Structure et fonction des protéines








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titreStructure et fonction des protéines
date de publication21.11.2017
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Correction exercices de biologie
Structure et fonction des protéines 
1. Modulation de l’activité de l’ATP synthase par l’inhibiteur naturel IF1.


  1. Pourquoi faut-il que l'activité de l'ATP synthase soit bloquée dans la cellule lorsque la force motrice s'annule ?

Grâce à l’ATP synthase, l’énergie libre du gradient de proton transmembranaire est convertie en énergie chimique sous la forme de la phosphorylation de l’ADP en ATP. L’ATP synthase est un catalyseur, et peut donc également catalyser la réaction contraire : l’hydrolyse de l’ATP en ADP et Pi avec production d’un gradient de proton. En absence d’oxygène, l’activité catalysée par l’ATP synthase contriburait ainsi à une déperdition d’énergie pour la cellule. Il est donc nécessaire d’en bloquer l’activité. De nombreuses cellules peuvent ainsi survivre plusieurs heures en absence d’oxygène.


  1. Expliquez la forme de la courbe de titration de IF1 sauvage et mutée. A quel pH ces protéines sont elles neutres (charge globale nulle) ?

La forme de la courbe charge(pH) de la protéine est expliquée par la titration successive des fonctions acide-base des acides aminés. Prenons l’exemple de IF1 sauvage. A pH très acide, les amines sont chargées positivement, il y a donc 24 charges positives :

    • NH3 terminal : 1 charge

    • Arg : 8 charges

    • Lys : 10 charges

    • His : 5 charges

Lorsque le pH dépasse le pKa du COOH terminal, 1 charge négative apparaît. Idem pour l’Asp et Glu : 5 et 13 charges négatives. Donc au-delà de pH 5, la charge sur la protéine n’est plus que de +5. Lorsque le pH dépasse le pKa de l’histidine, 5 charges positives disparaissent : la protéine est donc neutre à pH 7, c’est le point isoélectrique. La transition suivante a lieu à pH 9,69 (1 charge positive du NH3 terminal qui disparaît) et pH 10 (1 charge négative Tyr apparaît) et pH 10,5 (10 charges positives Lys qui disparaissent). La charge sur la protéine est donc –12 à pH 11. La dernière transition concerne les 8 Arg, qui amènent la charge de la protéine à –20.

Pour le mutant 1F1-H59K, une charge positive reste après neutralisation des histidines. Le point isoélectrique est donc déplacé vers pH 9.


  1. Que suggère l'effet de la mutation H59K sur la nature physico-chimique de l'interaction entre la protéine IF1 et l'ATP synthase ? Quelle autre mutation proposeriez-vous de faire pour tester votre hypothèse ?

La protéine IF1 sauvage se lie à l’ATP synthase pour des pH inférieurs à 6,5, et ne l’inhibe pas pour des pH supérieurs. Lorsque l’histidine 59 est mutée en lysine, la protéine IF1 se lie jusqu’à pH 8,5. Il est donc possible que l’interaction entre IF1 et l’ATP synthase soit de nature électrostatique, avec une charge positive sur IF1 (l’histidine 59) et une charge négative sur l’ATP synthase. La mutation H59K stabilise l’interaction entre IF1 et l’ATP synthase jusqu’à pH 8,5 (mais pas au-delà ?). Une mutation H59A, H59E ou H59D devrait empêcher l’interaction de IF1 avec l’ATP synthase.


  1. La concentration de la protéine IF1 nécessaire pour inhiber 50% de l’activité de l’ATP synthase est 0,27 M. Quelle est l’énergie mise en jeu dans l’interaction entre ces deux protéines ?

G = - RT ln K = 1,4 log (0,27.10-6) = - 9,2 kcal/mole
2. Energie de liaison


  1. Quelle est la durée de vie maximale de l'état lié AChR-ACh ? A partir des formules théoriques sur l’équilibre protéine-ligand, calculer l'énergie libre d'interaction maximale entre l'AChR et son ligand ?

