Adresse : Faculté de Médecine Xavier Bichat, Université Paris 7-Sorbonne Paris cité, 16 rue Henri Huchard, 75018 Paris








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INGENIEUR D’ETUDE




ETABLISSEMENT : Unité INSERM U1149


Direction : Pr Renato Monteiro


Direction d’équipe : Pr Laurent Gouya/Pr H. Puy
Direction de groupe : Pr Lydie Da Costa


Unité : INSERM U1149
Intitulé de l’unité : Equipe « Fer, hème et pathologies inflammatoires »


Fiche rédigée le : 18/04/2016

Adresse :
Faculté de Médecine Xavier Bichat, Université Paris 7-Sorbonne Paris cité, 16 rue Henri Huchard, 75018 Paris
Accès par :

  • le bus - Arrêts "Faculté Xavier Bichat", "Gérard de Nerval", "Porte de Montmarte": R.A.T.P
    Bus n° : PC3 – 137 – 95 – 60 – 341 – 81

  • le métro - Station "Porte de Saint-Ouen" et "Porte de Clignancourt": R.A.T.P
    Lignes de métro N° 13 et 4





PERSONNES A CONTACTER

Nom , Fonction :

Lydie Da Costa, PU-PH, Chef de service « Hématologie Biologique » Hôpital Robert Debré, groupe de recherche sur l’anémie de Blackfan-Diamond
Adresse :

U1149

Faculté de Médecine Xavier Bichat,

Université Paris 7-Sorbonne Paris cité,

16 rue Henri Huchard,

75018 Paris

France
Privilégier cette adresse :

Service d’Hématologie Biologique

Hôpital R. Debré

48 boulevard Sérurier

75019 Paris

France

Tél (ligne directe) : (+33) 01-40-03-41-66

Tél (secrétariat) : (+33) 01-40-03-41-94
Fax : (+33) 01-40-03-47-95
Email : lydie.dacosta@aphp.fr
Merci d’envoyer CV, lettre de motivation, et lettre de recommandation si possible d’un encadrant


IDENTIFICATION DU POSTE

Fonction : Ingénieur d’étude


Grade : CDD de 3 ans au grade IE avec une période d’essai de 2 mois

Position dans la structure : Ingénieur d’étude dans un laboratoire de recherche INSERM, expérience requise en Culture Cellulaire et Biologie Moléculaire


Liaisons hiérarchiques :
Directeur du laboratoire : Pr R. Monteiro

Directeur d’équipe : Pr L. Gouya

Directeur de groupe : Pr L. Da Costa



Liaisons fonctionnelles :

  • Pr Laurent Gouya,

  • Gaël Nicolas, chercheur,

  • Sarah Rio, étudiante en 4ème de Thèse (soutenance en juin 2016)

  • Marc Gastou, étudiant en 3ème de Thèse

  • Autre étudiant en thèse à recruter pour 2016

  • Julie Galimand, technicienne, service Hématologie Biologique, hôpital Robert Debré, Paris 19ème,

  • Dr T. Leblanc, service d’onco-hématologie pédiatrique, Hôpital R. Debré, Paris 19ème.

  • Pr Pierre-Emmanuel Gleizes, Marie-Françoise O’Donohue, LBME, Université Paul Sabatier Toulouse

  • Dr Patrick Blader, Université Paul Sabatier Toulouse


Présentation de l’unité et de l'équipe :

  • U1149 est au sein de centre de la recherche de l’inflammation

  • Deux directeurs Pr L. Gouya/H. Puy

  • Deux chercheurs statutaires : G. Nicolas ; Z. Karim

  • Un AI statutaire : N. Ducrot

  • Des étudiants : Thèse X 3 ; 1 master 2

  • Des MCU-PH/PU-PH effectuant leur recherche dans cette unité : 5

Horaires de travail : - Du Lundi au Vendredi (voir parfois le weekend selon les impératifs de culture cellulaire) selon la réglementation en vigueur

MISSIONS DU POSTE

Missions Générales :

Assurer la mise au point, la réalisation, l’analyse et l’interprétation des expériences de culture cellulaire et de biologie moléculaire nécessaires à l’aboutissement du projet « anémie de Blackfan-Diamond- ANR générique 2015- DBAmultigènes» avec tout le professionnalisme requis et une rigueur exemplaire.


