Génétique des grandes pathologies








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titreGénétique des grandes pathologies
date de publication15.05.2017
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Génétique des grandes pathologies

d'après le cours de G. Pagès

On utilise des modèles animaux pour mimer une maladie, ou alors on mute un gène pour voir comment les animaux réagissent : comment contrôler cette mutation?

Le cours va porter sur l'obtention d'animaux «transgéniques», plusieurs notions sont abordées, dont des notions de biologie moléculaire
1) Notions de biologie cellulaire
Génération d'animaux mutants pour un gène nécessite l’utilisation de cellules embryonnaires souches. On va utiliser ces cellules ES (embryonic stem cells). On les obtient en les isolant à partir d'embryons de souris à un stade précoce du développement embryonnaire. Le stade utilisé est le stade blastocyste

(3 j après fécondation). Il est facile de les isoler. Il y a de 8 à 16 embryons chez la souris. Il suffit de disséquer le système des ovaires, et par flush (seringue) on fait passer un liquide osmotique qui décroche les embryons que l'on récupère dans les boîtes de culture.

On peut les récupérer par aspiration à l'aide d'une micropipette, et les transférer dans une boîte (technique courante en laboratoire). Les blastocystes à la loupe binoculaire ont l’aspect décrit dans la figure ci-dessous.

L
es cellules ES se trouvent au niveau de cette masse cellulaire interne (« Inner Cell Mass ») que l'on récupère et que l'on met en culture. Il existe des milieux de culture utilisés pour garder les propriétés de cellules souches, qui sont extrêmement bien définis. Ce milieu contient des facteurs de croissance qui sont présents dans le sérum de veau fœtal. Il contient également le LIF (« leukemia inhibitory factor »), facteur de croissance absent du sérum de veau fœtal. Ce milieu défini contient également du beta mercapto-éthanol.
Cellule souche embryonnaire : cellule ayant la capacité une fois qu'elle se différencie, de donner tous les types cellulaires de l'organisme (cellules nerveuses, adipeuses, musculaires, ...). A ce niveau, le LIF joue un rôle essentiel et permet aux cellules ES de rester dans un état indifférencié. On dit que les cellules ES s'auto renouvellent. Si on l'enlève le LIF du milieu de culture, les cellules ES se différencient. En quelques jours on aura des cellules à morphologie différente des cellules ES ayant des caractéristiques de toutes les cellules de l'organisme (adipeuses, nerveuses, et même cardiaques qui se mettent à battre). On visualise ainsi le potentiel de différenciation.

On sait obtenir des cellules ES à partir de certaines souches de souris mais pas à partir d'autres. C'est pour cela que dans les articles on voit des cellules ES isolées à partir de la souche SV 129. Ce sont les plus utilisées dans le monde. Deux autres souches de souris sont très utilisées : Black 6 et OF1 ou MF1 ou FVB. A partir de blastocystes de souris SV129, la réussite d'obtention de cellules ES, le taux de réussite est d'environ 100% (obtention de lignées de cellules ES à partir des toutes les Masses cellulaires internes des blastocytses prélevés). Black6 : 50%, les autres : 0.

On ne comprend pas encore très bien pourquoi : dissociation plus difficile des blastocystes dans certaines souches ?

Les cellules ES humaines ont pu être obtenues, les milieux de culture définis sont différents de ceux de souris. Il faut autre chose que le LIF pour maintenir les cellules : le FGF (fibroblast growth factor 2).
Législation : l'utilisation de cellules souches humaines est extrêmement réglementée : comité d'éthique auquel a été associé un comité spécial, il faut définir les objectifs, des pièces de cultures spécifiques où aucune autre culture n'est faite. Le laboratoire niçois de Daniel Aberdam a obtenu une autorisation.

L'utilisation est intéressante : infarctus, diabète de type I... Le problème de rejet (histocompatibilité) est posé et des expériences intéressantes chez la souris ont été faites à la dans l’équipe de Michel Pucéat (génopole d’Evry) : des infarctus ont été induits chez le rat, puis on a réinjecté des cellules embryonnaires souches de souris. Il a réussi à récupérer une fonction cardiaque quasi normale après injection de cellules embryonnaires souches. Il a réussi ensuite en injectant des cellules ES chez ... le mouton ! L'étude porte actuellement sur les raisons du fonctionnement : les cellules ES n'ont elles pas de HLA?

