Bulletin des BioTechnologies Juillet 2002








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Bulletin des BioTechnologies – Juillet 2002







Juillet 2002 n°197
Une version plus complète de ce bulletin est accessible sur le site de l'INRA www.inra.fr. sous son nom dans : Information Scientifique et Technique puis Publications INRA en ligne.

Le signe ### dans cette version papier indique quelques développements supplémentaires ou des commentaires additionnels consultables dans la version électronique. André BERKALOFF

e-mail : andre.berkaloff@igmors.u-psud.fr

Concepts et Techniques


1. Une revue traite des réseaux de régulation permettant la spécificité de la régulation de la transcription par l'ARN polymérase II (RNAP II). BM Emerson; Cell 109 (03MAY02) 267–270. Elle souligne que ces réseaux fonctionnent à différents niveaux dans le noyau.Voir également le Bulletin de Mai §4 et Juin §3, et, en particulier, NA Woychik et al.; Cell 108 (22FEB02) 453–463.

Le remodelage de la chromatine, pour faciliter ou non son accessibilité, est un des éléments du système. Les complexes enzymatiques modifiant les histones et la structure du nucléosome interviennent, chacun, manifestement sur des sites différents du génome. C'est ce qu'on a d'abord montré génétiquement chez la levure avec les complexes SWI/SNF, RSC, et ISWI 1, 2 dont la mutation donne des effets différents sur l'expression du génome. Des équivalents de la Drosophile sont effectivement révélés cytologiquement en des sites différents des chromosomes polytènes. Les données actuelles indique, cependant, que l'"ouverture" de la chromatine n'est pas, par elle-même, suffisante pour faciliter la transcription, elle doit être associée au recrutement de facteurs de transcription, c'est ce qui explique les interaction entre les deux types de complexes.

Par ailleurs la compartimentalisation nucléaire des protéines et complexes joue un rôle dans les régulations. La séquestration à distance du site d'action prévient la transcription et n'est levée que sous l'action de signaux de différenciation, par exemple.

L'ordre d'intervention des différents facteurs est également important, mais il n'est pas le même pour tous les gènes. Le cas du promoteur du gène de l'1 antitrypsine est intéressant. L'activateur HNF-1, et deux composants du complexe d'initiation, TFIIB et TBP (TATA binding protein) commencent par se fixer, longtemps avant l'activation de la transcription au sein du nucléosome. Au fur et à mesure de la différenciation, d'autres facteurs d'initiation et la RNAP II sont recrutés, et un complexe TFIID complet remplace TBP. Les histones du nucléosome sont alors hyperacétylées. Ce n'est que quand le remodelage du nucléosome couvrant la TATA box (positionnant le site d'initiation de la transcription) est assuré par le complexe SWI/SNF interagissant transitoirement avec un second activateur, HNF-4, que la transcription peut commencer.

Cette étude est intéressante, car elle montre que le gène de l'1antitrypsine est au milieu d'un paquet compact de gènes, mais que l'ordre de recrutement est différent pour ces divers gènes.

La composition des complexes varie d'un tissu à un autre et des complexes dits "médiateurs" modifient la conformation des autres composants de l'appareil de transcription.

Différents signaux extérieurs (hormonaux par exemple) entraînent des patrons d'expression différents. La méthylation de la protéine CBP/p300 l'empêche de se fixer sur la protéine CREB (cyclic AMP response element binding protein) qui l'attend sur un promoteur et bloque l'activation de la transcription par le cAMP. Or un récepteur nucléaire d'hormones peut également activer ces gènes. La répression et l'activation dépendent d'une même protéine, la méthyltransférase CARM1 qui méthyle CBP/p300 ainsi que les nucléosomes sous l'action du récepteur d'hormone. Un schéma simple illustre cette analyse.

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2. Une revue sur les réseaux de détection de protéines est parue avec T Kodadek; Trends in Biochemical Sciences 27 (JUN02) 295-300. Voir également le Bulletin d'Août 2001 §5 et Janvier 2002 §6.

On n'en est pas encore à l'utilisation en routine. Pour que de tels réseaux soient réellement opérationnels, il faudrait mettre au point des techniques à haut débit de production des ligands assurant la capture sélective des protéines à étudier (anticorps ou molécules interagissant d'une façon différente avec la protéine caractériser) et permettre une visualisation sensible et quantitative de la capture. C'est l'objet de cette revue.