Durée de vie maximale = 1/ fréquence de répétition = 0,2 msec

koff > 5000 s-1

kon < 5.108 M-1.s-1

G = - RT lnK = 1,4 log (koff/ kon) > -8,4 kcal/mole


  1. A partir des valeurs indiquées dans la partie « interactions faibles en biologie » du cours, estimer l'énergie libre maximale disponible pour des interactions entre l'ACh et son récepteur? Conclure.

type de liaison

nombre

énergie

total

Electrostatique(1)

1

3,5

3,5

liaison H(2)

4

5

20

van der Waals(3)

26

0,5

13

interaction hydrophobe(4)

6

0,5

3



















TOTAL

39,5




  1. On suppose que la charge positive interagit avec une seule charge négative

  2. Il y a deux doublets libres, donc deux liaisons H possibles par oxygène.

  3. Il faut compter tous les atomes

  4. Il faut compter tous les carbones hydrophobes CH2 et CH3.


3. Une protéine élastique 


    1. A quoi correspond la distance entre deux pics de force maximale ?

La longueur de la chaîne polypeptidique étirée :

250 Å/ 110 acides aminés = 2,3 Å/acide aminé

ce qui est tout à fait vraisemblable pour ces molécules d’une dizaine d’atomes.


    1. Quelle est l’énergie mécanique dépensée d’un pic au pic suivant ?

L’énergie mécanique est calculée en intégrant la force le long du déplacement. C’est approximativement un rectangle surmonté d’un triangle :

W = 500 pN * 250 Å + (1500 pN * 100 Å)/2 = 2.10-17 J


    1. En déduire l’énergie interne contenue par acide aminé dans un domaine replié de cette protéine.

L’énergie mécanique nécessaire pour déplier la protéine est égale à l’énergie interne du domaine protéique :

Waa = 2.10-17 J / 110 = 1,8.10-19 J

En faisant le calcul pour une mole de protéine, on trouve l’énergie par mole d’acide aminé:

Waa =1,8.10-19 J * 6. 1023 /4180 = 26 kcal/mole.aa

Ce qui est assez élevé, mais vraisemblable : dans un feuillet , chaque acide aminé fait une liaisons H avec ses voisins soit environ 7 kcal/mole, il y a en plus les interactions de van der Waals, hydrophobes, électrostatiques.

Les membranes et la compartimentation cellulaire

4. Endocytose chez D.discoideum


  1. A quoi sert le Triton X-100 ? Pourquoi faut-il centrifuger les cellules plusieurs fois? Quel(s) phénomène(s) cellulaire(s) met-on en évidence par cette expérience ?

Le Triton X-100, un détergent, solubilise les membranes et libère la pyranine. Cela permet de contrôler les conditions physico-chimiques comme le pH qui affectent la fluorescence de la pyranine.

A chaque cycle de centrifugation et d’élimination du surnageant, un volume faible mais non négligeable de surnageant reste avec le culot. Plusieurs cycles sont nécessaires pour diluer assez la fluorescence non internalisée. Par exemple, au bout de 5 min, les cellules contenues dans 1 ml ont internalisé l’équivalent de 0,1 l de milieu. S’il reste 20 l au fond du tube de 1 ml après élimination du surnageant, on voit qu’il faut faire 3 lavages pour pouvoir mesurer 0,1 l :

Premier lavage : il reste 20 l de la solution initiale de pyranine sur 1 ml, soit 1/50

Deuxième lavage : il reste 0,4 l de la solution initiale de pyranine, c’est trop

Troisième lavage : il reste 0,008 l de la solution initiale de pyranine.

On met en évidence l’endocytose de phase fluide (pinocytose). C’est une endocytose sans récepteur de surface. Elle permet à D. discoideum de se nourrir des molécules (sucres, acides aminés) contenues dans le fluide environnant.


  1. Quel est le volume de fluide ingéré par minute ? Les vésicules d'ingestion sont de taille 1,6 m, quel est le nombre de vésicules d'ingestion créées par minute ? Par microscopie, on observe environ 10 vésicules d'ingestion par cellule. Quelle est la durée de vie de ces vésicules ?

Volume ingéré par cellule et par minute = (1.1 10-6 l)/(1.5 106 cellules x 60 min) = 12 fl/cellule.min

Note : le fl = 10-15 l = 1 m3 est une unité commode à l’échelle de la cellule.