Y a-t-il un problème de prolifération (cancer) ? Dans ces expériences, quelle que soit la quantité de cellules injectée, il n'y a eu aucun cas de cancer.
Si on injecte des cellules ES en sous cutané chez des souris athymiques («nude»), on induit la formation de tumeurs excessivement agressives. Plusieurs paramètres sont observés : quantité minimale de cellules à injecter pour provoquer une tumeur (100 000 cellules ES suffisent), temps qu'il faut après injection pour développer des tumeurs (1 semaine après injection chez les ES). Les tumeurs induites par l’injection de cellules ES sont des tératocarcinomes : les coupes de tumeurs montrent des structures ressemblant à tous les tissus de l'organisme : dents, tissu corné, musculaire...

Le micro-environnement de l'organe semble entraîner la différenciation de la cellule ES injectée dans la lignée de l'organe.
Les cellules ES permettent de générer des animaux pour lesquels on a muté un gène particulier. Comment à partir d'une cellule ES qui va être sauvage peut-on créer une cellule ES mutée sur un gène donné? Pour faire cela on utilise un processus de recombinaison homologue. Il faut transfecter les cellules ES, c'est à dire introduire de l'ADN dans une cellule donnée, eucaryote (équivalent de la transformation chez les cellules procaryotes). Il existe différentes méthodes : micro injection, lipofection (utilisation de liposomes), électroporation, phosphate de calcium. Dans la cellule ES on utilise l'électroporation. Quand on fait de la transfection, l'ADN va dans le noyau, une faible proportion s'intègre au génome. Pour détecter ce qui s'est intégré on utilise des gènes de résistance à un antibiotique (ex : néomycine, hygromycine, puromycine). L'efficacité de transfection liée au fait que l'intégration de l'ADN dans le génome est assez faible nous force à utiliser beaucoup de cellules. 1010 cellules + 10 µg ADN (sous forme de plasmide), on obtient de 100 à 500 clones cellulaires. C'est donc un événement relativement rare. Les plasmides possèdent une origine de réplication bactérienne, un gène X, un gène de résistance à un antibiotique procaryote (ex : ampicilline) et un gène de résistance à un antibiotique eucaryote avec promoteur eucaryote et un terminateur permettant la poly adénylation. Le promoteur est important dans les cellules ES, tous les promoteurs ne sont pas fonctionnels dans ces cellules. On utilise des promoteurs de virus SV40 et CMV de façon courante mais ils ne fonctionnent pas dans les cellules ES. On préfère utiliser des promoteurs ubiquistes comme le PGK (phosphoglycérate kinase).
Il faut également muter un gène donné. Il faut connaître la structure de ce gène (composition en introns et exons voire sa séquence, ou au moins des sites de coupures ou sites de restriction avec leur position exacte). Il faut connaître autant que faire se peut l'intégralité du gène (généralement 15 à 20 kb, mais il existe des exceptions, comme par exemple le gène de la dystrophine qui est mutée dans le cas de la myopathie de Duchenne, 3000 kb). Ceci n'est pas toujours aisé. Pour faire de la recombinaison homologue, il faut mimer sur papier la manipulation pour prédire tout ce dont on va parler.
Il faut cloner le gène en question qu'on va muter dans les cellules ES. Il s'agit de criblages de banques d'ADN génomique. Il faut intégrer cet ADNg dans un vecteur donné, généralement dans un plasmide tel que décrit précédemment.

Exemple : gène à 3 exons

I
l faut cloner le gène à partir d'une banque qui a été réalisée à partir de l'ADNg de cellules ES, car dans le cas des transfections dans les cellules eucaryotes il y a 2 types d'intégrations possibles si on transfecte avec un plasmide contenant une partie correspondant à de l'ADNg de la cellule. Il y a l'intégration hétérologue, et l'intégration homologue (par crossing over). Le mécanisme d'intégration hétérologue est plus fréquent que l'homologue. Le mécanisme homologue dépend de plusieurs paramètres, et on peut augmenter sa fréquence : l'ADN transfecté doit être homologue à 100% avec l'ADN cellulaire. C'est pour cela que l'ADNg a du être cloné et obtenu à partir de la cellule ES que l'on va transfecter. Si on utilisait de l'ADNg d'une autre souche, l'homologie ne serait pas totale (allèles de gènes différents, ou encore différences au niveau intronique). La taille de l'ADNg présente dans le vecteur est également importante.