Pour ces raisons, on s'intéressera initialement à quelques protéines significatives, et pas à l'ensemble des protéines potentielles, par exemple celles indiquées par les réseaux ADNs. Une telle approche en diagnostic pourrait consister à identifier un jeu raisonnable de protéines sanguines dont une signature combinatoire permettrait de diagnostiquer une condition pathologique donnée.

Les besoins dans le domaine fondamental sont différents, et on souhaiterait obtenir une bonne quantification du produit moléculaire final de l'expression génique, ainsi que de ses différentes isoformes et versions (variants d'épissage par exemple), qu'on ne sait pas encore identifier avec les réseaux ADN.

Les réseaux actuellement disponibles sont des réseaux dits virtuels (en milieu liquide), ceux de Luminex et Illumina, qui utilisent des billes porteuses d'un anticorps donné, identifiée par le rapport entre deux marqueurs colorés (voir P Nolan et al.; Trends in Biotechnology 20 (JAN02) 9-12). On peut associer une centaine de billes porteuses d'anticorps différents. On détermine la nature de la protéine par le rapport entre le deux colorants. On quantifie avec un anticorps fluorescent qui reconnait les anticorps des billes (technique sandwich classique). Un schéma résume la technique.

Les ProteinChip™ de Ciphergen (voir le Bulletin de Janvier §6 et YF Leung et al.; Trends in Biotechnology 19 (DEC01) 480-484), sont de vrais réseaux sur surface, où les protéines capturées au sein d'une matrice volatilisable sont analysées par la spectrométrie de masse avec la technique (SELDI)-TOF-MS (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight-Mass Spectrometry), dérivant de la technique MALDI-TOF. Ils n'ont, pour l'instant, que des capacités limitées et très peu d'échantillons (une centaine au maximum) peuvent être traités.

De fait, les anticorps sont les ligands de choix, mais la production d'anticorps monoclonaux en grandes quantités, et de spécificités différentes est encore très coûteuse et fastidieuse.

Une technique permettant d'éviter d'immuniser des foules de souris est de monter des bibliothèques d'anticorps simple-brin sur phage M13 ou équivalents, et de les cribler. Malheureusement la constante de dissociation à l'équilibre (KD) des antigènes liés à ces anticorps n'est pas aussi basse (typiquement 10-7 M) que celle des anticorps classiques (10-9 M). Seules de très grandes bibliothèques permettent d'obtenir une affinité acceptable.

On peut utiliser des peptides fixant des protéines données, les aptamères, autres que les anticorps. Les peptides utilisés directement ont, en général, une affinité trop faible pour être utilisables (KDs de l'ordre de 10-6). On les exhibe donc à la surface de protéines comme la thioredoxine qui est une protéine de petite taille et stable. On les insère, dans ce cas dans l'unique boucle externe de la thioredoxine, qui peut être facilement substituée. On part du postulat qu'en les insérant dans une structure protéique, on diminue le coût entropique de la liaison avec une protéine, et on augmente donc donc la probabilité d'une affinité suffisante. On l'a fait avec des peptides de 20 acides aminés et obtenu des KDs de l'ordre de 10-7 à 10-8M. On peut diminuer encore la taille de la protéine support et utiliser des protéines synthétiques dans ce but. On l'a fait avec un fragment de 33 acides aminés d'un polypeptide pancréatique aviaire.

Les acides nucléiques sont également envisagés, mais ce sont surtout les ARNs qui l'ont été. Leur production en grandes quantités est, cependant, problématique et leur affinité pour les protéines dépend de motifs de ces protéines qui ne sont pas uniformément présents.

L'affinité est donc un critère essentiel. La revue traite des méthodes pour l'améliorer. Des peptides de 88 acides aminés ayant une KD nanomolaire pour la streptavidine ont été isolés d'une bibliothèque de 1013 peptides où l'on produit le peptide dans le cadre d'une transcription-traduction in vitro en présence de puromycine, qui ponte messager et peptide. On crible face à la protéine à reconnaître, on lessive les peptides inefficaces et on amplifie le messager lié aux peptides efficaces par transcription réverse et PCR. Et on recommence la sélection sur ce lot plus restreint. Il existe plusieurs variantes sur ce thème.

