Plan matériel biologique pour l’analyse Nature Contraintes de prélèvement Méthodes préparatives et/ou séparatives








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date de publication17.11.2016
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PLAN




Matériel biologique pour l’analyse


Nature

Contraintes de prélèvement

Méthodes préparatives et/ou séparatives


(tissus, cellules, molécules)

Dissociation cellulaire – broyage

Culture cellulaire


Tri cellulaire

Déprotéinisation

Dialyse – filtration – ultrafiltration

Centrifugation – ultracentrifugation

Chromatographie

Electrophorèse

Méthodes analytiques


Photométrie

Enzymologie

Immunochimie

Radioanalyse

Technologie de l’ADN recombinant

Microscopie

Spectroscopie RMN

Etablissement de valeurs de référence



Domaines de la Biologie Clinique
ANALYSES DE BASE

Urgentes, souvent de caractère vital

Nombre limité (20 à 30)

Part importante de l'activité des laboratoires au plan économique

8 analyses biochimiques essentielles représentent 1/3 des analyses remboursées (lipides, NF, glycémie, urée, créatinine, VS, bilan électrolytique, coagulation (temps de Quick), transaminases, acide urique et microbiologie de base)
ANALYSES SPECIALISEES

Grande valeur informative, rarement vitales

Nombre >1000 mais demande faible

Domaine privilégié de l'innovation
ANALYSES NON VALIDEES

Transfert technologique non fait ou analyse abandonnée

Résultat de l'échange d'informations entre scientifiques, industriels, cliniciens, biologistes

Témoins de la vitalité de la recherche en biologie clinique

Evolutions Methodologiques
Disparition presque totale des techniques chimiques au profit des techniques enzymatiques pour les paramètres courants  automatisation complète et performante
Explosion des techniques immunologiques au dépend des techniques de radioanalyse  automatisation
Explosion des techniques de biologie moléculaire  simplification des techniques et formation des personnels des laboratoires privés
Développement des analyses délocalisées (méditests, autotests, tests rapides d'orientation clinique TROC) utilisant chimie sèche, automates portables, immunotests simples
Diversification des procédures de séparation et analyses de mélanges complexes
Les composants de la qualité d'une analyse biologique
La qualité de l'analyse biologique correspond à la qualité de l'acte médical
QUALITE TECHNIQUE proprement dite (précision, exactitude, sensibilité, spécificité)

 valeurs les plus précises et exactes possibles
QUALITE CHRONOLOGIQUE (réponse à l'urgence)
QUALITE INFORMATIVE : dépend en partie des 2 premières

dépend du contexte scientifique et médical

 valeurs significatives et utilisables
QUALITE ECONOMIQUE paramètre de + en + important !!

Valeurs obtenues à comparer aux valeurs de références

Nécessaire maîtrise de la variation analytique et des variations biologiques
La biologie clinique = discipline de nature quantitative  existence déjà ancienne de méthodes chiffrées d'évaluation de la qualité  contrôle soigneux de tous les facteurs.

Referentiels :
Guide des bonnes pratiques de laboratoire (UPPL)

Guide de bonne exécution des analyses (GBEA)

Référentiel d'accréditation et/ou de certification

Les différents types de contrôle
POOL DE SERUMS

Méthode économique (études de précision, dérives analytiques, erreurs fortuites)
CONTROLES COMMERCIAUX

Pool de sérums lyophilisés, contrôlés et garantis ( la sécurité)
CONTROLES PAR LES RESULTATS DES PATIENTS

Pool des valeurs obtenues sur les patients "tout venant" (exemple : bilan d'entrée)
CONTROLES INTERLABORATOIRES : 3 catégories

- interhospitaliers

- régionaux (Région Rhône-Alpes : Pro Bioqual)

- national de qualité (CNQ, obligatoire depuis 1976, sous l'égide de l'Agence du Médicament et sous contrôle de la SFBC depuis 1993, peut avoir pour conséquence des sanctions).

