélange pas avec une étape entre par exemple l’endosome et le lysosome puisque tous les compartiments émettent des vésicules dans ton les sens, comment la cellule fait elle pour s’y retrouver ? En effet, la cellule possède une panoplie de protéines différentes. Néanmoins cette panoplie est limitée : On retrouve essentiellement 7 protéines G qui entre en jeu. Ces petites protéines G appartiennent à la famille ARF et numérotées de 1 à 6 et la 7ème protéine est Sar1P. En revanche Il n’y pas suffisamment de protéines ARF différente pour couvrir l’intégralité des étapes de trafic existante dans une cellule, on retrouvera donc la même ARF dans plusieurs étapes. C’est le cas de ARF1, on la retrouve à l’intérieur du trafic intragolgien, dans le trafic rétrograde du Golgi vers le RE, dans l’étape du trafic du Golgi vers l’endosome. ARF6 est retrouvé majoritairement dans la formation de vésicules d’endocytose à partir de la membrane plasmique vers l’endosome précoce. La seul exception est Sar1P, la seul protéine G attaché à une étape de trafic celle du RE vers le Cis Golgi.
Protéines de manteau

Dans la mesure que l’on retrouve une répartition différente des protéines G selon les étapes de trafic, on va avoir aussi une répartition différente des protéines de manteaux. Les existe 3 grandes familles de protéines de manteau. Les protéines qui appartiennent à la famille COP : 2 grands complexes COP I et COP II qu’ont retrouve un peu partout dans Golgi. COP I fait fonctionner certaines étapes de trafic antérograde et rétrograde ainsi que des étapes vers la membrane plasmique et certaines étapes de trafic de l’endosome précoce vers l’endosome tardif. COP II suit l’exemple de Sar1p c'est-à-dire qu’il est très spécifique d’une étape de transport, vésicule du RE vers Cis Golgi. Il existe une 3ème catégorie de protéines de manteau : la Clathrine qui assure l’emballage des vésicules d’endocytose et la formation de certains types de vésicules issues du TGN. Il existe des différences structurales entre les manteaux.
V et T SNARE

La cellule possède également un répertoire relativement limité de SNAREs. Il existe des combinaisons de SNARE qui fonctionne entre elle et d’autre pas. Un même compartiment donneur est capable de fabriquer des vésicules en tous points semblables du point de vue des protéines de manteau qu’on va retrouver identique mais en embarquant des protéines V-SNARE différentes qui sont destiné à 2 compartiments accepteurs différents. La fusion est possible car il y a bonne affinité entre les V-SNARE et T-SNARE correspondante. Finalement il existe un vingtaine de protéines SNARE différentes. Donc la cellule avec un répertoire de protéines relativement limité est capable en combinant différemment les molécules entre elles de faire fonctionner une grande diversité d’étapes de trafic. Les vésicules générées par le compartiment donneur sont reconnu de façon spécifique par le compartiment accepteur.
Régulation par les GTPases Rab du trafic vésiculaire

