Institut Saint Joseph : 6ème technique de qualification chimiste 2015-2016








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date de publication06.01.2017
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Le dépistage néonatal



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Nshimiyimana Hugues Nom du promoteur : Dr. Hilde Laeremans

Institut Saint Joseph : 6ème technique de qualification chimiste 2015-2016

Table de matières

1. Remerciement

2. Introduction

3. Le test Enzyme-Linked Immunosorbant Assay (ELISA)

3.1 Le test Enzyme-Linked Immunosorbant Assay indirect

3.2 Le test Enzyme-Linked Immunosorbant Assay direct

3.2.1 Enzyme-Linked Immunosorbant Assay sandwich

2.2.2 Enzyme-Linked Immunosorbant Assay par competition

4. L’analyse de l’hormone de stimulation thyroïdienne (TSH)

4.1 Contexte de l’analyse

4.2 Principe de l’analyse

5. Analyse de l’hormone 17α hydroxy progestérone (17 OHP)

5.1 Contexte et principe de l’analyse

5.2 Principe de l’analyse

6. Analyse de la trypsine

6.1 Contexte de l’analyse

6.2 Principe de l’analyse

7. Dosage d’activité enzymatique de la biotinidase dans le sang séché

7.1 Contexte de l’analyse

7.2 Explication de l’analyse

8. Partie technique

8.1 Le maintenance de l’Autodelfia

8.2 Le découpage

8.3 Cartes non conforme

8.4 Dosage de l’activité de l’enzyme de biotinidase (1er jour)

8.5 Dosage de l’activité de l’enzyme de biotinidase (2ème jour)

9. Interprétation des résultats

9.1 Test ELISA

9.2 Test colorimétrique

10. Résultats

10.1 Hormone de stimulation thyroïdienne

10.1.1 Contrôle interne et externe

10.1.2 Résultats élevés et Blood Spot Possibly Missing (BSPM)

10.1.3 Calcul de concentration (courbe standard)

10.2 Hormone 17α hydroxyprogestérone

10.2.1 Contrôle interne et externe

10.2.2 Résultats élevés et Blood Spot Possibly Missing

10.2.3 Calcul de concentration (courbe standard)

10.3 Enzyme de trypsine

10.3.1 Contrôle interne et externe

10.3.2 Résultats élevés et Blood Spot Possibly Missing

10.3.3 Calcul de concentration (courbe standard)

10.4 Enzyme biotinidase

10.4.1 Contrôle interne et externe

10.4.2 Résultats élevés et Blood Spot Possibly Missing

10.4.3 Calcul de concentration (courbe standard)

11. Discussions

11.1 Hormone de stimulation thyroïdienne

11.2 Hormone 17αhydroxyprogestérone

11.3 Enzyme de trypsine

11.4 Enzyme biotinidase

12. Conclusion

13. Références

1. Remerciement

Je profite par le biais de ce rapport pour exprimer mes grands remerciements à toutes les personnes liées de près ou de loin à l’élaboration de ce travail.

Je tiens tout d’abord à remercier mes professeurs, M. Fouad, Mme. Lecruivre et particulièrement ma titulaire Mme. Laabidi pour m’avoir formé durant ces deux dernières années et de m’avoir donné les outils permettant d’envisager des études supérieures sans soucis.

Un tout grand merci à ma maitre de stage Mme. Laeremans, pour m’avoir accueilli dans son laboratoire de pédiatrie. Je tiens à lui exprimer mes sincères remerciements pour l’intérêt qu’elle m’a portée durant la période de stage et après dans la construction de ce rapport.

Aussi, je présente ma plus grande reconnaissance à Fatima, la personne qui m’a suivi durant toute la période de stage. Répondant à chacune de mes questions et en ciblant mes principales lacunes de manière constructives. Un tout grand merci au reste du personnel pour leur gentillesse et le respect en mon égard.

2. Introduction

Le stage de fin d’année s’est passé du 29 février au 25 mars au laboratoire de pédiatrie à l’ULB qui se trouve à Avenue J.J. Crocq, 15 1020 Bruxelles. Ce laboratoire de biologie clinique travaille essentiellement sur les dépistages néonatals. Le rapport de stage se divisera en deux parties distinctes :

- Test Enzyme-Linked Immunosorbant Assay (ELISA)

- Test colorimétrique

Pour le test ELISA, le laboratoire utilise l’appareil Autodelfia. L’Autodelfia est une machine qui permet de mesurer la fluorescence de certaines hormones et enzymes dont :

- L’hormone de stimulation thyroïdienne (TSH).

- L’hormone 17-hydroxy progestérone (17OHP).

- L’enzyme de trypsine (IRT).