Missions Permanentes :

CULTURE CELLULAIRE :

  • Culture de progéniteurs érythroïdes à partir de cellules souches CD34+ périphériques ou issues de cytaphérèses ou issues de sang de cordons ou issues de moelle de patients.

  • Culture de lignées cellulaires (TF1, UT7, K562, …)

  • Tri cellulaire et utilisation du cytomètre


BIOLOGIE MOLECULAIRE :

  • Extraction et dosage d’ADN

  • PCR

  • QPCR

  • Extraction d’ARN,

  • Northern blots/Bioanalyzer avec analyse des profils des polysomes et de maturation des ARNr

  • RT PCR quantitative

  • RNAseq (externalisation) et étude transcriptomique

  • Constructions lentivirales de short hairpin ARN ou d’expression du cDNA sauvage ou muté, infection de cellules primaires et lignées

  • Clonage

  • Transfection de lignées cellulaires par différentes constructions plasmidiques

  • Séquençage NGS et Sanger et analyse de séquences

  • Préparation des échantillons de recherche pour séquençage d’exome (plateforme Imagine, Hôpital Necker) et analyse Bioinformatique

  • Analyse des échantillons de recherche passés en CGH/SNP array


BIOCHIMIE :

  • Western blots

  • Immunoprécipitation et co-Immunoprécipitation

  • Immunofluorescence et microscopie confocale, cytométrie sur l’Amnis (plateforme Imagine, Hôpital Necker)

  • Mesure de l’incorporation du S35 en autoradiographie, click methionine

  • Préparation des échantillons pour étude protéomique



PROJET


L’anémie de Blackfan-Diamond (ABD) est une érythroblastopénie congénitale rare (7 cas/an et par million de naissances vivantes) se révélant vers l’âge de 3 mois de vie par les signes de l’anémie à cet âge (pâleur, difficultés à la succion ou à la tétée, dyspnée, enfant inerte). L’ABD se caractérise par une anémie arégénérative, le plus souvent macrocytaire et dans 40% des cas par des malformations variées qui touchent préférentiellement l’aire céphalique et les extrémités notamment les pouces. On identifie le blocage de la différenciation érythroïde au passage des stades EPO-dépendant (BFU-e) au stade EPO-indépendant (CFU-e) d’où l’érythroblastopénie qui se définit par une absence ou moins de 5% de précurseurs érythroïdes au sein d’une moelle par ailleurs normocellulaire.

Dans 70% des cas, une mutation toujours hétérozygote est retrouvée dans un gène de protéine ribosomique (RP), avec 14 gènes identifiés jusqu’ici impliquant à la fois la petite et la grande sous unité ribosomique dont les principaux sont les gènes de la RPS19 (25% des cas), RPL5 (7%), RPL11 (5%), RPS10 (3%), RPS26 (7%), RPL35a (3%), et RPS24 (2,5%)…. L’ABD est considérée comme la première ribosomopathie. Dans les levures après inhibition de chacun des gènes de RPS19 ou dans des cellules fibroblastiques cutanées, ou dans des cellules lymphoblastoïdes infectées EBV issues de patients, le défaut en un gène de protéine ribosomique conduit à un défaut de maturation en ARN ribosomique (ARNr). En retour, un stress nucléolaire ou ribosomique est généré. Celui-ci conduit à une augmentation des RPL5, RPL11, RPS23, et RPS7 libres dans le nucléoplasme qui inhibent la liaison physiologique de la p53 à l’E3 ubiquitine ligase, HDM2. Nous avons pu montrer l’existence de 2 phénotypes in vitro selon le type de RP inhibée. Avec dans tous les cas, une diminution de la prolifération cellulaire, une activation de la p53 et un arrêt du cycle cellulaire et dans le cas d’une inhibition RPS19 une différenciation érythroïde normale et une absence d’apoptose alors qu’une inhibition RPL5 ou RPL11 s’accompagne d’un retard de différenciation érythroïde et une activation d’apoptose. Nous avons retrouvé ces 2 mêmes phénotypes dans les précurseurs érythroïdes de patients atteints d’ABD au cours de la différenciation érythroïde terminale (thèse Hélène Moniz-Koum, Cell Death and Dis, 2012, prix de la Société Française d’Hématologie en session plénière et prix (merritt award) de la société américaine d’Hématologie). Marc Gastou, étudiant en thèse en 3ème année a continué ce projet par l’identification de la protéine responsable de la survenue de ces deux phénotypes in vitro. Sarah Rio, étudiante en thèse en 4ème année a travaillé sur l’étude du métabolisme du fer et de l’hème au cours de l’anémie de Blackfan-Diamond. Le projet actuel « DBA-multigènes » se focalise sur l’identification de nouveaux gènes candidats au cours de l’anémie de Blackfan-Diamond.
Le projet DBA-multigènes se focalisera :