I
l faut une taille minimale pour avoir au moins un événement de recombinaison homologue.
On veut sélectionner les cellules transfectées tout en détruisant la fonction d'un gène. On va au niveau d'un exon donné éliminer une partie de l'exon et la remplacer par un gène de résistance à l'antibiotique eucaryote. Il doit être autonome (promoteur lui permettant de fonctionner, séquence de poly adénylation...). La mutation doit supprimer totalement la fonction du gène. Il faut donc connaître à l'avance la séquence complète du gène.
On transfecte le plasmide ainsi construit par électroporation. La fréquence de recombinaison hétérologue est plus importante que celle homologue (1 pour 1000 hétérologues). Pour réduire le nombre de positifs à recombinaison hétérologue, on utilise le gène TK (thymidine kinase) placé comme sur la figure, en dehors de la région homologue. TK permet le principe de sélection négative. En présence de gancyclovir les cellules possédant le TK (par recombinaison hétérologue) vont le métaboliser. Ces produits issus du métabolisme du gancyclovir par l’action du gène TK sont toxiques. On provoque ainsi la mort de la cellule. Le rapport sera bien réduit (1 pour 200 hétérologues). Cette technique n'augmente pas la fréquence absolue de recombinaisons homologues mais diminue le nombre de faux positifs.

On peut détecter par Southern Blot les recombinaisons homologues. Il faut couper avec des enzymes de restriction extérieures à la partie recombinée. Si c'est interne, on détectera aussi les hétérologues. La sonde utilisée est généralement en dehors de la région transfectée, de préférence une région exonique.

Couramment, on fait un Southern avec 2 types de sondes, une externe à la recombinaison homologue et une avec le gène de résistance. On aura donc un fragment à la taille attendue comprenant le gène de résistance.

Résultat du Southern : Recombinaison homologue sur un des deux allèles du gène (16 kb), l'autre n'a pas été affecté (15 kb).

L
e Southern est une manipulation assez courte, mais sur 300 clones... Il vaut mieux procéder par PCR avec une amorce à l'extérieur de la région de recombinaison homologue (oligo 1) et une amorce soit dans néo-R (oligo2), soit plus loin que néo-R (oligo3)

Il faut savoir que les vecteurs sont rarement symétriques, mais plutôt dissymétriques par rapport au gène de résistance. Ceci permet de faire le diagnostic par PCR car l'amplification sur des grandes distances est compliquée. On préfère ne pas dépasser les 2 kb.





Nous avons vu comment diagnostiquer s'il y a eu intégration ou non. Cependant dans ce cas il faut déjà connaître de façon aussi détaillée que possible le gène. Ce sont des manipulations délicates, il faut cribler de nombreux clones. Une des principales difficultés est que le nombre de clones ayant subi un processus de recombinaison hétérologue est beaucoup plus important que celui de recombinaison homologue.
Il existe des astuces de sélection :

Si on place le gène de sélection (antibiotique) au niveau de l'exon 1, et que ce gène de sélection n'a pas un fonctionnement autonome (pas de promoteur dans ce cas), la seule manière qu'il aura de s'exprimer est qu'il y ait un phénomène de recombinaison homologue qui le place à proximité du promoteur. Ce type de vecteur risque cependant une insertion à proximité d'un promoteur différent de celui du gène voulu. Un tel vecteur correspond donc à 1 clone sur 30 qui sera bon. Dans 30% des cas, on a une recombinaison homologue. On a éliminé de nombreux faux positifs.

Il faut cependant que le promoteur fonctionne dans les cellules ES. Ceci peut être vérifié avec une construction artificielle contenant le promoteur du gène en amont d'un gène rapporteur (luciférase, beta galactosidase...). On peut aussi vérifier le fonctionnement du promoteur en analysant l'ARN par Northern ou RT-PCR.