Volume d’une vésicule de 1,6 m de diamètre = 4/3 (0,8)3 = 2,1 fl

Nombre de vésicules créées par minute = 12/2,1 = 5,7 vésicules/min

Durée de vie des vésicules = 10/5,7 = 1,75 minute soit 105 secondes


  1. Le volume cellulaire de D.discoideum est de 350 fl. Comparer au volume maximal de fluide ingéré par la cellule. Que peut-on en déduire ?

Volume maximal ingéré par cellule = (1.4 10-6 l)/(1.5 106 cellules) = 930 fl/cellule

Comme le volume des cellules ne change pas au cours de l’expérience, il faut en déduire que les cellules peuvent concentrer le fluide ingéré en expulsant l’eau. De plus, la saturation apparente du volume ingéré correspond à une exocytose de la pyranine, qui, non digérée, est rejetée par la cellule au bout de 100 minutes environ. La quantité maximale ingérée est donc le résultat de la vitesse d’endocytose et la durée de résidence intracellulaire.
5. Hélices amphiphiles
1. Repérer les charges présentes et les gros (> 4 carbones) acides aminés hydrophobes le long de ces peptides. Quel est l'effet de la modification de l'acide aminé terminal?
Acides aminés hydrophobes : M, L, I , Y, F, W en vert

Acides aminés chargés positivement : R, K, H en rouge

Acides aminés chargés négativement : D, E en bleu

L’acide aminé N-teminal porte aussi une charge positive NH3+

L’acide aminé C-terminal ne porte pas de charge négative à cause de l’amidation du COOH

Par.id: +INWKKMAATALKMI

Pol.ja: +VDWKKIGQHILSVL

Ves.ba: +LKLKSIVSWAKKVL

Ves.cr: +LNLKALLAVAKKIL

Ves.le: +INLKALAALAKKIL

Ve.ma: +INLKAIAALAKKLL

Ves.or: +INLKAIAALVKKVL

Ves.xa: +INWKGIAAMAKKLL
2. Schématiser la position des chaines latérales des acides aminés chargés et des gros acides aminés hydrophobes tout autour de l'hélice alpha.
exemple avec la première séquence : +INWKKMAATALKMI

On voit que les acides aminés hydrophobes sont majoritairement groupés d’un même côté de la molécule (positions 3, 6, 7) et les acides aminés chargés positivement de l’autre (positions 1, 4, 5). Sous cette conformation, le mastoparan pourra donc interagir favorablement avec les charges négatives et les domaines hydrophobes des phospholipides membranaires.
6. Transport actif à travers les membranes


  1. Quel est le gradient de concentration maximum qui peut être atteint par un transport actif, fonctionnant grâce à l’ATP, d’une molécule non chargée comme le glucose vers l’intérieur de la cellule, en supposant que le transport d’une molécule de soluté s’accompagne de l’hydrolyse d’un ATP ?

Le gradient est maximal si la variation d’énergie libre totale est nulle :

GATP + Gtransport = 0

On trouve log(Ce/Ci) = -GATP/ 2,3 RT = 8,5

Donc Ce/Ci = 3,2 108

Note : 2,3 RT = 1,41 kcal/mole


  1. Quel est le gradient de concentration maximum qui peut être atteint par transport actif de Ca2+ de l’intérieur vers l’extérieur de la cellule sous les mêmes hypothèses que précédemment ?

De la même manière,

log(Ce/Ci) = - (GATP + 2 FV)/2,3 RT = 6,54

Donc Ce/Ci = 3,5 106

Note : la membrane est chargée négativement à l’intérieur, le transport de Ca2+ vers l’extérieur est donc défavorable. V = - 0,06 volts.