  • Identification de nouveaux gènes au cours de l’anémie de Blackfan-Diamond : 30% des patients ne portent aucune mutation, y compris les grandes délétions dans les séquences codantes des gènes connus de protéine ribosomique impliqués au cours de l’ABD.

    • Analyse d’exomes

    • Analyse de CGH/SNP array

    • 2 gènes déjà identifiés et caractérisation à finaliser

  • Caractérisation fonctionnelle du(des) gène(s) identifié(s)et confirmation du caractère pathogène des mutations identifiées :

    • Confirmation par technique Sanger/QPCR des mutations identifiées par CGH/SNP array ou par exomes,

    • Analyse de l’expression ARNm et protéine du (des) gène(s) identifié(s) dans les cultures érythroïdes issues de cellules primaires de patients atteints d’ABD portant ces gènes mutés,

    • Etude de la prolifération, différentiation érythroïde, voies de la p53, de l’apoptose, …cycle cellulaire à partir de cellules primaires issues de patients atteints d’ABD et porteurs de ces mutations

    • Etude des profils de polysomes sur le bioanalyzer à partir de PBMC issus de patients atteints d’ABD

    • Génération de shARNs spécifiques des gènes identifiés, contrôle de leur efficacité, infection de cellules primaires et étude de la prolifération, différentiation érythroïde, voies de la p53, de l’apoptose, …cycle cellulaire;

    • Génération de constructions lentivirales reproduisant la (les) mutations identifiées ou à l’inverse des cDNA sauvages pour réverser le phénotype in vitro.

    • Technologie Cripr/Cas9 dans les UT7-EPO dépendantes et si possible les cellules primaires érythroïdes pour générer des mutations ou invalider le(s) gène(s) identifié(s) ou réverser le phénotype in vitro.

  • Culture de cellules EBV, fibroblastes issus de patients et transfert des ARN, lignées au Pr PE Gleizes à Toulouse pour étude de la biogenèse du ribosome et de la traduction protéique.

  • Séquençage de la cohorte française des patients atteints d’ABD pour ce(s) gène(s)


Formations et/ou Qualifications :

  • Licence

  • Diplôme homologué de type II




  • Formation P3, Bioinformatique, culture cellulaire et à l’utilisation de la radioactivité est un plus


Expérience professionnelle :

Expérience en Culture cellulaire et en Biologie Moléculaire requise avec formation théorique diplômante.

Savoir se servir des outils informatiques de base (office, word, powerpoint, excel), outils statistiques (Prism) et pour la Biologie Moléculaire (NCBI, ensemble, UCSC, swiss prot, Hugo, seqscape, outils d’analyses bioinformatiques des NGS).


Qualités professionnelles :

Sens des responsabilités et de l’honnêteté

Autonomie

Rigueur

Capacité à prendre des décisions, des initiatives, à travailler en équipe et à gérer des objectifs

Capacité d'analyse

Capacité d’organisation
Curiosité et dynamisme,
Diplomatie, maîtrise de soi, aptitude à la négociation, respect de la hiérarchie
Aptitudes pédagogiques,
Sens de l'écoute et de la communication,

Comprendre un article en anglais,
Capacité à évoluer et à promouvoir le changement.

Valeurs professionnelles :
Intégrité, loyauté et équité.




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