Cette analyse se réalise sur base de sang séché de nouveaux nés sur du papier buvard. Le découpage du sang séché se fait à l’aide de la machine qui s’appelle, un Puncher. Les plaques sont spécifiques à chaque analyse. Le découpage est une étape très importante qui demande une grande concentration. En effet, l’erreur n’est pas autorisée car on ne peut pas se tromper d’enfant, cela peut avoir de conséquences irréversibles.

Une deuxième analyse est basée sur le dosage de l’activité enzymatique de la biotinidase. Il s’agit également d’un test dépistage néonatal. Cette analyse se fait également sur base de sang séché. Le découpage du sang se réalise aussi à l’aide de l’appareil Puncher dans les plaques.

3. Le test Enzyme-Linked Immunosorbant Assay (ELISA)

Le test ELISA, test immuno enzymatique pris de l’anglais (Enzyme-Linked Immunosorbant Assay) qu’on peut traduire (dosage immunoabsorption par enzyme liée). C’est un test qu’on réalise en laboratoire qui a pour but de mettre en évidence la présence d’anticorps ou d’antigènes spécifiques, propre à la maladie qui seront marqué par une enzyme. Ce test a été découvert en 1971 par deux scientifiques suédois, Peter Perlmann et Eva Engvall1. Le principe du test ELISA est d’utiliser les réactions antigènes et anticorps2 (complexe immun) qui sera marqué par une enzyme qui sera au préalable lié à un anticorps (l’anticorps secondaire) et qui marquera la fluorescence. Cette technique présente plusieurs avantages comme :

- L’utilisation d’anticorps monoclonaux3 mais pas seulement permette la détection spécifique. En effet, l’utilisation des anticorps monoclonaux n’est pas utilisée pour tous les types d’ELISA. Des anticorps monoclonaux sont des anticorps qui ont été fabriqué par le même lymphocyte B. Ils présentent les même caractéristique et peuvent reconnaitre ou pas le même épitope.

- C’est une technique facilement réalisable.

Il existe deux types de test ELISA :

- Le test ELISA indirect

- Le test ELISA direct

3.1 Le test ELISA indirect

Ce test permet la détection d’anticorps. Les scientifiques utilisent principalement cette technique pour le dépistage du syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA).

3.2 Le test ELISA direct

Ce test permet la détection d’antigène. Il existe deux types d’ELISA direct :

- ELISA sandwich

- ELISA par compétions

3.2.1 ELISA sandwich

Il existe 5 étapes pour l’ELISA sandwich :

- Un anticorps se trouve au fond de chaque puits.

- Ajout des antigènes (pastilles de sang) qui vont se lier aux anticorps au fond des puits. Le lavage de la plaque a pour but d’éliminer les antigènes qui ne sont pas liés.

- L’anticorps de détection va se lier spécifiquement à l’antigène.

- L’anticorps secondaire lié à une enzyme est ajouté, il va se lier à l’anticorps de détection.

- Le temps d’incubation des plaques.

- Mesure la fluorescence par la machine Autodelfia.

3.2.2 ELISA par compétition

Les scientifiques utilisent également cette technique pour détecter des antigènes spécifiques. La technique se réalise également en plusieurs étapes :

- Les anticorps sont fixés aux fonds de chaque puits de la plaque.

- Mélange des antigènes à détecter et les antigènes qui sont marqués. Ces deux anticorps rentrent en compétition.

- Le rinçage de la plaque permet d’éliminer les antigènes non spécifiques qui ne se sont pas fixé.

- Mesure de la fluorescence. Mais contrairement au test ELISA sandwich ; plus il y’a d’antigènes à doser qui sont retenus, plus la fluorescence et donc la concentration sera faible. Si la fluorescence est faible, la concentration sera élevée.

- Le temps d’incubation des plaques est dépendant de l’analyse.

4. L’analyse de l’hormone de stimulation thyroïdienne (TSH)

L’appareil Autodelfia permet de mesurer la fluorescence et c’est grâce à un programme de calcul (MultiQual). La courbe de standard dans la quantité d’hormone de stimulation thyroïdienne est connue dans le sang séché. Une hormone est une substance chimique secrété par une glande endocrine (exemples : le pancréas, glandes surrénales, ovaires, testicules,...). Ce sont des molécules messagères.

Le but de cette analyse est réaliser le dépistage néonatal de l’hypothyroïdie congénitale. L’hypothyroïdie congénitale est une anomalie de la thyroïde (glande) qui ne produit pas ou pas en quantité suffisante d’hormone thyroïdienne. Les sages-femmes prélèvent généralement le sang 3 jours après la naissance du bébé qui sera ensuite analyser. L’hypothyroïdie congénitale est responsable du crétinisme et du retard dans le développement psychomoteur et de la croissance.