  1. Calculez l’énergie nécessaire pour faire fonctionner la pompe Na+-K+. En déduire le rendement de la pompe Na+-K+.


Lorsque la pompe fonctionne pour chaque mole d’ATP hydrolysée, 3 moles de Na+ sont transportées vers l’extérieur :

GNa = 3[2,3 RT log(Ce/Ci) – FV] = 9 kcal/mole

tandis que 2 moles de K+ sont transportées vers l’intérieur :

GK = 2[2,3 RT log(Ce/Ci) + FV] = 1,33 kcal/mole

Rendement de la pompe = (GNa + GK)/GATP = 86 %

Les acides nucléiques et le code génétique
7. Un gène, deux protéines 


  1. Traduire cette séquence en polypeptide, suivant les trois cadres de lecture.

GGG TAT CTT TGA CTA CGA C

gly tyr leu * leu arg

gly ile phe asp tyr asp

val ser leu thr thr


  1. Expliquez ce qui s’est passé lors de la traduction de cet ARN messager.

Protéine tronquée : la séquence s’arrête à la leucine 25. le codon Stop TGA est correctement interprété.

Protéine complète : changement de cadre de lecture (+1) au niveau du T du codon TGA :

GGG TAT CTT TGA CTA CGA C

gly tyr leu * leu arg

gly ile phe asp tyr asp

val ser leu thr thr

  1. Expliquez comment la synthèse de RF2 est auto-régulée.

La protéine RF2 complète permet d’arrêter la synthèse d’une chaîne polypeptidique au niveau d’un codon TGA. Lorsque RF2 est présente dans la cellule, elle ne permet donc que la synthèse de la protéine tronquée, inactive. Lorsque RF2 n’est plus présente dans la cellule, le codon stop TGA n’est pas lu et le ribosome avance d’une base, conduisant à la synthèse de la protéine complète. De la sorte, une quantité de protéine RF2 complète faible est constamment maintenue dans la cellule.
8. Empreinte sur ADN ou « DNA footprinting »


  1. A quelle séquence de l’ADN la protéine se lie-t-elle ? Quelle est la particularité de cette séquence ?

Les fragments radioactifs générés par coupure aléatoire de la séquence :

5’TTATTTTATTTTCGAGTAATTCGACCGGTCGTTAAACGCGAAACTTCACTTAAC..3’

sont :

5’T

5’TT

5’TTA

5’TTAT … etc…

En présence du facteur de transcription, les coupures entre les bases 22 et 32 n’apparaissent plus. La protéine se lie donc à l a séquence 22-32 :

22GACCGGTCGT32

Cette séquence est largement palindromique : 21CGACC GGTCG32


  1. En supposant que la protéine soit un dimère, quelle est la longueur approximative du domaine monomérique interagissant avec l’ADN ?

La distance entre bases successives le long de l’ADN est de 3,4 Å, la longueur du domaine monomérique est donc 5 x 3,4 Å = 17 Å
9. Préférences de codons 


  1. Pour chaque acide aminé, repérez les deux codons les plus employés et les deux codons les moins employés par chacun des organismes.

Codons les plus employés en vert,

Codons les moins employés en rouge :
Organisme : D.discoideum E.coli T.thermophilus

Codons :

ARG CGA 1 5 3

CGC 0 38 38

CGG 0 8 40

CGT 43 44 2

AGA 54 3 1

AGG 2 2 16
LEU CTA 2 3 2

CTC 16 10 45

CTG 0 56 34

CTT 15 10 10

TTA 55 10 0

TTG 12 11 9
SER TCA 46 11 0

TCC 8 17 46

TCG 1 14 10

TCT 25 19 8

AGC 2 26 36

AGT 18 13 0


  1. Quelles sont les caractéristiques des codons préférés ou évités par D. discoideum, E. coli et T. thermophilus ? Comment interprétez vous les préférences différentes de ces trois organismes ?

Pour l’arginine, les codons préférés par D. discoideum sont CGT et AGA, les codons les plus riches en A,T tandis que les codons préférés de T. thermophilus sont CGC et CGG, les codons les plus riches en C, G. Pour les codons évités, c’est le contraire. E. coli est intermédiaire.

Pour la leucine, le codons préféré par D. discoideum est TTA, le codon le plus riche en A,T tandis que les codons préférés de T. thermophilus sont CTC et CTG, les codons les plus riches en C, G. Pour les codons évités, c’est le contraire, à l’exception de CTA qui n’es guère utilisé par ces organismes.

Pour la serine, les codons préférés par D. discoideum sont TCA et TCT, les codons les plus riches en A,T tandis que les codons préférés de T. thermophilus sont TCC et AGC, parmi les codons les plus riches en C, G. Pour les codons évités, c’est le contraire. E. coli est intermédiaire.