Matériel Biologique
SANG

Modes de prélèvement : veineux, capillaire, artériel

Conditions de prélèvement


Jeûne

Variations nycthémérales


Clinostatisme, orthostatisme

Effort prolongé

Etat pathologique ou physiologique particulier


Conservation : froid, obscurité, déprotéinisation

Echantillons


Sérum

Coagulation spontanée du sang sans anticoagulant : qques mn

Risques liés au contact prolongé avec éléments figurés


actuellement réduits (billes séparatives, silice activatrice)

Intérêts : protéines spécifiques (immunochimie), lipides

électrophorèse des protéines ou lipoprotéines

plasma

intérêts : manipulation aisée, risques réduits d’hémolyse

risques : interférence avec anticoagulants

sang total

valable pour l’analyse si substance en concentration identique

dans globules rouges et plasma

sang deprotéinisé

lactate, pyruvate

éléments figurés 

séparation par sédimentation, centrifugation, gradients de densité

Interférences dans les dosages 


hémolyse, bilirubine, triglycérides, médicaments

URINES


De 24 heures ou échantillon unique

Conditions de recueil standardisées

Conservation : mercaptoethanol, HCL

Contrôle du débit (créatinine)

Modification du pH

AUTRES LIQUIDES

Larmes, sueur, salive


Liquides de ponction

Transsudats (pauvres en protéines)

Exsudats (riches en protéines = perméabilité membranaire)

SELLES

TISSUS


Ponction biopsie

Traitements plus ou moins aptes à préserver la structure tissulaire

perfusion organe entier

fragments ou tranches tissulaires (congelés ou en survie)

coupes fines de tissus fixés (froid, paraformaldéhyde, glutaraldéhyde)

broyats (mixage)

homogénats (cylindre en verre + piston – Potter)

destruction tissulaire (ultrasons, froid, tensio-actifs)

isolement des constituants subcellulaires

centrifugation différentielle

purification par identification de marqueurs (enzymes)

Méthodes préparatives et/ou séparatives
Dissociation cellulaire

Obtenir les informations métaboliques spécifiques de chaque type cellulaire nécessite l’obtention de suspensions monocellulaires dont l’analyse est directe ou après prolifération en culture
Dissociation des tissus

Rupture mécanique (broyage, tamisage, fragmentation fine)

Rupture de la MEC et des jonctions intercellulaires

Enzymes protéolytiques

Agents chélatants

Méthodes combinées

Prélèvements de suspensions cellulaires (sang, liquide amniotique…)
Séparation cellulaire

Méthodes classiques de centrifugation (+ ou- gradients de densité)

Différences d’adhésion au support

nature : verre, plastique

modifié : chimie, immunochimie

Différences de croissance en culture (milieu sélectifs)

Tri des cellules marquées (FACS, MACS)
Culture cellulaire

Définition 

système ex-vivo où les cellules, la plupart du temps isolées, survivent, se multiplient, expriment des propriétés différenciées
Méthodologie

Fragments tissulaires ou suspensions cellulaires

Supports de culture (parfois, enceintes)

Conditions environnementales

stérilité

atmosphère contrôlée

température contrôlée

milieu de culture (nutritif, stimulant)
Systèmes cellulaires

Primoculture ou culture primaire

Culture secondaire : souches ou lignées non définies

Lignées continues
Interférences

Autres cellules

Support

Contaminations
Conservation des cellules
Transport des cellules
Applications
DEPROTEINISATION

But

Elimination des protéines d’un milieu biologique complexe
Intérêt

Eviter l’interférence des protéines sur la méthode de dosage

Trouble gênant la spectrométrie, la fluorimétrie

Inhibition de réaction colorimétriques

Précipiter d’autres substances interférentes non souhaitées

Procédés

Physique : dénaturation par chauffage , précipitation

puis ultrafiltration, dialyse

Immunologique : précipitation sélective de complexe Ag-Ac

Chimique par déshydratation

Alcools éthylique, méthylique, acétone

Sels minéraux : sulfate d’ammonium, de sodium,

méthode appelée relargage qui évite la destruction de la structure spaciale des protéines

par formation de sels insolubles

en milieu neutre

sulfate de zinc, soude, baryte, mais absobtion sur le précipité de substances non protéiques contenues dans le milieu

en milieu acide

acide trichloracétique, perchlorique, autres sels (picrates molybdates. ..)
CENTRIFUGATION

