Hôpital Necker-Enfants Malades pcr pneumocystis jirovecii en temps réel par technologie Taqman








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Hôpital

Necker-Enfants Malades



PCR Pneumocystis jirovecii

en temps réel

par technologie Taqman


Référence : BIOL MOP 07

BM
Version : 1

Date d’application :

Page : /







Rédacteurs principaux : Isabelle Leymarie et Isabelle Marques, techniciennes de laboratoire, service de bactériologie
Co-rédacteur du projet : Gilles Quesne
Groupe de relecture :techniciens bacterio


Date : 13/05/08

Visa du rédacteur principal

Validation :Marie Elisabeth Bougnoux , MCU/PH



Dates et visas :

Approbation :
Date :

Visa :

Diffusion :



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Modification :


Date :

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Mots-clés : Pneumocystose, Pneumocystis jirovecii, prélèvements respiratoires, PCR en temps réel, technologie Taqman.





Domaine d’activité concerné

Type de document

ADMI

Administration

AIM

Aide-mémoire

BIOL

Biologie

FIT

Fiche technique

COMM

Communication

FOR

Formulaire

DOUL

Douleur

MOP

Mode opératoire

DDMA

Droit des malades

NOS

Note de service

FINA

Finances/achats

PRO

Procedure

FORM

Formation

PRT

Protocole

GDRH

Gestion des ressources humaines

REG

Règlement

GDRI

Gestion des risques – Plans urgence

TER

Texte réglementaire

HYGI

Hygiène

TER

Texte réglementaire

IMAG

Imagerie







INFO

Informatique







LOGI

Logistique/Hôtellerie






PHAR

Pharmacie






QUAL

Qualité






RELS

Relations sociales






SECU

Sécurité







TECH

Services techniques







SOIN

Soins







VIGI

Vigilance







1. Objet

Cette technique de biologie moléculaire permet la détection spécifique du gène codant pour la grande sous unité mitochondriale mt LSU rRNA , du champignon Pneumocystis jirovecii ; agent de la pneumocystose, dans des prélèvements respiratoires.



2. Mots-clés

Pneumocystose, Pneumocystis jirovecii, prélèvements respiratoires, PCR en temps réel, technologie Taqman.
3. Domaine d’application – Personnes concernées

Ce mode opératoire de biologie moléculaire est applicable par les techniciens de laboratoire de bactériologie ayant été formés auparavant.
4. DéfinitionS

Pneumocystose : Infection pulmonaire fongique due à un champignon appelé Pneumocystis jirovecii (anciennement Pneumocystis carinii), présent dans l'air ambiant, très rare il y a une vingtaine d'années et qui a connu une résurgence avec l'apparition du SIDA et l'intensification des traitements immunosuppresseurs dans les maladies inflammatoires et les greffes d'organes.

Extraction : Méthode permettant d’obtenir de l’ADN à partir de prélèvements respiratoires. Cette technique peut être réalisée sur un automate comme le Magnapure®.

Mix : Mélange réactionnel comprenant les amorces, les dntp, la polymérase, la sonde, l’UNG et l’eau.

UNG : Uracil-DNA Glycosylase. Il consiste à générer des produits d'amplification dans lesquels l'Uracile remplace la Thymine. De ce fait, tout produit de PCR potentiellement contaminant peut, à la différence de l'ADN naturel, être détruit par l'Uracil-N-Glycosylase (UNG) qui est incorporée dans le mélange réactionnel d'amplification. Les produits d'amplification contaminants deviennent donc non amplifiables, à la différence de l'ADN naturel. L'UNG procède à un véritable nettoyage - décontamination en amont de l'amplification et, comme elle est thermolabile, son inactivation lors du premier cycle de température à 95°C, permet à l'ADN nouvellement amplifié de rester intact.

Dntp : Appellation courante de l'un des quatre désoxyribonucléotides : dATP (désoxy-adénine tri-phosphate), dCTP (désoxy-cytosine tri-phosphate), dGTP (désoxy-guanine tri-phosphate), dTTP (désoxy-thymine tri-phosphate). Il est utilisé au cours d'une PCR (amplification d'ADN) en tant que co-facteur.

PCR en temps réel : Polymérisation en chaîne basée sur une réaction enzymatique avec mesure en continu du produit d’amplification. La PCR se réalise avec des amorces et une sonde spécifique de la région génique à amplifier.

Technologie Taqman : Cette technologie permet la mesure des produits PCR grâce à une sonde fluorescente.

5. Description 

5.1 PRINCIPE
Cette technique comporte plusieurs étapes :

- Extraction de l’ADN total d’un prélèvement respiratoire

- Amplification d’une séquence répétée spécifique de P. jirovecii, observation des produits PCR par la mesure de l’apparition de la fluorescence au cours du temps.