Ces trois organismes vivent à des températures différentes : 21°C pour D. discoideum, 37°C pour E.coli et 80°C pour T. thermophilus. La stabilité de la structure de leur ADN, ou la fidélité de la traduction protéique requiert donc une stabilité croissante de leurs séquences codantes. Celle-ci est assurée par le nombre croissant de liaisons inter-brins C-G, plus stables que les liaisons A-T.

Note : ces différences sont très importantes pour les techniques de biologie moléculaire, comme la conception d’amorces de PCR et la température d’extension.


  1. Quels seront les codons glycine préférés par chacun de ces trois organismes.

Organisme : D.discoideum E.coli T.thermophilus

Codons :

GLY GGT ++ + --

GGA ++ + --

GGC -- + ++

GGG -- + ++
10. Sur-répression de l'opéron lac
génotype inducteur phénotype
E. coli sauvage - pas d’expression de -gal

+ expression de -gal

mutant E. coli - pas d’expression de -gal

+ pas d’expression de -gal

mutant E. coli + épisome F - pas d’expression de -gal

+ pas d’expression de -gal
Comme l’épisome F n’est pas fonctionnel dans le mutant, alors qu’il possède opérateur et partie codante du gène de la -galactosidase, c’est que le répresseur exprimé dans le mutant ne répond pas à l’inducteur. Le site de liaison de l’inducteur est inactif et le répresseur reste lié à l’ADN.
11. Génotypage de polymorphismes humains


  1. En utilisant le code génétique, traduisez la séquence des variants A et C en séquence d'acides aminés. La base -14 sera utilisée comme origine de la traduction. Quelle est la différence entre les variants au niveau de la protéine produite ?

Variant A :

CTT CGA GAG AGT TGA ACA GAT TCC TGG AAG

leu arg glu ser * thr asp ser trp lys

Variant C :

CTT CGA GAG AGT TGC ACA GAT TCC TGG AAG

leu arg glu ser cys thr asp ser trp lys

Le variant A code pour une protéine tronquée, le variant C pour une protéine complète.


  1. Sur la grille A, repérez les plots qui portent des séquences exactement complémentaires de la séquence du variant A. Repérez ensuite les plots qui portent des séquences exactement complémentaires de la séquence du variant C. Faire de même avec la grille C.

Plots exactement complémentaires du variant A en rouge

Plots exactement complémentaires du variant C en vert
Grille A -3 -2 -1 0 +1 +2 +3

T
G
C
A

Grille C -3 -2 -1 0 +1 +2 +3

T
G
C
A


  1. Quels sont les génotypes des individus 1, 2 et 3 vis-à-vis des variants A et C du gène Phelma

Individu 1 : homozygote variant A

Individu 2 : hétérozygote variant A/variant C

Individu 3 : homozygote variant C

Régulation des mécanismes de réparation de l’ADN





  1. Comment désigneriez-vous le rôle joué par les protéines RecA et LexA dans ce processus ?

RecA : récepteur de dommage à l’ADN (détecte l’ADN simple brin)

LexA : facteur de transcription négatif ou répresseur


  1. Quel avantage voyez-vous à ce que l’expression de lexA soit maximale pendant la réponse SOS ?

Elle permet un retour rapide aux conditions initiales (inhibition de la synthèse des gènes SOS) lorsque la réparation de l’ADN est terminée.


  1. En quoi consiste la réponse SOS ? Quel avantage confère-t-elle aux bactéries dont l’ADN est lésé?

La réponse SOS augmente le taux de mutation dans le génome des bactéries (x 400). Cela confère un avantage adaptatif aléatoire aux bactéries (x 10). Les mutants résistants aux nouvelles conditions du milieu sont sélectionnés.
Enzymologie
12. Contrôle de l'activité enzymatique par rétroaction du produit
a. Déterminer approximativement les Km et Vmax pour l'UTP et le G1-P.




Vmax = 0,4 moles/min KM = 100 M





Vmax = 1,0 moles/min KM = 34 M
b. Quel type d'inhibition, vis à vis de l'UTP, l'UDP-glucose exerce t-il sur l'UGPP ?