Principe

Séparation des particules contenues dans un solvant

(cellules, organites subcellulaires, macromolécules)
Sédimentation

Résultante de l’effet de 2 forces

Pesanteur

Viscosité du milieu

Modifications de la sédimentation

Ralentissement : augmentation de la viscosité (dextran, ficoll)

Accélération : augmentation de la force de pesanteur = création d’une force centrifuge
Centrifugation

Augmentation de la sédimentation proportionnelle

au carré de la vitesse

et

au rayon de l’axe de centrifugation

Remarques

Centrifugation horizontale ou oblique

Vérifier la vitesse (surtout faible)

Eviter la décélération brutal

Récipients variables, volumes variables

Possibilité  20000 g

Réfrigération possible

Ultracentrifugation

Principe

Accélération élevée (> 100000g), température réfrigérée
Ultracentrifugation préparative

Différentielle : mélange homogène  2 fractions (culot et surageant)

En gradients de densité

Zonale : gradient de saccharose

Séparation selon les coefficients de sédimentation

Isopycnique : chlorure de césium

Séparation selon la densité

Remarques : la forme du gradient est importante

Gradient linéaire macromolécules

Gradient concave lipoprotéines (flottation)

Gradient discontinu ou par paliers cellules, organites subcellulaires, homogénats, purification de virus

Gradient à paliers multiples

La préparation est manuelle ou informatisée

Le remplissage est variable selon la nature du gradient

La récolte des fractions se fait à la pipette ou par pompe

L’analyse des fractions est discontinue ou en continu
Ultracentrifugation analytique

Diffère par les résultats attendus

Renseigne sur les caractéristiques physiques des molécules

La migration est souvent suivie par stroboscopiecoût
dialyse
Principe : séparation des substances selon leurs capacités à franchir une membrane de dialyse (porosité définie)
Membranes

Cylindres allongés fermés à leurs extrémités

Contiennent les substances à étudier

Collodion ou cellophane, porosité : 2,4nm

Variation possible de la porosité par étirement ou traitement chimique
Facteurs d’influence notion de temps de demi-dialysance

Température

Surface comparée au volume à analyser

PH
Méthodes

Préparation des membranes (conservation possible à 4°)

Préparation des boudins de dialyse (fermeture, lestage)

Changement du liquide de contre dialyse fréquent

Adaptation des techniques au volume à analyser
Applications

Dessalage

Concentration

Elimination de substances diffusibles

Modification d’un pH
filtration
Principe : sélection de substances par passage sur un filtre
Types de filtres

En profondeur

Nature : substances fibreuses (ammiante, cellulose,coton,verre)

agglomérées (verre frité, sable, charbon)

Capacité de filtration (épaisseur, pression)

Forme : filtres papier plats ou plissés, filtres en fibre de verre, tubes filtrants, papier séparateur de phase, plaques fritées (filtration sous vide)

Ecran

Nature : nitrate de cellulose, chlorure de polyvinyle

Marques : Millipore, Sartorius, Gellman

Filtration par arrêt des particules à leur surface (préfiltration)

Filtration stérilisante (rincer si application culture cellules, triton)

Utilisation en cytologie (transparisation par huile d’immersion)

Ultrafiltration
Principe : séparation des substances selon leur taille moléculaire

Filtre écran moléculaire
Méthode

Membranes Diaflo

Pression par azote ou centrifugation

Applications :

concentrations de molécules,

élimination de substances de faible PM,

étude de la liaison macro-micromolécules,

isolement de virus,

suivi dechromatographie sur colonne
filtres à membranes capillaires (25m)

4 types : PM >30000 HFU

PM>5000 HFD

PM>200 HFO

Gaz HFG
Montages en macrotubes, bécher, microbécher, microtube en T

Précautions d’utilisation

Rinçage, préfiltration millipore, température, pH,pression,solvants organiques, rinçage avant recyclage

Applications

Dessalage

Concentration de liquides biologiques (CaCl2, PEG)

Chromatographie
Définition

Difficile, ensemble de méthodes basées sur des principes physiques différents

Point commun : utilisation d’un support (poudre très fine en grains, ou solide percé de canalicules surface importante

la substance à analyser circule dissoutedans un solvant convenable entre les particules du support ou les microcanalicules

il se crée des interactions physiques entre les particules du support et la substance à analyser (van der waals, polaires).