4.1 Contexte de l’analyse

L’hypothalamus qui est un organe du système nerveux possède deux rôles importants :

- Le contrôle des sécrétions d’hormones (système endocrinien)

- Le contrôle de l'activité du système nerveux végétatif.

L’hypothalamus secrète une hormone, la Thyreotropin Releasing Hormone (TRH) qui va accélérer la sécrétion de l’hormone de stimulation thyroïdienne (TSH). Le TSH agit sur la thyroïde en régulant sa production d’hormones thyroïdiennes T3 et T4. Ce sont ces hormones qui jouent sur la croissance et le développement psychomoteur.

A la naissance le taux de TSH augmente durant les premiers jours puis se stabilisent4. Si au contraire le nombre de TSH continue d’augmenter, c’est le premier signe d’une hypothyroïdie congénitale. Il peut avoir plusieurs origines :

- Une malformation durant le développement embryonnaire de la glande thyroïdienne.

- Un problème de la synthèse hormonale.

- Plus rare, une absence de la thyroïde.

- Mauvaise position de la thyroïde.

4.2 Principe de l’analyse

Le principe de cette analyse repose sur la méthode immunologique de l’ELISA- sandwich. Tout d’abord, 2 anticorps monoclonaux se dirigent contre 2 antigènes déterminants des molécules d’hormones de stimulation thyroïdienne. Le premier anticorps qui se trouve au fond de chaque puits sur la plaque se dirige vers la sous unité beta de l’TSH. Le deuxième anticorps qui lui par rapport au premier anticorps est marqué par l’atome d’europium (Eu) se lie aux deux sous unités alpha et beta pour s’assembler et former un complexe immun stable. Ensuite arrive l’enhancement solution qui lui, va libérer l’atome d’europium du complexe immun et va transformer ce complexe en complexe chélate fluorescent. Le rôle de l’Autodelfia est de mesuré la fluorescence dans chaque puits. La fluorescence est proportionnelle à la concentration de TSH dans l’échantillon.

5. Analyse de l’hormone 17α hydroxyprogestérone (17 OHP)

5.1 Contexte et principe de l’analyse

L’appareil Autodelfia permet de mesurer la fluorescence et c’est grâce à un programme de calcul (MultiQual) et la courbe standard que la quantité l’hormone de 17 hydroxy progestérone est calculée dans le sang séché. L’objectif de cette analyse est de réaliser de dépistage néonatal de l’hyperplasie congénitale des surrénales (HCS). L’hyperplasie congénitale des surrénales est une maladie d’ordre génétique qui agit sur les glandes surrénales Ces glandes surrénales sont très importantes pour la synthèse de molécules. Les principales causes de cette maladie sont dû à l’absence de certaine enzymes comme :

- 21- hydroxylase qui est très importante dans la synthèse du cortisol. Le cortisol est une hormone stéroïde qui est secrétée par les glandes surrénales qui provient du cholestérol sous l’action d’andrénocorticotrophine (ACTH). Une production déficiente de cortisol amène à la surproduction d’hormones andrénocorticotrophine (ACTH) par l’hypophyse. L’hypophyse est une glande endocrine. Cette glande se trouve à la base du crane dans une loge appelée hypophysaire. Cette glande est liée à l’hypothalamus.

- 11 béta hydroxylase

- 17 hydroxylase

- 3 béta déshydrogénase

C’est à cause de ces absences, qu’il y’a une accumulation des hormones de 17OHP. En effet, lorsque l’enfant vient de naitre, les jours qui suivent, sont taux de 17 hydroxyprogestérone diminue rapidement. Il est possible que le taux de 17OHP soit stable ou qu’il augmente dû à la surproduction d’hormones andrénocorticotrophine (ACTH). A noter que cette maladie est responsable de troubles de la maturation sexuel et de la croissance.

5.2 Principe de l’analyse

Cette analyse se repose sur la méthode d’ELISA par compétions. L’antigène 17OHP présent dans le sang séché (papier buvard) entre en compétition avec l’antigène 17OHP marqué par l’atome d’Europium pour se fixer au premier anticorps. Maintenant, il existe deux complexes immuns stables (anticorps-antigène et anticorps-antigènes marqués), pour à la suite se lie au deuxième anticorps. Ensuite, la solution d’enhancement va séparer l’Europium des complexes et va le rendre fluorescent par chélation. Contrairement à l’analyse de l’hormone TSH, la fluorescence dans chaque puits est inversement proportionnelle au taux de 17OHP dans l’échantillon.