La morale générale est que la population de départ doit être très grande pour qu'on ait une chance de succès, et c'est un facteur sérieusement limitant. La contrepartie en est qu'on est obligé d'utiliser des biomolécules, car la synthèse en phase solide d'une telle bibliothèque est actuellement impensable (on arrive péniblement à 10-5-10-6 molécules différentes).

Une alternative à cette force brute est de monter des chimères entre deux ligands à affinité individuelle avec un linker adéquat. Ceci peut être utilisé pour autre chose que des peptides.

La quantification de la liaison entre ligand et protéine donne lieu à une floraison de techniques dites "avancées" et de matériaux dits "astucieux" qui changent de propriété physique lors de la capture de la protéine. Il faut cependant se méfier du fait que le ligand reconnait parfois la protéine au sein d'un complexe et que toute technique utilisant la masse pour l'identification peut être trompée.

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3. Le numéro de Mai de Journal of Biotechnology est consacré aux glycodendrimères. Ce sont des macromolécules biomimétiques synthétiques qui greffent des sucres sur un squelette de nature variable, mais constitué d'unités répétées. Ce sont, d'une certaine façon, des isostères (analogues de configuration, si j'ai bien compris) des glycanes membranaires. On a essayé d'utiliser ces élégantes molécules sphériques ou crénelées, qui étaient considérées comme des curiosités à leurs débuts, comme inhibiteurs des adhésines microbiennes, et dans la manipulation de la transduction des signaux et le pontage de récepteurs membranaires.

Les reconnaissances entre protéines et glucides sont permises par la multivalence des interactions entre glucides et lectines, par exemple, malgré la faible affinité individuelle du sucre pour le site reconnu sur la lectine. Ces molécules sont flexibles, et il est difficile d'établir leur structure par les techniques classiques d'analyse structurale. Un article analyse la dynamique des interactions de façon à optimiser la construction des glycodendrimères capable d'assurer ce type de liaison. W von der Lieth et al.; p. 311-337.

Un autre article analyse les différents modes de synthèse de ces macromolécules, soit à partir de dendrimères commercialisés, soit de novo. Il analyse les différentes techniques de couplage et les utilisations potentielles. WB Turnbull et al.; p.231-255.

Des chercheurs de Quiagen décrivent l'utilisation de certains d'entre eux pour faciliter la transformation des cellules eucaryotes J Dennig et al.; p.339-347.

On trouvera une utilisation de dendrimères poly(amidoamine)-PEG pour la transformation cellulaire dans BJ Rackstraw et al.; Biochimica et Biophysica Acta 1576 (19JUL02) 269-286.

K Sadler et al.; p.195-229, enfin, décrivent les dendrimères peptidiques (à squellette radial ou ramifié peptidique sur lequel sont greffés des groupements fonctionnels), leur synthèse et leurs utilisations actuelles.

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4. Les protéines fluorescentes utilisées actuellement (verte d'Aequorea victoria, une méduse, verte de Renilla reniformi, une anémone de mer, et rouge de Discosoma, un corail) sont oligomériques (dimère facultatif pour GFP d'Aequorea, dimère obligatoire pour la GFP de Renilla, tétramère obligatoire pour la RFP de Discosoma). Si la dimérisation facultative de la GFP d'Aequorea n'a pas empêché son utilisation massive, la tétramérisation de la RFP est gênante car on utilise ces protéines sous formes de fusion avec une protéine que l'on, désire suivre..

Des chercheurs californiens ont fait évoluer artificiellement cette dernière, d'abord vers un dimère en tandem, puis vers un tandem de deux de ces tandems, ou même un vrai monomère mRFP1 (monomeric red fluorescent protein). L'interface intermoléculaire a été perturbé par l'insertion de plusieurs arginines qui ont handicapé, au départ, l'activité de la molécule. On a ensuite rétabli la fluorescence rouge par mutagenèse dirigée ou au hasard, avec 17 substitutions pour le dimère et 33 pour mRFP1. Malgré quelques défauts par rapport à la protéine d'origine, elle mature 10 fois plus vite et donne, en fait des résultats analogues in vivo. RE Campbell et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (11JUN02) 7877-7882.

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