Les liaisons sont rapides et réversibles ; elles dépendent de la nature chimique des substances et donc permettent leur séparation.
Mécanismes

Ils sont au nombre de 5 selon la nature des forces

Ils sont utilisés séparément ou en association

Adsorption : liaisons hydrophobes ou de Van der Waals
Echanges ioniques : le support est composé de molécules chargées

Si charges + échange d’anions

Si charges -  échange de cations
Filtration en gel : support = grains de matière poreuse

Grosses molécules exclues du gel
De partage : 2 solvants : eau et toluène ou gaz et liquide

Séparation selon solubilité
D’affinité : utilise la liaison enzyme-substrat ou Ag-Ac
Dispositifs
Chromatographie sur colonne en phase liquide

Support de chromatographie

Solvant de dilution de la substance à analyser (stationnaire)

Solvant d’élution (mobile)

Pression variable (basse, moyenne = 10 bars, haute >30 bars)

Analytique, préparative ou gaz-liquide
Chromatographie papier

Feuille de papier filtre placée verticalement en enceinte fermée imprégnée de vapeur d’eau

Solvant organique ascendant ou descendant

Séparation des substances entre eau et solvant

Révélation des « taches »
Chromatographie couche mince = variante

(couche de support sur verre)
Choix des méthodologies

selon substances et but à atteindre

electrophorese

Principe : déplacement de molécules chargées dans un champ électrique continu
Facteurs

Temps de migration,

Force ionique du tampon

Température

Courant électrique continu

Forces de freinage

PH du tampon (important si substances amphotères)
Méthodes

sur papier basse tensionséparation des protéines

révélation par colorants généraux ou spécifiques

haute tension petites molécules

en esters de cellulose

matrice homogène, séparation rapide (voltage élevé 30v/cm)

volume échantillon petits

protéines

en gel d’agarose

grande porosité

molécules haut PM et complexe supramoléculaires

immunoelectrophorèse, electrofocalisation

en gel d’amidon

effet tamis marqué, séparation en fonction de taille et charge (20v/cm)

protéines (inconvénient quantité <.10g)

en gel de polyacrylamide

séparation selon charge et poids, verticale ou horizontale

réticulation modifiable (% acrylamide)

analytique et préparative

isofocalisation ou isotachophorèse

+ agents dénaturants (urée ou SDS, analyse de structure)

Electrofocalisation

séparation des protéines en fonction de leurs points isoélectriques 

utilise des gradients combinés densité-ph, mélange de produits par intervalles de pH , grand pouvoir de résolution

utilisable en milieu liquide, en gel de polyacrylamide, en gel granité
Electrophorèse en 2 dimensions

Association de électrofocalisation et électrophorèse en SDS

Méthode très résolutive, analyse qques milliers de protéines

Lecture des résultats par analyse d’image
Isotachophorèse

Séparation des ions (différence de mobilité en milieu electrolytique discontinu. Méthode séparative si support en gel granulé
Immunophorèse

Combinaison des méthodes
Electrophorèse en champ pulsé

Appliquée à l’étude du génome (séparation de ADN haut PM)

Méthodes analytiques
PHOTOMETRIE
Principe

Utilise la capacité d’absorption de lumière d’une longueur d’onde fine et définie des substances dissoutes dans l’eau.
Spectre d’absorption lumineuse :

repésentation graphique des variations de densité optique de la lumière transmise lors de modification de la longueur d’onde de la lumière incidente.

Spectres des substances : ultraviolet et visible.

Conditions définies : solvant, pH, O
Appareillage

Nature spectrophotomètres : toutes les longueurs d’ondes sont disponibles

Photomètres : certaines longueurs d’ondes

Caractéristiques

Sources lumineuses solides chauffés

Décharges des gaz rarefiés

Fente d’entrée

Mono chromateur filtres colorés

Filtres interférentiels

Prismes

Réseaux

Fentes de sortie

Cuves verre -> visible

Quartz -> U.V.