5.2 LES ECHANTILLONS
Les échantillons adressés au laboratoire pour une recherche d’ADN de P. jirovecii par PCR sont en général des prélèvements respiratoires :

- Expectorations

- LBA

- Aspirations naso-pharyngées 

- Aspirations trachéales
En semaine après 18h30 et le week-end (le samedi à partir de 16 h et le dimanche), ces échantillons sont conservés au réfrigérateur à +4°C.

Une fois parvenus au laboratoire, ils sont enregistrés et étiquetés. Ensuite ils sont conservés au congélateur à -20°C Pièce BM (342A) en attendant d’être utilisés pour l’extraction.
5.3 SONDES ET AMORCES UTILISEES
Cible : fragment de 81 paires de bases du gène codant pour une séquence répétée spécifique de P. jirovecii: grande sous unité mitochondriale mt LSU rRNA
Amorces : jirF 5’- CTT AAA ATA AAT AAT Cag ACT Atg TgC gAT AAg -3’

jirR 5’ ggA gCT TTA ATT ACT gTT CTg ggC -3’
Sondes : jirT 5’-FAM- TAg ATA gTC gAA Agg gAA AC -MGB-3’

jirT2 5’- FAM- TTTCCCTTTCGACTATCT -MGB -3’

Recherche d'inhibiteurs de PCR :

Le phage lambda est un virus bactériophage qui infecte la bactérie Escherichia coli. Il est largement utilisé comme vecteur de clonage de l'ADN.

Dans cette technique nous l’utilisons comme contrôle interne en réalisant une PCR de ce phage en duplex avec celle de la PCR P. jirovecii pour tester la présence d’éventuels inhibiteurs.
Amorces : Lambda F 5’-TTG TGG CTT GGC TCT GCT AAC-3’

Lambda R 5’-AAT CAT TCA ACA CCC GCA CTA TC-3’

Sonde : Lambda T VIC 5’- ACC AGC CAG CCG CA-3’ MGB

5.4 PRECAUTIONS A RESPECTER POUR TOUTE TECHNIQUE DE PCR
Toute PCR doit respecter des règles strictes de propreté et d’organisation.

Pour chaque étape, il est nécessaire de porter des gants (Flexam® Nitrile CardinalHealth) et une blouse propre (changée tous les jours).

Pour éviter d'éventuelles contaminations, il est nécessaire de réaliser l’extraction de l’ADN, la préparation du mélange réactionnel et l’amplification dans 4 pièces différentes :

- P2 : préparation et distribution des Mix.

- Pièce de pré extraction (333A) : prélyse des prélèvements avant l’extraction.

- Pièce d’extraction (338A) : distribution des extraits d’ADN.

- Pièce BM (342A) : dépôt de l’ADN du témoin positif.

Ces étapes se déroulent de préférence le matin, par une personne n'ayant pas transité par le laboratoire de Sérologie (présence de produits PCR BK), la pièce contaminée (nettoyage de produits PCR) ou la pièce du séquenceur (bâtiment Kirmisson)
5.5 EXTRACTION : cf. fiche technique extraction
Les extractions sont réalisées deux fois par semaine, et en général un jour différent de celui de la réalisation de la PCR.

Pour tout le matériel, les réactifs et le fonctionnement de chaque pièce, se référer aux fiches correspondantes.


5.6 PCR
5.6.1 Cahier de paillasse
Avant de réaliser la PCR, il faut sortir le cahier de paillasse correspondant, afin de pouvoir y reporter les résultats.

Dans GLIM'S, cliquer sur démarrer, bactériologie, BM myco/parasito, techniciens, BM_Pneumocystis.

Fenêtre « modèle liste de travail-options d’interrogation » cliquer sur OK.

Fenêtre « génération de liste de travail » cocher édition puis OK.

Fenêtre « impression de liste de travail » vérifier imprimante M_CR_inck0617, cliquer sur OK.

Fenêtre « information » cliquer sur OK.

Grâce à ce cahier, on peut établir le plan de plaque à suivre.
5.6.2 Allumer l'automate de PCR
ABI Prism 7300 (pièce 359 A) et l’ordinateur situé à côté avant de débuter la préparation de la PCR.
5.6.3 Préparation du Mix :
Techniquer dans la pièce de préparation des Mix (P2) (cf. fiche "FONCTIONNEMENT MATERIEL ET REACTIFS P2) :

- sous hotte (au fond à gauche).

- gants propres (pas de blouse, mais avec une surblouse).

Calculer les volumes de chaque réactif en fonction du nombre de tests (prévoir 1 puits par échantillon) et des témoins négatifs et positifs. Prévoir 1 témoin négatif et 1 témoin positif par réaction PCR. Il faut toujours compter un volume en plus (volume mort) afin d’avoir assez de mix (problèmes de pipetage de faibles volumes).