Le Vmax est inchangé, le KM augmente, l’inhibition est compétitive.
c. Quel effet cela a-t-il sur l'avancement de la réaction catalysée par l'enzyme ?
L’inhibition de l’enzyme par son produit de réaction permet de stabiliser la concentration d’UTP-glucose en modulant le flux de conversion du glucose 1-phosphate en UDP-glucose.
13. Autoclivage de la protéine Hedgehog


  1. Quel type de structure secondaire constitue l’essentiel de la structure de Hedgehog ?

Feuillets .


  1. Quel type de liaison pourrait relier la chaîne polypeptidique au niveau de la cystéine 258 à la thréonine 326 ou l’histidine 329 ?

Liaisons H

  1. Quels rôles semblent jouer l’aspartate 303, la thréonine 326 et l’histidine 329 dans l’autoclivage de Hedgehog ?

Les mutants T326A et H329A présentent une activité auto catalytique très réduite, la thréonine 326 et l’histidine 329 participent donc vraisemblablement à la catalyse du clivage.

Le mutant D303A au contraire, présente une activité auto catalytique plus importante que la protéine sauvage, et le clivage de la protéine en fragments de 7 et 25 kDa a lieu même à 1 mM de DTT. L’aspartate 303 joue donc probablement un rôle dans la régulation du clivage de Hedgehog.

Techniques biologie moléculaire

14. Extrémités cohésives compatibles 


  1. Représenter les fragments d’ADN générés par chacune des deux enzymes de restriction au voisinage du site de clivage.

Coupure par BglII :

séquence initiale fragments générés

5’XXXAGATCTXXX3’ 5’XXXAGATC et TXXX3’

3’xxxTCTAGAxxx5’ 3’xxxT CTAGAxxx5’

fragment 1 fragment 2

Coupure par BamHI :

séquence initiale fragments générés

5’ZZZGGATCCZZZ3’ 5’ZZZGGATC et CZZZ3’

3’zzzCCTAGGzzz5’ 3’zzzC CTAGGzzz5’

fragment 3 fragment 4


  1. Montrer qu’il est possible de réaliser une ligation entre ces deux sites.

On peut réaliser une ligation entre les fragments 1 et 4, ou 2 et 3 car leurs extrémités sont cohésives. Le résultat de ces ligations génère les séquences :

5’XXXAGATCCZZZ3’ et 5’ZZZGGATCTXXX3

3’xxxTCTAGGzzz5’ 3’zzzCCTAGAxxx5’


  1. Les sites des restrictions sont-ils conservés après ligation ?

Non.


  1. Mêmes questions pour les enzymes de restriction HindIII et SacI, dont voici les sites :

HindIII : 5’-A*AGCTT-3’ SacI : 5’-GAGCT*C-3’

Coupure par HindIII:

séquence initiale fragments générés

5’XXXAAGCTTXXX3’ 5’XXXA et AGCTTXXX3’

3’xxxTTCGAAxxx5’ 3’xxxTTCGA Axxx5’

fragment 1 fragment 2

Coupure par SacI :

séquence initiale fragments générés

5’ZZZGAGCTCZZZ3’ 5’ZZZGAGCT et CZZZ3’

3’zzzCTCGAGzzz5’ 3’zzzC TCGAGzzz5’

fragment 3 fragment 4

Les extrémités des fragments générés ne sont pas cohésives. La ligation n’est donc pas possible.
15. Technique du gel-retard 


  1. Expliquer l’origine des bandes de migration plus lente.

Des protéines contenues dans l’extrait cellulaire se lient au fragment d’ADN et retardent sa migration dans le gel.

  1. Quelle peut être la fonction des protéines présentes dans les complexes C1-C6 ?

Ces protéines peuvent être des facteurs de transcription, c’est-à-dire des protéines qui contrôlent l’expression des gènes. Ce pourrait aussi être des protéines qui réparent ou répliquent l’ADN.

  1. Quelles sont les fractions contenant la protéine ayant la plus haute affinité pour l’ADN?

Ce sont les fractions aux concentrations protéique les plus faibles, C2 et C6.