D'autres personnes ont essayé de placer le gène de résistance au niveau du dernier exon, avec un promoteur mais sans séquence de poly adénylation. C'est le même principe, mais la méthode est moins stringente car il peut y avoir expression du gène de résistance à dose plus faible... Ces deux méthodes permettent d'augmenter la proportion de recombinaisons homologues chez les positifs.
Des expériences de promoter-trap ont été réalisées. L'idée de ce type d'expérience est de transfecter dans des cellules ES un gène rapporteur beta géo (beta gal + néo résistance). Ceci a été réalisé par l'équipe d'Austin Smith à Edimbourg (recruté maintenant à Cambridge). On prend le gène beta géo dépourvu de promoteur, et on le transfecte dans les cellules ES.
L'objectif est d'obtenir des animaux mutants pour un gène... On va donc réinjecter les cellules ES modifiées au niveau du blastocyste de souris.

On va faire s'accoupler des souris blanches pour obtenir des blastocystes (au 3ème jour). On prélève les blastocystes et on microinjecte les cellules ES. C'est une manipulation de haute précision nécessitant des appareillages très sophistiqués. Un premier micromanipulateur permet de coincer le blastocyste sur une première micropipette. Une seconde micropipette bizeautée permet, avec un deuxième micromanipulateur, de pénétrer le blastocyste. On va alors aspirer les cellules ES (une centaine). On dépose ces cellules ES dans le blastocyste. Ce dernier sera réimplanté dans une souris porteuse préalablement accouplée avec un mâle stérile.

Au bout de 20 jours on aura naissance des souris correspondant aux blastocystes réimplantés dans la souris. Même pour une personne très expérimentée ne dépasse pas les 50% de réussite, la moyenne étant plutôt de 30%. Sur 100 embryons réimplantés, on n'aura que 30 naissances !
Les blastocystes proviennent de souris blanches, les souris obtenues à la naissance devraient avoir des tâches : leur nombre varie en fonction de la souris qui vient de naître de ce type de manipulation. Ces tâches indiquent que les cellules injectées ont colonisé la région du blastocyste qui au cours du développement embryonnaire va donner naissance aux cellules de la peau et des poils. Les cellules ES doivent avoir colonisé la région donnant naissance à la lignée germinale. Ce qui les caractérise c'est qu'elles sont à 1n chromosomes...

Le fait qu'il y a beaucoup de tâches indique qu’il y a eu colonisation de l’embryon par les cellules ES de façon optimale, et donc peut-être dans la lignée germinale. Ce sont des souris chimères, et le degré de chimérisme observé au niveau de la peau est assez bien corrélé avec ce qui se passe dans l'ensemble de la souris. On croise les chimères avec des sauvages (évite les chimérismes bizarres et la consanguinité). Il y aura une proportion plus ou moins importante de gamètes sauvages et mutants... On croise les animaux chimères avec les sauvages et on obtient les descendants F1. On va génotyper les animaux qui naissent de cet accouplement : on coupe un petit bout de queue (1 cm) et on prépare de l'ADN génomique.

On aura soit des sauvages soit des hétérozygotes mutants. Si on fait une PCR avec une amorce avant le promoteur et une après le gène de sélection, on aura 1 bande pour les sauvages et 2 pour les hétérozygotes mutants.

On croise les hétérozygotes entre eux pour obtenir des mutants homozygotes. On ne va pas croiser entre eux des animaux de la même portée : il faut travailler en parallèle sur plusieurs chimères... On aura 25% d'homozygotes mutants.
Temps de gestation : 20 jours

Maturité sexuelle : 6 à 8 semaines

Le temps qu'il faut entre l'obtention de chimères et le croisement avec des souris sauvages est très long : 3 à 4 mois en étant optimiste!
Exemple : étude de la mutation de gènes impliqués dans la division cellulaire.

On essaie d'obtenir très rapidement des fibroblastes embryonnaires : on croise des hétérozygotes et on sacrifie l'animal au jour 14 du développement embryonnaire. On récupère les embryons très bien visibles au niveau du placenta, et on les broie en petits morceaux. Les cellules sont mises en culture dans un milieu contenant un sérum et tous les éléments nutritifs nécessaires. La majorité des cellules vont mourir assez vite, il ne reste presque que des fibroblastes 24 heures après. On peut alors caractériser leur croissance (sur 1, 2, 3, 4 jours...). Si les proportions mendéliennes sont respectées on aura des sauvages, des hétérozygotes ou des homozygotes pour la mutation dans une même portée. Si on utilisait des portées différentes, l'observation ne serait pas aussi rigoureuse.
L'insertion du gène rapporteur du promoter-trap est peut-être liée à la mutation d'un gène spécifique endogène. Les personnes qui ont travaillé sur ce domaine étaient surtout intéressés par le développement. Elles espéraient voir des défauts apparaître.

