Rapport de stage technicien








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LAURENT Emeline

Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Montpellier

Année Scolaire 2001-2002



RAPPORT DE STAGE TECHNICIEN

SOMMAIRE




Introduction

I. Présentation du sujet
A- Présentation de Dictyostelium discoideum
B- Les SNAREs et les fusions membranaires dans la

voie endocytaire

II. Méthodes utilisées
A- Recherche d’homologues
B- Séquençage des protéines

III. Résultats


  1. Homologues de SNAREs de Dictyostelium discoideum




  1. Séquences et propriétés des SNAREs de Dictyostelium discoideum



Conclusion

Bibliographie

Introduction



J’ai effectué mon stage technicien au CEA de Grenoble, dans le laboratoire de Biochimie et Biophysique des Systèmes Intégrés. Mon travail consistait à mettre en œuvre les outils et les stratégies de la bio informatique pour faire l’inventaire et la caractérisation des protéines de la famille des SNAREs chez l’amibe Dictyostelium discoideum et établir une comparaison fonctionnelle avec les SNAREs d’autres organismes (levures, plantes, mammifères…)
Je tiens à remercier Michel SATRE et Franz BRUCKERT pour l’aide qu’ils m’ont apporté tout au long de mon stage, ainsi que toute l’équipe du BBSI pour l’accueil chaleureux qu’ils m’ont réservé.

I. Présentation du sujet



A- Présentation de Dictyostelium discoideum
Dictyostelium discoideum est une amibe qui a pour habitat naturel l'humus des forêts de feuillus. Le matériel organique en décomposition dans le sol permet la croissance de nombreux micro-organismes qui servent à leur tour de proies pour Dictyostelium. Utilisé au laboratoire, c'est un organisme modèle très approprié pour l'étude des mécanismes moléculaires de grands problèmes actuels de biologie comme la motilité cellulaire, la phagocytose et le trafic vésiculaire, la transduction du signal, la mort cellulaire programmée, la différenciation en types cellulaires distincts ou encore les processus développementaux.

L'information héréditaire chez Dictyostelium est portée par 34 Mb d'ADN qui se répartissent sur 6 chromosomes dont les tailles varient entre 4 et 7 Mb. Le nombre total de gènes dans le génome de Dictyostelium se situe entre 8 000 et 10 000, c'est à dire 5 à 10 fois moins que le génome humain. Par sa position évolutive, la divergence de Dictyostelium a été postérieure à celle des plantes. Les protéines connues montrent de fortes identités de séquence avec les homologues des vertébrés.


B- Les SNAREs et les fusions membranaires dans la voie endocytaire
Les fusions membranaires entre les compartiments intracellulaires nécessitent à la fois des protéines cytosoliques : une ATPase appelée NSF (N-ethylmaleimide Sensitive Factor) et des protéines solubles appelées SNAP (Soluble NSF Attachment Protein) et d'autre part, des protéines membranaires : les SNAP Receptors (SNAREs) spécifiques des deux compartiments à fusionner. La formation d'un complexe de fusion met en jeu l'appariement de v- et de t-SNAREs dont les éléments viennent respectivement des vésicules et de la membrane cible (étapes 1-2). L'hydrolyse de l'ATP par NSF permet la dissociation du complexe NSF/SNAP/SNAREs (étapes 3-4).


L’importance des recherches effectuées sur les SNAREs doit être soulignée. En effet, les SNAREs du système nerveux sont la cible de nombreuses toxines, et il est à prévoir que celles de l'appareil endocytaire le soient aussi. De nombreux pathogènes profitent de l'endocytose pour pénétrer à l'intérieur des cellules d'un organisme tout en modifiant le devenir du compartiment membranaire qui les contient pour échapper à la digestion lysosomale. Dans certains cas, cette mainmise sur le trafic endocytaire pourrait s'exercer par l'intermédiaire des SNAREs, des protéines transmembranaires qui sont donc manipulables de l'intérieur par le microorganisme contenu dans la vacuole phagocytique.
Au cours de mon stage, j’ai réalisé une recherche exhaustive des séquences génomiques codant pour les SNAREs de Dictyostelium dans les bases de données actuellement disponibles.