Les régulateurs du trafic vésiculaire appartiennent à une famille de protéine G : les protéines de la famille RAB. Ils contrôlent le trafic vésiculaire en se liant à la vésicule en cours de formation et qui va se détacher au cours de la fusion. Les protéines RAB en tant que protéine suivent les mêmes règles au niveau du changement de conformation par ATP/ADP. On retrouve en plus par rapport à la majorité des autres protéines G, 2 protéines partenaire : GDI (GDP Dissociation Inhibitor) qui s’associe spécifiquement à la protéine RAB pour la maintenir inactif, c’est sous cette forme qu’une protéine RAB va entrer en cycle de la régulation d’une étape de trafic. La prochaine étape consiste à l’activation de la protéine RAB donc à échanger une molécule de GDP par une molécule de GTP, cet échange est catalysé par une protéine GEF spécifique à la protéine RAB. Dans la mesure où l’interaction entre la GDI et la protéine RAB est relativement forte pour être maintenant initialement à l’état inactif, cette interaction ne va pas se dissocier spontanément, et il y aura donc la participation d’une autre protéine partenaire : GDF (GDI Dissociation Factor) qui va favoriser la dissociation RAB-GDI. L’échange nucléotidique peut avoir lieu et la protéine RAB va se retrouver accrochée à la membrane vésiculaire sous sa forme active lié au GTP. La protéine RAB va exercer des rôles régulateurs qui peuvent être multiple à différemment moment du cycle du trafic. Les premiers rôles régulateurs auxquels peut participé la protéine RAB est de réguler l’interaction des vésicules avec des moteurs vésiculaires qui vont prendre en charge la vésicule pour l’attacher aux éléments du cytosquelette et la vectorisé afin de la conduire vers le compartiment accepteur. Certaines protéines RAB sont connues aussi dans la régulation de la fusion. Elle peut contrôler l’interaction entre les protéines associées à la vésicule et les protéines membranaires avec lesquelles elles doivent entrer en interaction. Donc la protéine RAB peut réguler la formation des ces complexes protéiques d’accostage mais aussi réguler l’interaction entre V-SNARE et T-SNARE à l’aide d’une protéine partenaire qu’on appelle un effecteur de RAB (RAB effector). Finalement, 3 niveaux d’interventions possibles des protéines RAB : Interaction avec les moteurs moléculaire, contrôle et régulation des interactions d’accostages et contrôle et régulation des interactions entre SNAREs. A la fin du cycle les protéines RAB vont être désactivées et on retrouvera l’action hydrolytique de la protéine G, GTP en GDP à l’aide de la participation d’une protéine GAP qui est un activateur de GTPase spécifique de la protéine RAB. Dans la mesure elle où se retrouve à nouveau sous forme GDP elle va se réassocié tout de suite avec la protéine GDI.


Diversité de la protéine RAB

Contrairement aux autres protéines de la machinerie de trafic vésiculaire, il existe un large répertoire de protéines RAB. Il y a une protéine RAB qui intervient pour chaque étape de trafic, soit 37 protéines RAB différentes.
TRAFIC ENTRE RE ET GOLGI
Le trafic du RE vers l’appareil de Golgi part tout d’abord du réticulum endoplasmique rugueux qui présente des citernes plus ou moins aplatie et recouvert de ribosomes. On note chez le RER la présence de petites régions lisse qui sont les endroits uniques et privilégiés où le RE fabrique les vésicules destinées à partir vers l’appareil de Golgi. On appel ces régions des éléments de transition (TE = Transition Element) ou site d’exportation des protéines du RE. L’appareil de Golgi est très compact et est situé à proximité du noyau et le RE est présent un peu partout dans la cellule. Dans la mesure où les citernes du RE est situé à proximité immédiate de l’appareil de Golgi, les vésicules qui vont être fabriqué au niveau de ces éléments de transition vont sans difficulté atteindre Cis Golgi par une simple diffusion. En revanche il existe des citernes de RE situées beaucoup plus loin du Golgi, c’est ici que la vectorisation et l’intervention des moteurs moléculaires et le déplacement le long du cytosquelette prend son sens.
Une cellule qui exprime une protéine virale GFP est fusionnée avec une protéine fluorescente naturelle. La Glycoprotéine virale traduit au niveau du RE, mais comme elle est porteuse d’une mutation c'est une protéine assez sensible à des conditions d’environnement et va avoir des difficultés dans l’acquisition de conformation 3D correct dans certaine condition de température élevé. La protéine virale ne va pas être instantanément dégradée et le RE va se chargé de protéine fluorescente. Ensuite on repasse la cellule à une température inférieure ou égale à 37°C. La glycoprotéine va pouvoir finir d’acquérir correctement sa conformation grâce au système de contrôle de qualité du RE. Une fois cette conformation acquise elle va quitter le RE et va être destiné à la membrane plasmique, elle va donc être emballé dans des vésicules au niveau des éléments de transition. On retrouve un peu partout dans la cellule et dans le cytoplasme des régions qui présente une certaine intensité de fluorescence et qui correspondent aux éléments de transitions et aux vésicules qui sont fabriqué. On voir que rapidement les vésicules en provenance du RE vont être vectorisé vers l’appareil de Golgi.
Transport d’une vague synchrone de protéine GFP