Cellules photoélectriques -> transformation énergie lumineuse en énergie électrique

Tubes photomultiplicateurs

Lentilles, miroirs, fibres optiques

Amplificateurs

Galvanomètres (mesure le courant fourni par l’amplificateur

Enregistreur
Applications

Détermination du spectre caractérisation substance

Mesure de concentration directe (Hb. Protéines)

Indirecte (urée diacetylmonoxime)

Réflectométrie

Mesure de l’absorption lumineuse au cours du passage d’une lumière monochromatique à travers une phase solide sur support réfléchissant.
Applications Lecture de plaques de chromatographie

De bandelettes réactives

Analyse automatique
Luminométrie

Mesure de la lumière émise par réaction chimique

(Chimioluminescence)

Applications : réactions impliquant la luciférase (ATP ou O2)
Photométrie des milieux troubles
Opacimétrie

mesure de la lumière émise dans le même sens que la lumière incidente

Néphélémétrie

mesure de la lumière à 90° par rapport à la direction de la lumière incidente

Turbidimétrie

concentration ou épaisseur d’un milieu troublant la visibilité nette d’un test optique placé derrière ce milieu
Fluorimétrie

Principe : une molécule à l’état stable recevant une énergie sous forme de rayonnement passe à l’état exité. Le retour à l’état fondamental se traduit par l’émission de lumière mesurable.
Chemiluminescence

Dans ce cas, l’énergie est d’origine chimique ou enzymatique

Spectres

d’émission comporte une longueur d’onde pour laquelle l’intensité est maximum

d’excitation comporte une longueur d’onde pour laquelle l’intensité est maximum

enzymologie
Enzyme
Définition catalyseur biologique de réaction biochimiques
Spécificité vis à vis de la molécule sur laquelle il agit = substrat

Variable (notion d’affinité)
Structure

Préparation et purification

Protéines 

Parfois fragilisées par les séparation des constituants cellulaires

Site actif = sites privilégiés de fixation du substrat

Proenzyme = forme inactive à transformer pour activation

Isoenzymes = différentes protéines à même spécificité enzymatique

correspondent souvent à des protéines formées de plusieurs chaînes polypeptidiques à combinaisons variables entre elles (LDH)

Il existe des protéines à plusieurs fonctions enzymatiques

Enzyme et structure cellulaire

- enzymes impliquées dans une chaîne métabolique ont souvent la même localisation cellulaire

  • parfois regroupements en complexes poly-enzymatiques difficilement dissociables

Régulation de l’activité enzymatique

Formes allostériques différences de forme spaciale

Certaines substances - ligands- modifient ces formes

Ce sont des effecteurs allostériques (parfois substrat ;dans ce cas la courbe de la vitesse de réaction en fonction de la concentration prend la forme d’une sigmoîde)

Certaines substances de bas PM ont également des effets effecteurs ou inhibiteurs  modification de l’affinité pour le substrat régulation métabolique

  • Cas de la régulation par le produit terminal de la chaîne métabolique = rétro inhibition ou inhibition par feed-back

  • Enzyme à concentration faible par rapport aux autres enzymes de la chaîne métabolique, enzyme régulateur de la chaîne  effet limitant


Classification internationale des enzymes => numérotation

1 = oxydoréductases : réactions d’oxyoréduction

2 = transférases : transfert de groupements fonctionnels

3 = hydrolases : réactions d’hydrolyse

4 = lyases : suppression ou fixation d’un groupement=>double liaison

5 = isomérases : réactions d’isomérisation

6 = ligases : liaison (c-o, c-n, c-c, c-s) avec coupure d’une molécule d’ATP
Dosage des enzymes
Moyens : 2 méthodes immunochimiques (comme autres protéines)

Méthodes de mesure de l’activité catalytique
Mesure quantitative

Mesurer la vitesse de réaction  apprécier la quantité d’enzyme

v = k{Enz]

v = molécules de substrat tranformées par minute

[Enz] concentration en enzyme

k = constante dépendant de la nature de l’enzyme
Paramètres

concentration en substrat

mesure, pour chaque concentration, de la vitesse initiale – tous paramètres stables

aspect de la courbe dû au fait que, à concentration faible, toutes les molécules d’enzyme ne sont pas saturées
pour une concentration en substrat la vitesse est donnée par :

équation de Michaelis-Menton

v = Vmax {S] / {S] + {KM]