6. Analyse de la trypsine

L’appareil Autodelfia permet de mesurer la fluorescence et c’est grâce à un programme de calcul (MultiQual) que la quantité d’enzyme de la trypsine immunoréactive est connue. La trypsine est une enzyme digestive provenant du suc pancréatique. Son but premier est de digérer les protéines. Cette analyse nous permet de réaliser le dépistage néonatal de la mucoviscidose ou fibrose kystique.

6.1 Contexte de l’analyse

La mucoviscidose ou la fibrose kystique est une maladie génétique, héréditaire provoquée par une anomalie des gènes CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatore) sur le chromosome 7. C’est la maladie la plus fréquente dans les pays européens. En effet, cette maladie est très rare en Asie et en Afrique.

Elle provoque un surplus de mucus dans plusieurs organes comme :

- Les poumons, anomalie dans le fonctionnement épithélium des voies respiratoires.

- Le pancréas.

- Les intestins

- Les glandes sudoripares. Les glandes sudoripares sont des organes spécialisés la sécrétion de sueurs et pour certaines hormones ou phéromones. Les phéromones sont comparables aux hormones mais celles-ci sont secrétées par des glandes exocrines. On peut également percevoir une odeur qui se diffuse.

En général, le gène CFTR code pour une protéine de type canal à ion (Cl-) ; mais si il y’a une malformation du gène cela entraîne la production d’une protéine CFTR non fonctionnelle.

Selon une étude, les nouveaux nés qui sont atteints de la mucoviscidose ou fibrose kystique présente un nombre important taux d’enzyme de trypsine dans le sang.

6.2 Principe de l’analyse

Comme pour l’hormone de stimulation thyroïdienne, l’analyse se base sur la méthode immunologique d’ELISA sandwich. En effet deux anticorps monoclonaux se dirigent vers deux antigènes déterminant de la molécule de trypsine. Le premier anticorps qui lui est absorbé dans les parois de chaque puits va se diriger contre un ite spécifique de la molécule de trypsine. Tandis que le deuxième anticorps qui lui est présent en phase liquide et marqué par l’atome d’europium (Eu) va se dirige vers un autre site spécifique de la molécule de trypsine. Cet ensemble formera un complexe immun stable, jusqu’à l’arrivé de la solution d’enhancement qui va séparer les liaisons anticorps europium et ions europium, ce qui formera un complexe immun fluorescent. La machine mesure la fluorescence dans chaque puits. Comme pour l’analyse de l’hormone de stimulation thyroïdienne, la fluorescence est proportionnelle au taux de trypsine dans l’échantillon.

7. Dosage d’activité enzymatique de la biotinidase dans le sang séché

Cette analyse nous permet de mesurer la quantité de l’activité enzymatique de la biotinidase à partir du sang séché sur papier buvard. L’objectif de cette analyse est de détecter si il y’a une déficience d’activité

7.1 Contexte de l’analyse

La biotinidase est une enzyme nécessaire pour le recyclage de la biotine. La biotine est une vitamine H. Cette enzyme permet également la libération de la biotine liée à d’autres molécules. La biotinidase rend donc disponible la biotine dans l’organisme.

Le fonctionnement de la biotine ressemble à un groupe prosthétique. Un groupe prosthétique est toute molécule organique non protéique qui est liée à une protéine dans le but de la faire réagir. Composée de quatre carboxylases, la carboxylase est une enzyme qui va déclencher une réaction de carboxylation. En effet, elle va fixer le dioxyde de carbone (CO2) (qui est oxydé) en carbone organique (qui est réduit). La carboxylase assure l’introduction du CO2 dans les molécules, notamment dans la synthèse des protéines, des sucres, et des acides gras.

Le déficit d’activité en biotinidase est un trouble métabolique héréditaire. Si l’enfant présente un déficit de biotinidase, le métabolisme ne va pas pouvoir recycler la biotine. Or la biotine est très importante car si l’enfant n’en a pas en quantité suffisante, le sang devient acide et le cerveau cesse de fonctionner normalement et cela peut provoquer dégâts neurologiques irréversible. Il existe néanmoins d’autres symptômes comme :

- Conjonctivite

- Alopécie, une alopécie est le mot utilisé pour décrire une perte de cheveux. La calvitie est la forme la plus courante d’alopécie.

- Trouble d’équilibre

- Eruption cutanée

- Retard développemental

Dans certains cas, ces symptômes peuvent provoquer la mort de l’individu. Il existe cependant des traitements qui consistent à simplement avaler un comprimé de biotine.