On peut visualiser le cheminement de la glycoprotéine à travers l’ensemble de la voie de sécrétion. A T0 la fluorescence est repartie dans tout le RE mais n’est pas concentré au niveau des éléments de transitions. Au bout d’une quarantaine de minute la quasi totalité de la fluorescence va se cumuler dans l’appareil Golgi. 2h plus tard, la fluorescence va quitter l’appareil de Golgi et va se retrouver à nouveau distribuer dans l’ensemble cellule. Ceci témoigne de l’insertion de la protéine fluorescente au niveau de la membrane plasmique de la cellule. De cette manière, si on mesure les différentes intensités de fluorescence nous sommes capables de suivre au cours du temps les déplacements des protéines. On visualise la disparition de la fluorescence du RE, le passage transitoire dans l’appareil de Golgi et un passage transitoire au niveau de la membrane plasmique qui va atteindre un pic puis à nouveau d’une décroissance qui témoigne du fait que les molécules ne vont résider qu’un temps limiter au niveau de la membrane plasmique, et qui sont ensuite internalisée par endocytose et dégradée. Nous sommes donc capables de suivre différentes étapes du cycle intracellulaire et éventuellement de quantifier les constantes de vitesse de passage d’un compartiment à l’autre.
LE TRAFIC POST GOLGIEN
La compartimentation des très fine des enzymes de la glycosylation dans les différentes citernes de l’appareil de Golgi. Cette compartimentation est assurée par les différences de compositions lipidiques. Il existe au niveau de l’appareil de Golgi un équipement enzymatique permettant à la cellule de synthétiser des phospholipides modifiés, plus complexe que ceux fabriqué au niveau du RE. La cellule va notamment fabriquer des glycolipides (lipide couplé à des oligosaccharides) qui présente une caractéristique remarquable, ils ont une tendance spontanée de s’associer les uns les autres latéralement pour finir constituer une structure rigides, plus rigide que la moyenne des phospholipides membranaire. Ces structures rigides vont flotter dans la structure de la membrane, on parle de « radeaux lipidiques ». Ces radeaux ne sont pas que constitué de glycolipide, on retrouve aussi dans ces radeaux lipidiques une concentration beaucoup plus importante de cholestérol au niveau membranaire. Ces radeaux lipidiques vont se comporter comme des dispositifs de trie moléculaire. Dans la membrane de l’appareil de Golgi il existe 2 grandes classes protéines transmembranaires qui diffèrent par la longueur de leur domaine transmembranaire : des protéines à domaine transmembranaire court et long. Les radeaux lipidiques contenant ces glycolipides et le cholestérol n’ont pas la même épaisseur de membrane que le reste des bicouches phospholipidique. Une protéine à domaine transmembranaire court aura beaucoup de mal à se retrouver insérer dans une région de membrane épaisse, donc spontanément ces protéines à domaines transmembranaire court vont être exclu de ces radeaux lipidiques contrairement aux protéines à transmembranaire long qui ont tendance à s’associer spontanément avec les radeaux lipidiques : C’est le 1er mécanisme de tri moléculaire des protéines au niveau membranaire. Deuxième mécanisme, les protéines associées aux membranes par l’intermédiaire d’ancre GPI vont avoir tendance à se retrouver associé aux radeaux lipidiques qu’aux restes de la structure membranaire. Donc dans les radeaux lipidiques, nous retrouvons des protéines à domaine transmembranaire long et des protéines à ancre GPI. Ce système de radeau lipidique fabriqué n’existant pas dans le RE mais qui résulte de biosynthèse au niveau de l’appareil de Golgi constitué en soi un système de tri moléculaire qui permet de ségrégé des protéines telles que les protéines résidentes. Finalement les mécanismes de rétention de protéines résidentes diffèrent entre ceux du RE où c’est la séquence KDEL C-Term et ceux de l’appareil de Golgi où le choix de protéine à retenir dépend de la longueur du domaine transmembranaire.
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