K: caractéristique de l’enzyme, exprimée en molécules.l-1

Souvent transformation pour obtenir une représentation graphique linaire (équations de Lineweaver-Burk, Eadie-Hoftee)
Température et pH

résultante entre effets activateurs et inhibiteurs
Coenzymes

partie non protéique – souvent transformé lui-même

souvent transporteur de groupements fonctionnels

ATP, coenzymeA, biotine, pyrophosphate de thiamine
Activateurs autres : ions métalliques (Zn, Mg..)

protéines inertes (albumine)

protecteurs des thiols
Inhibition compétitive analogue structural du substrat

modification par ajout de substrat

modification de la KM

non compétitive complexants,

inhibiteurs d’une fonction chimique

aucun effet d’ajout de substrat

pas de modification de la KM

 nécessité de standardisation

de contrôles interne, externes
conditions classiques

large excès de substrat

température = 37° ou 30°

pH = pH optimal

protecteurs enzymatiques

dilutions ( !)
Techniques de mesure

2 possibilités : disparition du substrat ou apparition du produit

méthodologies de mesure

photométrie coloration du produit

différence d’absorption fluorimétrie technique plus sensible

soit fluorescence spontanée,

soit transformation en produit fluorescent

modification pH, ajout réactif, transformation

causes d’erreurs (fluorescence propre , impuretés témoin « blanc réaction »

radioisotopie substrat radioactif  séparation

sensible, peu d’interférences

impossibilité d’automatisation

prix élevé, difficultés de fabrication

Immunochimie Anticorps-anti-enzyme pour séparer différentes activités

Spécificité pour une isoforme

Etude des modifications génétiques

Expression des résultats

v de la réaction / ml ou mg de protéines

v = moles de substrat / mn à 30°  UI

Katal = 1 mole/seconde

1 UI = 16 nkatal

Dosage des substrats
Dosages en point final

Excès d’enzyme

Possibilité d’utiliser une deuxième réaction de révélation

Mesure en fin de réaction par photométrie ou radioenzymologie
Dosages par méthode cinétique

Enzyme à Km élevée (éventuellement inhibiteur compétitif)

Mesure de la vitesse de réaction à 2 temps rapprochés et comparaison avec la courbe établie à partir de quantités connues de substrat

La plupart du temps ; méthodes des analyseurs multiparamétriques

immunochimie
Principe : utilise la spécificité remarquable de la liaison antigène – anticorps dûe à la complémentation stéréochimique qui la caractérise
Nature des réactifs
Anticorps protéine particulière synthétisée par les lymphocytes B

Architecture de base à 2 chaînes lourdes et légères

Polymorphisme très élevé

Site Ac toujours situé en extrémité N terminale
Liaison Ag-Ac par site antigénique et site anticorps
Chaque anticorps possède une afffinité particulière à l’égard de l’épitope qui lui correspond
Nombre d’épitopes variable de 1 pour les molécules hapténiques à plusieurs centaines pour certains virus
Préparation des réactifs immunochimiques
Immunisation expérimentale d’animaux la plupart du temps
Préparation des antigènes

Grosses molécules spontanément immunogènes injection directe

Haptènes = molécules PM <5000  couplage avec grosses molécules (albumine, adjuvant de Freund)
Anticorps polyclonaux
Mélange d’anticorps issus de nombreuses cellules lymphoïdes  Ac reconnaissant des épitopes différents ou des aspects variés du même épitope ou un même épitope avec une affinité variable = immunsérums, excellents ractifs
Nécessité de purifier l’immunsérum

de le concentrer en anticorps (précipitation Ig)
Anticorps monoclonaux
Proviennent de l’hybridation d’une cellule lymphocytaire avec une cellule tumorale (plasmocytome) =>cellule hybride immortelle

=>clone à fabrication indéfinie et stabilisée d’1 anticorps
avantages : production industrielle

préparation à partir d’antigènes inconnus
Etalonnage

Réaction Ag-Ac sensible à l’environnement  étalonnage et dosage

mêmes conditions (y compris nature du prélèvement)
En général, il est en fait techniquement impossible de connaître la quantité exacte d’antigène dans le milieu d’étalonnage

=> expertises et définitions d’unités internationales

  • distribution de solutions d’étalonnage sous les auspices de l’OMS


Méthodes

Nombre et variété impressionnants
Classification possible selon le phénomène observé et mesuré

Observation directe du complexe Ag-Ac : précipitation, agglutination

Observation indirecte par l’intermédiaire d’une marque attachée soit à l’antigène, soit à l’anticorps. Marque = molécule détectable par un appareil ou les sens.