Effectivement, certains gènes qui étaient importants pour le développement embryonnaire ont été obtenus par intégration aléatoire du gène beta géo,. On peut suivre une coloration bleue tout au long de l'embryogenèse. Un groupe très performant à Paris travaillait sur cette thématique.

On ne sait cependant pas quel gène a été touché : on parle alors de génétique inverse. On part d'un phénotype et on espère revenir au niveau du gène.

On peut se servir de banques d'ADNg (YAC : 1 Mb, BAC, cosmide : 50kb, plasmide, phage lambda : 15 à 20kb) et on utilise une sonde beta géo. De part et d'autre de beta géo, on devrait trouver une séquence exonique. Une hybridation en Northern devrait donner un résultat s'il y a eu insertion à proximité d'un gène. On va donc utiliser la région autour de béta géo comme sonde en Northern sur l'ARN total. Si on obtient une bande en Northern, on a repéré l'ARN d'intérêt. On va alors faire un criblage dans une banque d'ADNc.
Remarque : si le génome est connu, on peut aussi séquencer et comparer aux gènes déjà connus, comme les EST (expression sequence tag).
Si les croisements entre hétérozygotes ne donnent jamais d'homozygotes mutants, c'est que la mutation est homozygote létale. Pour être sûr qu'il s'agit de létalité embryonnaire, il suffit de regarder si après le croisement des hétérozygotes on a des embryons homozygotes mutants à différents stades du développement embryonnaire. Plusieurs gènes induisent une mortalité très précoce (entre 6 et 9 jours). Ceci est visualisé par le fait que l'embryon au centre du placenta régresse et qu'on observe une masse informe. Il faut faire de nombreux croisements pour avoir une étude statistique correcte...

Certains embryons deviennent abortifs au 18ème jour, ou encore après la naissance... Un exemple très difficile à identifier est celui de nouveaux nés incapables de téter la mère (problème de nutrition).

On a essayé de développer un système qui permet d'étudier la fonction du gène et l'effet de la mutation sur l'animal adulte seulement ou alors de façon tissu spécifique.

On essaie d'obtenir des mutations silencieuses chez l'embryon. Le système choisi utilise une séquence d'ADN LoxP (30 pb, palindromique) et un enzyme particulier : la recombinase Cre.

Pour que la mutation soit effectivement silencieuse chez l'embryon, il faut la placer dans la région intronique.





On peut obtenir des souris homozygotes car la mutation est silencieuse. Il faut contrôler l'apparition de la mutation de façon volontaire. Pour exprimer la recombinase Cre on va générer des souris transgéniques pour la recombinase Cre.

Pour obtenir des souris transgéniques, il y a plusieurs façons de procéder :

- microinjection très précoce (stade embryonnaire 1) d'ADN, puis réimplantation.

Pour avoir une expression tissu spécifique, il suffit d'utiliser un promoteur tissu spécifique (ex: muscle squelettique : gène de l'actine, cerveau : nestine, peau : kératine14, cellule hématopoïétique : LCK). On dispose de souris commercialisées et viables exprimant la recombinase Cre de manière tissu spécifique. Il y a également l'intron de GH ou de la globine, qui permet d'augmenter l'expression du gène. En fait une telle séquence permet de positionner le système de traduction de façon optimale.

L
'injection de quelques nanolitres (fentogrammes d'ADN) suffisent, et on obtient des souris transgéniques. L'ADN microinjecté s'est intégré au génome de la souris, il peut y avoir une ou plusieurs copies du transgène. La souris avec intégration maximale servira de souris fondatrice d'une lignée de souris transgéniques (« founder »). On préfère les mâles qui peuvent féconder plusieurs souris.

On dispose donc de souris homozygotes loxp et on les croise avec des souris exprimant Cre. Le croisement permet d'obtenir une souris exprimant Cre, mais qui est hétérozygote pour la mutation.