7.2 Explication de l’analyse

Le principe de cette analyse repose sur un test colorimétrique de différentes solutions. Voir le point (7.4 et 7.5)

8. Taches

8.1 Le maintenance de l’Autodelfia

Le travail consistait à la maintenance de l’appareil Autodelfia qui nécessite plusieurs étapes :

- Déchargement des plaques dans l’Autodelfia.

- Retirer les embouts (Tips), les réservoirs de dilution et en remettre.

- Vider le réservoir poubelle.

- Remplir le réservoir Wash avec de l’eau déminéralisée et la solution Wash concentrate. Important de savoir qu’une bouteille de solution Wash (250mL) correspond pour un volume de 6L d’eau déminéralisée. L’utilité de cette solution est de nettoyer les puits, enlever les antigènes et anticorps qui ne se sont pas liés.

- Remplir le réservoir Rince uniquement avec de l’eau déminéralisée. La solution rince est lui utilisée dans le but d’éviter que la solution Wash se cristallise et bloque l’aguille.

- Mettre la solution enhancement.

- Effectuer le test du laveur, c’est un test réalisé tous les jours avant de lancer la machine. Ce test permet d’être sûr que la machine remplisse et aspire bien chaque puits et que les températures et pressions sont bons.

8.2 Le découpage

Le découpage du sang séché des nouveaux nés sur papier buvard à l’aide de l’appareil Puncher est une étape qui demande une grande concentration. Pour la découpe, il y’a un ordre exact et il est très important d’avoir des feuilles avec l’information sur le découpage qui permettent de savoir l’emplacement des contrôles et standards :

- Pour mesurer la quantité d’hormone de TSH, commencé par découper les cartes néerlandophones ensuite découper les cartes contrôles. Et pour finir terminer par les cartes francophones. Suivre les listes de travailles.

- En ce qui concerne l’analyse d’hormones 17 OHP, commencé également par découper les cartes néerlandophones, puis les cartes contrôles et pour finir certaines des cartes francophones. Suivre les listes de travailles

- Pour mesurer la quantité d’enzyme de trypsine, commencé directement par les cartes contrôles et après des cartes francophones. Suivre les listes de travailles

- Pour toutes les analyses faites par l’Autodelfia, ne pas oublier d’incorporer les standards et les contrôles, les contrôles sont des pastilles de sang qui nous permet de voir si l’analyse a bien été effectuée.

- Pas oublier d’incorporer les cartes à refaire s’il y en a.

8.3 Cartes non conforme

Une carte conforme est une carte dans lequel le sang prélevé par la sage-femme s’est correctement étalé sur tous les cercles du papier buvard.

Malheureusement, il est possible de trouver des cartes non conformes et cela pour plusieurs raisons :

- Surchargement de sang sur le papier buvard.

- A l’inverse, il est possible qu’il n’y ait pas suffisamment de sang sur le papier buvard, le sang n’est pas bien transverse

Après la découpe de tous les échantillons de sang sur les différentes plaques :

- Déposer les plaques les unes après les autres selon l’ordre indiqué.

- Effectuer toutes les étapes (remplir les réservoirs de rinces, de Wash avec un volume demandé, …).

A la suite de cela, le lancement de la machine Autodelfia peut se faire :

- L’Autodelfia réalisera les deux tests ELISA direct, le test ELISA sandwich pour l’analyse des hormones de stimulation thyroïdienne et pour les enzymes de trypsines. Le test ELISA par compétition pour l’analyse des hormones 17 hydroxyprogestérone.

- L’Autodelfia mesurera la fluorescence dans chaque puits de toutes les plaques. A l’aide d’un programme de calculs (MultiQual) et des échantillons standards, l’ordinateur pourra calculer la concentration des hormones ou enzymes.

- A la fin de toutes les analyses les feuilles avec tous les résultats sortiront de l’imprimante et pourront être interpréter.

8.4 Dosage de l’activité de l’enzyme de biotinidase (1er jour)

L’explication de cette analyse se divise en deux jours.

Le premier jour, le plus gros du travail reste le découpage des échantillons de sang séché. Pour le découpage, il existe deux dispositions de plaques :

- 1. Plaque 30-60 : Les 30 premières cartes de sangs occupent les puits A1 à C6. Tandis que les 60 suivantes occupent les puits D1 à H12.

- 2. Plaque 60-30 : les 60 premières cartes de sang occupent les puits A1 à E12. Tandis que les 30 suivantes occupent les puits F1 à H6.