Observation par intermédiaire d’un phénomène biologique
Applicable à la quantification des antigènes et des anticorps

mais dosage possible des antigènes (cf : remarques)

Seulement estimation des anticorps (variabilité)

Appréciation de la quantité des immuncomplexes
Standardisation et contrôles de qualité en immunochimie
Valeurs des méthodes inégales : reproductibilité, seuil de détection, spécificité, sensibilité aux interférences, commodité, capacité à être automatisée, coût

Donc : évaluations, comparaisons

généralement du mélange : principe méthodologique, appareillage, réactifs
standardisation en fait impossible

 définition de valeurs de consensus

 mise au point de matériel réactif de référence
RADIOANALYSE
Principe

La plupart des éléments naturels existent à l’état de mélange d’isotopes

Masse noyau  I

propriétés chimiques identiques

Nombre électron = I

Les radioisotopes sont instables.

Leur désintégration  libération e- ou rayon 

Il est possible de créer des réactifs marqués par radioisotopes pour l’usage biologique.
Méthodes

Les radioisotopes peuvent être détectés de diverses manières :

compteur Geiger (ionisation d’un gaz)

compteur à scintillation (éclair lumineux)

autoradiographie (impression d’une plaque photographique)
Applications

 toute technique d’analyse biochimique (cf : reste du cours !)

étude métaboliques : traçage des processus cellulaires :

précurseur radioactif  étape métabolique  mesure

biochimique ,

autoradiographique,..

METHODES ELECTROCHIMIQUES
Principe

Echange d’électrons entre électrode et substance électroactive

(électrode = cathode ou anode)
Méthodes

Méthodes en pleine expansion, souvent automatisables (biochimie analytique du GR ou analyses de biologie délocalisée)

Les méthodes sont de 2 types selon l’importance de l’électrolyse :

 ampérométrique :

ampérométrie : microélectrolyse avec concentration relativement constante de l’analyte. Potentiel constant, intensité courant proportionnelle à concentration analyte

Application : détermination de la PO2 ou étude post-chromatographique haute pression.

potentiométrie : les électrodes sont spécifiques à membrane. Intensité courant constante,analyse des variations de potentiel en fonction de la concentration analyte
 coulométrique :

mesure la consommation complète du produit à analyser. Intensité ou potentiel imposé.

Application : dosage du fer sérique par coulométrie à potentiel imposé.
 voltamétrie et polarographie. Application peu usuelle

OBSERVATION MICROSCOPIQUE
Principe

Utilisation d’amplification du signal par lentilles optiques pour détecter des objets de taille inférieure à celle décelable à l’observation à l’œil nu.
Méthodes

On distingue :

 la microscopie photonique qui, comme son nom l’indique, utilise des lampes à émission de photons (longueurs d’ondes UV visibles).

Préparation spéciale : coloration sélective (entraîne la nécessité d’augmenter la sensibilité par activité enzymatique ou par fluorescence)
 la microscopie électronique qui utilise un faisceau d’électrons.

Contraintes spécifiques : la fixation est nécessaire (elle utilise en général des produits identiques à ceux décrits pour la déprotéinisation)

coupe en tranches fines (souvent inclusion dans résine ou cire)

les mêmes préparations utilisées pour la microscopie optique peuvent être utilisées en microscopie électronique avec révélation (enzyme, peroxydase ou or colloïdal)

La microscopie électronique par cryofracture (cassure des structures internes de la cellule par le froid intense) localise la distribution de proteines intra-cellulaires.

La technique de coloration négative : entraîne la révélation d’agrégats macromoléculaires ou l’agencement des sous-unités protéiniques.
 le microscope à fluorescence permet la détection de protéines ou d’autres substances.

Il est possible d’utiliser des anticorps marqués (fluorescents ou révélés par activité enzymatique). Ces anticorps se lient à la surface des molécules de la cellule vivante ou à l’intérieur de la cellule fixée perméabilisée. Il y a possibilité de détection de variation de concentration et localisation de molécules à l’intérieur de la cellule.
 la microscopie par diffraction des rayons X : révèle un arrangement tridimensionnel moléculaire.