 

1

 

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

Conc. finale

Master Mix Applied

25

µl

125

150

175

200

225

250

275

300

325

350

375

400

425

450

475

500

525

550

575

600

625

1X

H2O

5

µl

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

115

120

125




Amorce cible F (10 µM)

1,5

µl

7,5

9

10,5

12

13,5

15

16,5

18

19,5

21

22,5

24

25,5

27

28,5

30

31,5

33

34,5

36

37,5

0,3 µM

Amorce cible R (10 µM)

1,5

µl

7,5

9

10,5

12

13,5

15

16,5

18

19,5

21

22,5

24

25,5

27

28,5

30

31,5

33

34,5

36

37,5

0,3 µM

Sonde cible T (5 µM)

2

µl

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

36

38

40

42

44

46

48

50

0,2 µM

Amorce Lambda F (5 µM)

1,5

µl

7,5

9

10,5

12

13,5

15

16,5

18

19,5

21

22,5

24

25,5

27

28,5

30

31,5

33

34,5

36

37,5

0,15 µM

Amorce Lambda R (5 µM)

1,5

µl

7,5

9

10,5

12

13,5

15

16,5

18

19,5

21

22,5

24

25,5

27

28,5

30

31,5

33

34,5

36

37,5

0,15 µM

Sonde Lambda T (5 µM)

2

µl

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

36

38

40

42

44

46

48

50

0,2 µM




Volume final :

40

µl

ADN

10

µl


Le Master mix Applied se trouve dans le réfrigérateur. Il contient :

- AmpliTaq gold DNA polymériser

- UNG

- dntp dont dutp
Les Amorces (jirF, jirR, lambda F et lambda R) et les sondes jirT ou jirT2 et lambda T eurogentec

se trouvent dans le congélateur, tiroir du haut, boite amorces et sondes multiplexe phage lambda/routine.
La réserve des sondes et amorces se trouve dans la boîte réserve amorces+sondes Taqman routine.
H2OD stérile : dans le placard blanc.
! A chaque nouveau lot d'amorces et de sonde, vérifier leur concentration molaire pour déterminer le volume utilisé pour le mélange réactionnel.

Pour pouvoir diluer les sondes et amorces (solutions mères) à la bonne concentration, consulter le classeur sondes et amorces bactério.
Procédure de constitution du mix :

- Dans un microtube 2 mL, déposer l'H2OD puis le Master Mix après homogénéisation modérée.

- Déposer ensuite les petits volumes (amorces et sonde). Vortexer avant et après.
5.6.4 Distribution du mix dans la plaque Taqman (placard blanc) :
Distribuer 40 µl du Mix P. jirovecii + inhibiteur dans chaque puits de tests et de témoins.

Fermer avec des caps (placard blanc) sans boucher entièrement les puits afin de protéger la plaque et de pouvoir l’ouvrir pour distribuer les ADN.


5.6.5 Distribution des extraits d'ADN et du témoin négatif : pièce d'extraction (338A) 
Première paillasse à gauche.

- gants propres

- feuille de paillasse

Le volume final doit être de 50 µl

Distribuer :

10 µL de chaque ADN des échantillons

10 µL du témoin négatif = H2OD + phage (extrait dans les mêmes conditions que les prélèvements au Magnapure : cf fiche technique extraction).

Fermer complètement les puits avec les caps.
5.6.6 Distribution du témoin positif : pièce BM (342A) .
Gants propres.

Le témoin positif correspond à un extrait d’ADN de P. jirovecii.

Déposer 10 µL dans le puits correspondant, puis fermer complètement les puits avec les caps.
5.6.7 Lancer la PCR sur l’automate ABI Prism 7300
Placer la plaque test dans son support (puits 1A en haut à gauche) en appuyant sur le tiroir pour l’ouvrir.
Sur l’ordinateur, lancer la plaque :

- Double-cliquer sur 7300 software.

- Cliquer sur Create New document puis sur next.

- Choisir la fluorescence des sondes taqman utilisées en cliquant dessus : FAM Mgb pour P. jirovecii et VIC Mgb pour le phage lambda. Cliquer sur Add pour ajouter à la liste des fluorofores qui se trouve à droite.

- Cliquer sur next.

- Sur le plan de plaque sélectionner les puits testés et leur attribuer la chimie correspondante en les cochant (ici les 2).

- Cliquer sur finish

- Dans l’onglet set up : on peut donner un nom à chaque puits en cliquant dessus.

- Dans l’onglet instrument : vérifier les conditions d’amplification et le volume total de la PCR (ici 50 µL).
Conditions d’amplification :

Etape 1 :

2 minutes à 50°C

Pour permettre à l’Uracyl-N-glycosylase (UNG) de détruire d’éventuels produits de post-amplification contaminant le mélange réactionnel.

