Tp biologie moleculaire : 2eme année








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date de publication18.01.2018
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TP BIOLOGIE MOLECULAIRE : 2eme année

Détection d’une mutation responsable de l’hémochromatose


Introduction (rappel des notions vues en cours)


NB : pendant le cours de Biologie Moléculaire de 2eme année sont abordées les notions nécessaires à la compréhension de ce TP : techniques de base en BM (enzymes de restriction, PCR, spectre des acides nucléiques) ; notions de génétique humaine et principes généraux du diagnostic génétique (l'hémochromatose étant prise comme exemple)

L'hémochromatose est une maladie génétique caractérisée par une surcharge en fer due à une hyperabsorption digestive de cet élément. Elle est l'une des maladies génétiques les plus fréquentes dans les populations caucasiennes.

L’hémochromatose classique est une maladie autosomale récessive due à une mutation du gène HFE situé sur le chromosome 6 (6p21.3). Ce gène code pour une protéine transmembranaire qui interagit avec le récepteur de la transferrine, qui transporte le fer. Plusieurs mutations ont été identifiées ; celle que nous allons étudier au cours de ces 2 séances de TP est responsable de 83% des cas d’hémochromatose : la mutation C282Y (substitution d’une cystéine en tyrosine en position 282 de la séquence de la protéine). Elle est due à une transition G->A (Feder Nat Genet 13, 399, 1996)


Manipulations : le TP s’étale sur 2 séances :


1ère séance

a) Extraction de l'ADN génomique :

à partir de 300 l de culot de lymphocytes

- lyse cellulaire et précipitation des protéines

- précipitation de l'ADN par l'isopropanol

- rinçage à l'éthanol et séchage de l'ADN qui est ensuite redissout en solution aqueuse
b) Quantification de l'ADN obtenu par spectrophotométrie :

lecture des absorbances à 260 et 280 nm
c) Amplification de la séquence d’intérêt (422 pb) par Polymerase Chain Reaction
2ème séance

d) Coupure du fragment d’ADN amplifié par une enzyme de restriction : Rsa I
e) Séparation des fragments par électrophorèse sur gel d'agarose (2 %) et interprétation des résultats :

Individu non porteur de la mutation : obtention de 2 fragments de 250 et 172 pb

Individu porteur de la mutation G->A : obtention de 3 fragments de 250, 143 et 29 pb


Remarques


- les étudiants travaillent en binome

- les culots de lymphocytes de génotype normal proviennent du centre de transfusion de Bordeaux ("déchets" des concentrés d'érythrocytes). Ils proviennent donc de donneurs de sang controlés sur le plan sérologique, même si cela ne dispense pas les étudiants d'effectuer les manipulations avec des gants. L'obtention de ces poches de lymphocytes a fait l'objet d'une convention entre notre service et le centre de transfusion, ainsi que d'une autorisation du président de l'université.

- Les culots de lymphocytes ont été aliquotés et congelés en fractions de 300 l, prêtes à l'emploi pour les étudiants

- les mutants proviennent de l'hopital, et sont régulièrement amplifiés par nos soins. Nous en "glissons" un pour chaque groupe lors de la 2ème séance (coupure des produits de PCR)

- pour des raisons de sécurité, la coloration des gels lors de la dernière étape se fait au SYBR-Green, plus onéreux mais moins ennuyeux à manipuler que le bromure d'éthidium

- la 2eme séance comportant 2 temps d'attente assez importants (1 heure pour l'incubation avec l'enzyme et environ 30 à 40 minutes de migration du gel), nous avons prévu d'occuper les étudiants pendant ce temps avec une manip de chromatographie d'exclusion-diffusion des acides nucléiques (en projet)

- Cout de la manip (pour environ 120 étudiants, soit 60 binomes) : moins de 500 €, répartis comme suit :

Réactifs d’extraction de l’ADN génomique  : 100 €

Taq Polymérase et réactifs PCR : 200 €

Enzyme Rsa I : 44 €

Réactifs pour gel (dont SYBR-Green) : environ 130 €

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