J’ai analysé ces séquences nucléiques pour identifier leurs parties codantes (exons) et non codantes (introns) afin de déduire les séquences protéiques putatives.

J’ai identifié un total de 26 candidats SNAREs et j’ai réalisé une classification comparée avec les protéines homologues des levures, plantes et mammifères.


II. Méthodes utilisées



A- Recherche d’homologues
Plusieurs équipes travaillent actuellement au séquençage de l’ADN génomique (Baylor College of Medicine, Sanger Centre, Institut Pasteur, University of Cologne, IMB Jena) et des EST : « Expressed Sequence Tags » (Dictyostelium dicoideum cDNA project, au Japon) de Dictyostelium discoideum. Les données ainsi trouvées sont disponibles, via les sites Internet de ces différents laboratoires.
Sur ces sites Internet, des programmes de recherches de similarités entre séquences nucléiques ou protéiques sont disponibles ( ex : BLAST : Basic Local Alignement Search Tool). La similarité entre deux séquences est représentative de l’homologie entre ces séquences, c’est-à-dire proportionnelle à leur proximité phylogénétique : elles possèdent une séquence ancêtre commune et la différence entre elles deux se traduit par l’existence de mutations, insertions et délétions accumulées au cours de l’évolution.

La recherche de similarités entre deux séquences consiste à repérer les régions proches, c’est-à-dire les régions qui comptabilisent un maximum de caractères communs (appariements) et un minimum de changements (substitutions et, si nécessaire, insertions / délétions) lorsqu’on les superpose l’une à l’autre. Un score global permet de quantifier la similitude : il résulte de la somme des scores élémentaires calculés sur chacune des positions en vis à vis des deux séquences dans leur appariement optimal. Basiquement, c’est le nombre total de « bons appariements » pénalisé par le nombre de « mésappariements » : substitution ou introduction d’un « gap » (trou) matérialisant une insertion ou délétion.

Dans le cas des séquences nucléiques, la valeur du score élémentaire est de 1 ou 0 : les deux bases sont identiques (bon appariement) ou différentes (mauvais appariement).

Dans le cas des séquences protéiques, la valeur du score élémentaire tient compte des coûts de substitution d’un acide aminé par un autre. En effet, il existe différents degrés de similitude entre aminoacides, et la mutation d’un acide aminé en un autre a une probabilité différente selon les acides aminés concernés.

Le score pourra être considéré comme « bon », c’est-à-dire, biologiquement significatif, lorsqu’il dépassera une valeur seuil de probabilité relative à l’homologie ou à l’alignement considéré. De nombreux algorithmes (tel que BLAST) utilisent, à ces fins, des méthodes statistiques pour définir ces valeurs seuil et distinguer les similarités qui ont un sens biologique de celles relevant du hasard.

Les programmes BLAST offrent différents traitements possibles :

  • BLASTN : comparaison de séquence nucléique / banque nucléique

  • BLASTP : comparaison de séquence protéique / banque protéique

  • TBLASTN : comparaison de séquence protéique / banque nucléique (traduite dans les six phases)


Grâce au programme BLAST, j’ai recherché les homologues des SNAREs de Dictyostelium discoideum chez les organismes suivants : une plante (Arabidopsis thaliana), une levure (Saccharomyces cerevisiae) et l’être humain (Homo sapiens).

Je disposais d’une liste des SNAREs de Dictyostelium discoideum déjà connues, ainsi que de leurs séquences d’acides aminés supposées. Cependant, cette liste étant incomplète (nous ne connaissions pas forcément toutes les SNAREs de Dictyostelium discoideum, et les séquences d’acides aminés pouvaient être fausses ou incomplètes), j’ai préféré effectuer mes recherches à partir des SNAREs d’Arabidopsis thaliana et de Saccharomyces cerevisiae. En effet, pour ces deux organismes, je disposais de la liste complète des séquences de leurs SNAREs. Ainsi, il suffisait de soumettre chaque séquence de SNARE d’Arabidopsis thaliana et de Saccharomyces cerevisiae au programme BLAST cherchant dans les bases de données concernant Dictyostelium discoideum, afin d’obtenir la liste des homologues recherchés. En revanche, pour l’être humain, ne disposant pas de la liste de ses SNAREs, j’ai dû effectuer mes recherches à partir des séquences des SNAREs de Dictyostelium discoideum.
B- Séquençage des protéines