Dans la première plaque, l’ajout des standards se met aux puits C7, C8, C9. Dans la deuxième plaque, l’ajout des standards se met aux puits H7, H8, H9. Le choix du standard se porte sur les patients connus sans déficience en biotinidase. Le choix de ce standard s’est décidé car il est considéré comme ayant 100% d’activité enzymatique de biotinidase et ce standard n’a pas la pathologie de la déficience en vitamine B12 (acidurie propionique-acidurie méthyl malonique). Il existe 3 types de standard :

- Le standard 100%, celui décrit

- Le standard 50%, le même mais après avoir subi une dilution.

- Le standard 0%

Après avoir découper tous les échantillons de sang et ajouter les standards. Ensuite ajouter 50µL de solution tampon phosphate dans chaque puits. Il faut recouvrir ces plaques de papier filtre puis les placer dans une centrifugeuse. La centrifugeuse permet d’éliminer les protéines du mélange réactionnel dans le but d’éviter les effets d’hémoglobines.

A la suite de cela, placer les plaques dans l’incubateur à 37 degrés Celsius durant 16-20 heures. Le temps d’incubation joue un rôle important dans le développement des couleurs. Important que la température de l’incubateur soit égale à 37 degrés, cette température doit correspondre à la température du corps humain. Durant le temps d’incubation la biotinidase recycle la biotine.

8.5 Dosage de l’activité de l’enzyme de biotinidase (2ème jour)

Le deuxième jour, réaliser le test colorimétrique :

- Avant tout, préparer la solution de nitrite de sodium (NaNO2).

- Ressortir les plaques de l’incubateur.

- Ajouter 50 µL d’acide trichloracétique (TCA), dans chaque puits, ensuite attendre 10 minutes. L’ajout du TCA permet de stopper, d’arrêter toute réaction enzymatique.

- Prendre une nouvelle plaque, noter les coordonnées de la plaque contenant les échantillons.

- Transférer 50µL du surnageant de chaque dans l’autre plaque. Pour le puits standard 50 (C8 ouH8) prélevez 25µL pour réaliser la dilution.

- Ajouter 50µL de la solution préparée, nitrite de sodium dans chaque puits et attendre 3 minutes. Cette solution permet le développement de la coloration.

- Ajouter 50µL de sulfamate d’ammonium (H6N2O3S) dans chaque puits, attendre 3 minutes. Cette solution permet également le développement de la coloration.

- Pour finir, ajoutez 50µL de N-1-naphtylethylènediamine dihydrochloride dans chaque puits et attendre 10 minutes. C’est cette solution qui marquera la coloration pourpre caractéristique de la présence d’activité de biotinidase dans chaque puits.

- Attendre 10 minutes et placer la plaque dans le colorimètre. Le colorimètre mesurera la coloration dans chaque puits et grâce à un programme de calcul et la courbe d’étalonnage, le pourcentage d’activité enzymatique de biotinidase dans chaque puits est calculé. Plus il y’aura présence d’activité en biotinidase, plus la couleur dans le puits sera foncée.

9. Interprétation des résultats

9.1 Test ELISA

Les interprétations des résultats sont différentes selon l’hormone et enzyme recherché.

Pour l’hormone de stimulation thyroïdienne (1er dosage) :

- Si la concentration de TSH est inférieure à 15µU/ml, le résultat est négatif. Pas d’action à entreprendre.

- Si la concentration de TSH est entre 15 et 25 µU/ml, le résultat est douteux. Refaire trois fois dans la même série.

- Si la concentration de TSH est égale ou supérieure à 25 µU/ml, le résultat est positif. Informer le responsable du laboratoire et refaire trois fois dans la même série.

Pour l’hormone de stimulation thyroïdienne (carte de contrôle) :

- Si les trois résultats sont de nouveaux positifs. Informer le chef de laboratoire.

- Si les résultats ne sont pas tous positifs, il s’agit toujours d’un résultat douteux. La décision est prise par la responsable du laboratoire.

Pour l’hormone de stimulation thyroïdienne (carte de contrôle, 2ème dosage) :

- Si le résultat de la concentration de TSH est inférieur à 10µU/ml , le résultat est négatif, ne rien faire.

- Si la concentration de TSH est supérieure ou égale à 10 µU/ml, le résultat est positif. Informer le chef de laboratoire et refaire trois fois.

Pour l’hormone 17 hydroxyprogestérone

Cela est différent pour l’hormone 17 OHP, cela dépend du nombre de semaine la mère était enceinte et du poids du bébé à la naissance.

Le résultat est positifs si :

- Si le nouveau-né est né avant 33 semaines de gestation et que ça valeur (concentration) est supérieure ou égale à 200nmol/L

- Si le nouveau-né est né entre 33.1 et 35 semaines et que sa valeur est supérieure ou égale à 105nmol/L

- Si l’enfant est né entre 35.1 et 36 semaines et que sa valeur est supérieure ou égale à 55nmol/L

- Si l’enfant est né après 36.1 semaine de gestation et que sa valeur est supérieure ou égale à 25nmol/L.