  1. Parmi C1-C6, quel est le complexe de plus faible poids moléculaire ?

C’est le complexe qui retarde le moins l’ADN, celui de la fraction C6.


16. PCR inverse


  1. Ecrivez le début de la séquence protéique encodée par le vecteur pQE30 ::Master2, dans le code protéique à une lettre.

ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCC ATG GCC AGC ACT GAA CGA

M R G S H H H H H H G S M A S T E R


  1. Quelle sera la séquence protéique encodée par le vecteur pQE30 ::Master2 modifié ? A votre avis, quel est l’intérêt de cette modification ?

M R G S H H H H H H G S D D D D K M A S T E R
La protéine Master2 produite par la séquence codée par le vecteur pQE30 ::Master2 modifié sera purifiée sur une colonne Ni-NTA. En faisant agir l’entérolysine, on libérera la protéine après la séquence DDDDK , c’est-à-dire la protéine Master2 pure sans étiquette de purification. L’étiquette de purification peut en effet empêcher la fonction de la protéine ou sa cristallisation.


  1. Ecrivez une séquence codante possible pour le vecteur pQE30 ::DDDDK-Master2.

ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCC GAT GAC GAT GAC AAA ATG GCC

M R G S H H H H H H G S D D D D K M A

AGC ACT GAA CGA

S T E R


  1. Quel est le résultat d’une PCR faite avec les primers suivants :


5’




5’

3’









3’

Orientation 1 Orientation 2
Dans l’orientation 1, le primer situé « au-dessus » s’hybride avec le brin « intérieur » du plasmide et permet l’extension du brin « extérieur » (). De même, le primer situé « en-dessous » s’hybride avec le brin « extérieur » du plasmide et permet l’extension du brin « intérieur » ().
 brin extérieur  brin intérieur



Le produit de PCR est un plasmide linéaire :


Dans l’orientation 2, les primers sont dessinés dans le mauvais sens, puisque leur orientation est définie par le brin dont ils sont issus. Le dessin correct est donc :


3’


La PCR se fera entre le primer 5’ (au-dessus) et le primer 3’ (en-dessous) et le produit de PCR comprendra la petite séquence du plasmide comprise entre les deux primers :






Cette PCR n’a donc aucun intérêt !


  1. Montrez que l’on peut ainsi construire le vecteur pQE30 ::DDDDK-Master2 à partir du vecteur pQE30 ::Master2 et énumérer les opérations nécessaires.

La position du site BamHI où est insérée la séquence codant pour la protéine Master est repérée par le trait rouge. Les primers se recouvrent en 5’ au niveau de ce site repéré par le signe . On peut se servir du primer 5’ défini sur le brin « extérieur » du plasmide pour introduire la séquence codant pour DDDDK.





5’

3’






La PCR donnera le plasmide linéaire suivant :


Après digestion avec l’enzyme de restriction BamHI, le plasmide possède des extrémités cohésives :


Après ligation, le plasmide est formé de la séquence de pQE30::Master2 à laquelle est ajoutée la séquence codant pour DDDDK, insérée après le site BamHI.

5’

3’


On obtient ainsi le plasmide pQE30 :: DDDDK-Master2.


  1. Ecrire la séquence d’un couple de deux primers qui permettent de réaliser cette PCR

Séquence du plasmide désiré pQE30 :: DDDDK-Master2 :

Primer 5’

ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCC GAT GAC GAT GAC AAA ATG GCC

TAC TCT CCT AGC GTA GTG GTA GTG GTA GTG CCT AGG CTA CTG CTA CTG TTT TAC CGG

 Primer 3’

M R G S H H H H H H G S D D D D K M A
AGC ACT GAA CGA

TCG TGA CTT GCT
S T E R
Les trois bases en 5’ des primers ont été rajoutées pour faciliter le clivage par l’enzyme BamHI. Le site de restriction BamHI est indiqué en rouge. Le primer 3’ est écrit dans le sens conventionnel, de 5’ vers 3’.
Primer 5’ : CAC GGA TCC GAT GAC GAT GAC AAA ATG GCC AGC ACT GAA CGA

Primer 3’ : ATC GGA TCC GTG ATG GTG ATG GTG ATG CGA TCC TCT CAT

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