Lors des recherches d’homologues par le programme BLAST, on obtient, pour chaque protéine homologue, une liste de clones de segments d’ADN génomique, EST… correspondant à différents morceaux de la protéine étudiée. Grâce à ces différents clones et à des programmes d’assemblage, il est possible de reconstituer la séquence de la protéine. Chaque site Internet proposant des résultats concernant le génome de Dictyostelium discoideum (Jena, Sanger, San Diego, Baylor, NCBI…) dispose de son propre programme BLAST. J’ai donc dû choisir les sites que je préférais utiliser. Pour la recherche d’homologues, j’ai utilisé le site de Jena, lorsque je partais d’une séquence n’appartenant pas à l’espèce Dictyostelium discoideum. En effet, le programme BLAST de ce site cherche exclusivement dans les banques de données concernant Dictyostelium discoideum, et renvoie les références de clones provenant de toutes les banques, excepté Sanger, ainsi qu’un graphique montrant les zones sur lesquelles chaque clone est homologue à la séquence demandée. Par contre, lorsque je partais de séquences appartenant à Dictyostelium discoideum, j’utilisais le programme BLAST du NCBI, car ce programme cherche dans les banques de données concernant un grand nombre d’espèces (dont Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisiae et Homo sapiens). Enfin lorsqu’il s’agissait de faire des contigs, j’utilisais le site de Baylor qui renvoie des séquences prêtes pour l’assemblage de contigs. Cependant les programmes BLAST de ces sites ne renvoient des résultats que lorsque leur score est supérieur à un certain seuil qu’il est impossible de modifier. Seul le site de Sanger Institute n’a pas de limite inférieur pour les scores. Par contre les résultats obtenus ne sont pas toujours exploitables.

Ainsi, pour chaque SNARE de Dictyostelium discoideum détectée, j’ai pu reconstituer la séquence d’acides aminés de la protéine et prédire la position des introns. J’ai également pu prédire l’emplacement du « core domain », spécifique de la famille des SNAREs et de la partie transmembranaire de chaque protéine ; et calculer son point isoélectrique théorique et son poids moléculaire. Le « core domain » est obtenu grâce à un programme (PFAM) comparant la séquence proposée à des séquences type spécifiques de chaque famille de protéines. Les deux familles que j’ai utilisé sont : t-SNARE (smart 397) et synaptobrevin ou v-SNARE (pfam 00957). Il existe plusieurs programmes prédisant l’emplacement de la partie transmembranaire. Ceux des sites de Tokyo et du Danemark (SOSUI et TMHMM) donnent des résultats similaires (ils ne diffèrent que d’un ou deux acides aminés) et satisfaisant. Par contre, ils ne détectent pas les séquences hydrophobes trop petites. En revanche, le programme de Stockholm (DAS) repère ces petites séquences mais donne des résultats moins satisfaisant sur les véritables segments transmembranaires (on obtient des séquences trop courtes).

III. Résultats
Grâce aux résultats obtenus avec les programmes BLAST, j’ai pu effectuer une classification des SNAREs de Dictyostelium discoideum d’après leurs homologues chez Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisiae et Homo sapiens. Pour chaque SNARE de Dictyostelium discoideum, j’ai indiqué les homologues dans chaque espèce, classés par degré décroissant d’homologie, les différents clones de la protéine, sa longueur, son point isoélectrique et son poids moléculaire. Ensuite, j’ai indiqué la séquence d’acides aminés, avec la position des acides aminés de cœur, de la partie transmembranaire (TM) et des introns. Pour ces derniers, j’ai également indiqué leur séquence nucléique.

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