Le résultat est également positifs si :

- Si le nouveau-né pèse à sa naissance moins de 2100 g et si sa valeur est supérieure à 105nmol/L.

- Si le nouveau-né pèse à sa naissance entre 2101 et 2500 g et si sa valeur est supérieure à 55nmol/L.

- Si le nouveau-né pèse à sa naissance entre 2501 et 2700 g et si sa valeur est supérieure à 25nmol/L

- Si le nouveau-né pèse à sa naissance plus de 2700 g et si sa valeur est supérieure à 25 nmol/L.

Pour l’enzyme de trypsine (1er dosage) :

- Si la concentration d’IRT est inférieure à 70ng/ml, le résultat est négatif. Rien à faire.

- Si la concentration d’IRT est supérieure ou égale à 70ng/ml, le résultat est positif. Informer le chef de laboratoire et refaire 1 fois.

Pour l’enzyme de trypsine (2ème dosage) :

- Si la concentration est toujours positive. Informer le responsable de laboratoire.

- Si la concentration change et devient négative. Le résultat devient douteux et la décision revient au responsable de laboratoire.

Pour l’enzyme de trypsine (carte de contrôle, 2ème dosage) :

- Si le résultat de la concentration est inférieure 60ng/ml, le résultat est négatif. Ne rien faire.

- Si le résultat de la concentration est supérieur ou égale à 60ng/ml, le résultat est positif. Informer le chef de laboratoire et refaire 1 fois

9.2 Test colorimétrique

Il existe 3 types de patients :

- Si le patient possède un pourcentage inférieur à 3%, il est positif, il est nécessaire d’avertir le responsable de laboratoire et refaire le test 3 fois.

- Si le patient possède un pourcentage égal ou entre 3 et 30%, il entre les deux. C’est pourquoi il est nécessaire de refaire 3 fois ce test et d’avertir le chef du laboratoire.

- Si le patient possède un pourcentage égal ou supérieur à 30%, le patient est négatif donc en bonne santé. Inutile d’avertir le chef de laboratoire.

10. Résultats

Avant de détailler les résultats, il est important de faire la description de chaque page. (Voir annexes) Page 1 : La page 1 est consacrée aux concentrations des échantillons standards. Page 2 : Sur la page 2, présence de la courbe standard. En fonction des fluorescences et des concentrations de ses échantillons standards. « Iterations » veut dire le nombre de fois que le programme de calcul a pris pour réaliser la courbe. Ensuite, il y’a la liste du jour qui montre la concentration d’hormones ou d’enzymes de chaque patients. Regarder la colonne « PAT ». A la fin de la liste du jour, il y’a le point « samples » qui montre si les valeurs des échantillons contrôles basses et moyennes sont comprises dans les valeurs cibles. Pour finir il y’a différent graphiques consacrés aux échantillons contrôles.

10.1 Hormone de stimulation thyroïdienne

10.1.1 Contrôles internes et externes

Les concentrations des échantillons contrôles (Médium) sont beaucoup plus élevés que leurs valeurs cibles 25, 73, 169. Cela dépend du lot, ce n’est pas toujours le cas. Pour les échantillons standards, les concentrations sont bonnes. (Voir Annexe 1)

10.1.2 Résultats élevés et Blood Spot Possibly Missing (BSPM).

Les résultats élevés se trouvent dans les échantillons 64,89, et 141. Ce jour-là, pas de résultats blood spot possibly missing (BSPM) pour cette analyse. Si les résultats sont BSPM cela veut dire que la tache de sang est peut être manquante.

10.1.3 Calcul de concentrations (Courbe standard)

Pour le calcul de la concentration d’hormone de TSH, il est nécessaire d’avoir les échantillons standards de TSH. Les échantillons standards sont des pastilles de sang séché sur papier buvard avec des concentrations connues et différentes. Dans le graphique, l’axe des ordonnées sera l’axe de la fluorescence et l’axe des abscisses sera l’axe de la concentration dont l’unité sera µU/mL.

10.2 Hormone 17α hydroxyprogestérone

10.2.1 Contrôles internes et externes

Les concentrations des échantillons contrôles sont comprises dans les valeurs cibles. Pour les échantillons standards, les concentrations sont bonnes.

10.2.2 Résultats élevés et Blood spot possibly missing (BSPM).

Les résultats élevés se trouvent dans les échantillons 10 ,11 ,96 ,98 ,137 ,140 ,156 ,189 ,190 ,191 et 217. Les résultats BSPM se trouvent dans les échantillons 56, 59, 140, 161, 162 et 186. Ces résultats sont uniquement valables pour cette journée. Les résultats changent tous les jours. (Voir annexes 2).