Etape 2 :

10 minutes de dénaturation à 95°C.

Pour activer la Taq polymérase.

Etape 3 :

45 cycles d’amplification : 15 secondes de dénaturation à 95°C

1 minute d'hybridation et d'élongation à 60°C.
L’appareil met par défaut 40 cycles : il faut donc lui indiquer 45 cycles.
Avant de lancer la PCR il faut créer un fichier pour l’enregistrer.

Cliquer sur File puis save as local disk D, puis « Bacterio », et donner un nom à la plaque.

Les données y seront enregistrées automatiquement à la fin de la PCR.

Cliquer sur START et l’appareil se met en route pour environ 2h (1 RUN).
5.7 Récupération des résultats
Une fois le RUN terminé, le message « Run sucessfull » s’affiche. Cliquer sur OK.

Cliquer sur la flèche verte pour que les données soient traitées.

Dans l’onglet « results » regarder les courbes d’amplification dans « amplification plot ».

Cliquer sur les puits correspondants pour les observer. Cela permet aussi de vérifier la présence ou non d’inhibiteurs grâce aux courbes du phage lambda.

Toute modification de baseline ou autres doit être enregistrée en cliquant sur la disquette du menu :

Remarque : l’onglet « component » permet d’observer la fluorescence de chaque composant des sondes et la fluorescence de base (ROX).

5.8 Impression des résultats
Pour pouvoir imprimer, il faut se placer dans l’onglet report. C’est un tableau récapitulant les CT par rapport aux différents fluorofores et aux puits correspondants.

Pour paramétrer l’impression cliquer sur « Report settings » (icône tableau + crayon).

Report orientation : cocher "portrait".

Amplification Plot : cocher "Landscape".

Décocher : "Raw spectra", "Dissociation", "Standard curve".

Dans “Additional Data to print in the report” décocher : "document comments", "Analysis methods", Thermal profile, Standard curve et detector set up.

Puis cliquer sur OK.

Pour imprimer cliquer sur file puis print puis OK.
5.9 Interprétation des résultats
Il faut d’abord regarder les témoins

Si nous n’observons pas de phage pour le témoin négatif la technique n’est pas validée. Sachant que le témoin positif ne possède pas le phage nous n’observons que la fluorescence de la sonde spécifique à P. jirovecii. Il faut observer une courbe exponentielle avec un CT aux alentours de 20 pour qu’il soit validé.

Une fois les témoins validés, il faut regarder si il y a des inhibiteurs ou pas, grâce au CT du phage lambda pour chaque échantillon.

Il faut que la courbe soit exponentielle et qu’elle soit présente pour chaque échantillon. Si ce n’est pas le cas, il y a présence d’inhibiteur et il faut donc réextraire le prélèvement (ou le diluer)  à voir avec le biologiste).

Les échantillons où il n’y a que la courbe du phage et pas celle de P. jirovecii sont négatifs.

Les échantillons où il y a les deux courbes sont positifs.
5.10 Rendu des résultats
5.10.1 Cahier de paillasse :

Les résultats obtenus sont reportés sur le cahier de paillasse en face de chaque nom avec le CT pour ceux qui sont positifs, ainsi que la présence éventuelle d’inhibiteurs.

Le CT du témoin positif est reporté dans un tableau (situé au début du classeur Taqman) pour permettre un suivi et éviter les dérives du témoins.
5.10.2 GLIMS :

Cliquer sur démarrer, bactériologie, BM Myco/parasito, techniciens, BM_Pneumocystis.

Fenêtre « modèle liste de travail-options d’interrogation » cliquer sur OK.

Fenêtre « génération de liste de travail » cliquer sur OK (modifier est déjà coché).

La liste de travail apparaît sur l’écran. Dans la case correspondant au patient, appuyer sur les touches Ctrl et F (en même temps) et choisir le résultat correspondant en double-cliquant.

Le résultat se confirme automatiquement (bleu) et passe en validation pour le biologiste.

Le cahier de paillasse une fois validé est rangé dans le classeur TAQMAN et y est conservé pendant environ 1 mois, puis stocké dans des archives.
5.11 Validation des résultats 
Le biologiste responsable valide les résultats en même temps que les autres examens de biologie moléculaire :

Cliquer sur démarrer, bactériologie, BM myco/parasito, biologistes, validation BM MYCO
Caractéristiques de la technique

Reproductibilité : bonne.

Spécificité : P. jirovecii.
6. Responsabilités

Marie Elisabeth Bougnoux et Gilles Quesne.




Qualité / Gestion des Risques / Évaluation – Version du 6 mai 2008

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