ELEMENTS D'UN ARTICLE SCIENTIFIQUE


JOURNAL

DATE DE PUBLICATIONS

TITRE

AUTEURS + ADRESSES

MOTS CLEFS
RESUME

INTRODUCTION

Exposé du problème à résoudre

Plan du travail
MATERIEL et METHODES
RESULTATS + COMMENTAIRES

Tableaux - Figures
DISCUSSION

Tableaux - Figures
CONCLUSION
REMERCIEMENTS
BIBLIOGRAPIE

ANALYSE ARTICLE 1 (X linked recessive icthyosis)


MATERIEL BIOLOGIQUE UTILISE
 biopsie cutanée  fibroblastes cultivés

 sang  leucocytes isolés
METHODES UTILISEES
culture cellulaire

sédimentaiton en polyvinylpyroglidone

centrifugation

lyse cellulaire (ultrasons)

mesure activité enzymatique :

 radiochimie

 blanc réactif + blanc réaction

 double essai

 mesure par fluorimétrie en substrat artificiel (methylumbelliférone)
RESULTATS
blanc réactif (conditions d'incubation)
conditions de réaction

STS

comparaison de tampon Tris et phosphate

 sensibilité dans les leucocytes  temps incubation

 activité spécifique substrat

 concentration en protéines

de l'échantillon

ARS-C

 tampon phosphate à pH 8,5
détermination des valeurs de référence

des valeurs des patients

des valeurs des porteurs

CONCLUSION
intérêt du dosage de la STS

intérêt de la mesure dans plusieurs types cellulaires pour le dépistage

des porteurs

ANALYSE ARTICLE 2 (purification mpicrofibrilles)

MATERIEL BIOLOGIQUE UTILISE
Ligaments de la nuque de fœtus de boeuf
METHODES UTILISEES
Préparation de microfibrilles natives intactes ( )
Centrifugation en gradient de densité

 directement ou après traitement avec hyaluronidase toute la nuit

 en gradient de C3CL (densité initiale 1,35 g/ml)

soit  72 H, 36 000 rpm

 15 fractions de 0,8 ml

soit  congélation4 H à -80°C, 18 H centrifugation, 36 000 rmp

 15 fractions de 0,8 ml
Analyse biochimique

 dialyse contre tampon 50 mM Tris/HCL, pH 7,4, contenant 0,2 M NaCl

 mesure densité optique à 280 nm par analyse spectrophotométrique
SDS PAGE

 dialyse contre eau distillée (aliquot 0,5 ml)

 congélation

 SDS PAGE à 6 % de SDS en condition réductrice (dithiothreitol)

 coloration des protéines ou bleu de Coomassie
Immunobuvardage (ou "blotting")

 sur membrane de cellulose (aliquot 50 µl)

 anticorps : anticollagène VI, antifibrilline, anti MAGP-1, anti LTBP-1,

anti LTBP-2, antifibronectine

 révélation par chemiluminescence
Microscopie électronique à ombrage rotatif

 observation du mélange initial riche en microfibrilles et des fractions de

centrifugation en gradient

RESULTATS
Centrifugation en gradient de densité

 gradients de 1,28 à 1,43 g/ml (72H ou 18H après congélation)

 mesure de la densité optique à 280 nm  protéines à densité 1,30,

1,33 et 1,41 g/ml

après traitement par hyaluronidase, pic protéines 1,33 et 1,37 g/l
SDS PAGE et Immunobuvardage

 fractions 6 et 7  collagène VI chaîne 1 et 2 et chaîne 3

 fractions11 et 12 protéine de 330 kDa  fibrilline avec

colocalisation MAGP-1

 sommet du gradient fractions 1 et 2  LTBP-1 et LTBP-2
Microscopie à ombrage rotatif

- préparation non traitée à la hyaluronidase

 fractions 6 et 7  collagène VI en aggregats

+ quelques fibres de fibrilline

 fractions 11  µfibrilles de fibrilline
- préparation traitée à la hyaluronidase

 fractions 6 et 7  µfibrilles de collagène VI

 fractions 11  µfibrilles de fibrilline

DISCUSSION

(CONCLUSION)
La méthode proposée permet une analyse structurale fine et précise

des µfibrilles.

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