10.2.3 Calcul de concentration (courbe standard)

Pour le calcul de la concentration des hormones de 17 OHP, il est nécessaire d’avoir les standards 17 OHP, ce sont des pastilles de sang séché sur papier buvard dont on connaît la concentration. Elles sont importantes car elles vont représenter la courbe dans le graphique et l’axe des ordonnées sera l’axe de la fluorescence et l’axe des abscisses sera l’axe de la concentration dont l’unité sera nmol/L.

10.3 Enzyme de trypsine

10.3.1 Les contrôles internes et externes

Les concentrations des échantillons contrôles sont comprises dans les valeurs cibles. Pour les échantillons standards, les concentrations sont bonnes. (Voir annexe 3).

10.3.2 Résultats élevés et Blood spot possibly missing (BSPM)

Ce jour-là, il n’y avait pas de résultat élevé ni de BSPM.

10.3.3 Calcul de concentration

Pour le calcul de la concentration d’hormone IRT, il est nécessaire d’avoir la fluorescence et d’avoir les standards IRT. Elles sont importantes car elles vont représenter la courbe. Dans le graphique, l’axe des ordonnées sera l’axe de la fluorescence et l’axe des abscisses sera l’axe de la concentration dont l’unité sera ng/mL.

10.4 Enzyme de biotinidase

La feuilles des résultats se présente différemment que les autres. En effet, il n’y a que les échantillons standards qui sont utilisés. Le graphuique est lui aussi différent, sur l’axe des ordonnées il y a la coloration et sur l’axe des abscisses les concentrations.

10.4.1 Contrôles des standards

Les échantillons standards sont bien réalisés car les concentrations sont bonnes.

10.4.2 Le graphique

La courbe du graphique touche bien les points des échantillons standards. (Voir annexe 4)

11. Discussions

11.1 Hormone de stimulation thyroïdienne

Lors de cette journée, les concentrations des échantillons contrôles étaient très élevées. Cela a dû être possible à cause d’un mauvais découpage et ou d’un mauvais choix de carte de contrôle. La courbe standard ne passe pas par tous les points. Le graphique a dû être refait cinq fois (ITERATIONS). Un peu plus de concentration et de rigueur pour obtenir meilleur résultats. De manière générale, les résultats étaient différents chaque jour, ce qui est normal vu que ce sont des échantillons provenant de nouveaux nés différents.

11.2 Hormone 17α hydroxyprogestérone

Lors de cette journée, les concentrations des échantillons contrôles sont comprises dans les valeurs cibles. En ce qui concerne la courbe standard, les passe bien par tous les points standards. La courbe est décroissante ce qui est normal. La courbe a été refaite quatre fois (ITERATIONS) avant la version finale. Dans cette analyse, il y a présence de blood spot possibly missing. Cela est surement dû à un mauvais découpage ou la carte n’était pas conforme. Etre plus assidu au travail. De manière général, les résultats n’étaient jamais les mêmes.

11.3 Enzyme de trypsine

Lors de cette journée, les concentrations des échantillons contrôles sont comprises dans les valeurs cibles. Tandis que sur la courbe standard, seul un point n’est pas touché par la courbe. La courbe a été refaite deux fois (ITERATIONS). Ce jour-là, il n’y avait pas de résultats élevés ni de BSPM. Présence de C.D.C (Center of Disease Control). Lors du stage, l’utilisation des C.D.C ne se faisait que le lundi. Les C.D.C sont spécifiques selon le type de d’hormones ou d’enzymes analysés. Il existe également différents types de C.D.C mais celui utilisé était le (QC C.D.C) contrôle externe. Comme précédemment, de manière général les résultats n’étaient jamais les mêmes.

11.4 Enzyme de biotinidase

Les valeurs des échantillons sont bonnes. Le graphique est correct. De manière générale, il a fallu plusieurs jours de manipulation pour obtenir des aussi bons résultats. Il faut être précis, rapide et méthodique pour réaliser ce test.

12. Conclusion

Les dépistages néonatals sont très importants. En effet, ces tests peuvent prévenir des maladies à laquelle les nouveaux nés sont atteints. Cela permet un suivi et un traitement le plus rapidement possible pour la bonne santé du bébé.

13. Reference

1. http://www.technobio.fr/article-18589062.html

2. http://www.technobio.fr/article-18589062.html

3. http://www.technobio.fr/article-18589062.html

4. Perez-Martin A. (2006) : Physiologie de la glande thyroïdienne. Cours du département de Physiologie, Nîmes.


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