On peut avoir un promoteur tissu spécifique ne fonctionnant pas à l'état embryonnaire, ou l'élimination tissue spécifique du gène a une conséquence sur le développement embryonnaire, ou encore cette élimination n'a pas de conséquence. Il faut ajouter un artifice à la recombinase Cre... On fusionne à la recombinase Cre le domaine de liaison des oestrogènes de synthèse (tamoxifen). Ceci va bloquer l'activité de la recombinase Cre, qui ne devient actif qu'en cas d'injection de tamoxifen.
Rappel de la dernière fois :

Recombinase Cre : la dernière fois on était arrivés au cas de figure où la mutation d'un gène devenait létale embryonnaire. On a donc utilisé un système inductible permettant d'inactiver de manière ciblée un gène. Les sites LoxP, cibles de la recombinase Cre, avaient été décrits.

Une mutation silencieuse consistant à ajouter des sites LoxP de part et d'autre d'un intron. Pour exprimer la recombinase Cre, on avait intérêt à utiliser un système inductible tissu spécifique. On était arrivés à conclure que si l'action du gène muté est important pour le développement embryonnaire mais également pour le développement embryonnaire dans un tissu donné on avait un problème. On peut également utiliser une recombinase Cre dont la fonction est inductible.
On utilise une recombinase Cre particulière, fusionnée au domaine de liaison des oestrogènes de synthèse, en l'occurence le tamoxifen. Ce domaine de liaison ne reconnaît pas les oestrogènes endogènes, il est extrêmement spécifique. En absence de tamoxifen, l'enzyme Cre sera inactive du fait de sa configuration. En présence de tamoxifen, le domaine catalytique sera démasqué et la recombinase Cre active.

On va induire la mutation chez l'adulte.

Le tamoxifen peut être injecté à la souris en intra péritonéale (dans le ventre), mais des expériences spectaculaires ont été faites lorsque la recombinase Cre était exprimée au niveau de la peau des souris : il suffisait alors de diluer le tamoxifen dans de l'huile et de l'appliquer sur la peau. On a pu induire la mutation de la kératine, l'application de tamoxifen était alors assez impressionnante (peau partant en lambeaux...).

On peut mimer toutes les étapes de développement de tumeur du foie chez des souris par l'utilisation de telles méthodes : c'est un très bon modèle.
Remarque : mécanisme de recombinaison homologue décrit par Mario Capecchi, Martin Evans, Oliver Smithies, prix nobel de médecine 2007
Exercice : partiel de décembre 2001

On regarde la figure :

C'est l'exon 4 qu'il faut muter, il est essentiel pour la fonction du gène !

Comme les enzymes de restriction ne permettent pas d'intégrer un gène de sélection dans l'exon 4, il faut générer des extrémités à bouts francs !

Une région du gène devra servir au mécanisme de recombinaison homologue. Les contraintes importantes sont :

- taille : au moins 3kb

- vecteur dissymétrique par rapport à la position du gène de résistance, pour la PCR après.

On peut faire un fragment entre les 2 P ou entre P et N (N sur exon8, par coupure partielle par PstI), ou même entre les 2 N. Si on prenait tout le gène (B/X), on ne pourrait plus diagnostiquer par Southern car on prend tout le gène !

Il faut introduire un gène de sélection dans l'exon 4. Or les sites ne sont pas compatibles : H et A.
Hind III :

A 5'AGCTT

TTCGA 3'A
PstI :

CTGCA 5'G

G 3'ACGTC
SmaI:

CCC GGG

GGG CCC
On utilise le fragment klenow de l'ADN polymérase pour les 5' sortantes, qui va remplir les bases manquantes en présence de dNTPs. Pour les 3' sortantes, on utilise l'activité exonucléase de la T4 DNA polymérase. On la fait agir en présence de dNTPs également. Celle-ci va «grignoter» sur le brin 3', mais son activité exonucléase est plus importante : l'enzyme va détruire le 3' sortant, continuer à détruire le brin 3' sur la partie hybridée, mais l'activité polymérase va contrebalancer cette destruction côté 3' et permettre d'obtenir un bout franc.
Le gène de sélection de puromycine génère déjà des extrémités à bout franc, il est plus facile à utiliser dans cet exemple. On va devoir introduire le gène TK à une extrémité du vecteur.
On sélectionne les cellules ES capables de pousser en présence de puromycine et de gancyclovir.

Pour le Southern il faut une sonde et une enzyme de restriction. Le site doit être à faible fréquence et doit être situé en dehors du vecteur de recombinaison homologue. NcoI est un bon candidat pour cela. La coupure par HindIII/BamHI est bonne aussi. Une de ces enzymes coupe à l'extérieur, donc c'est bon.

La sonde doit être en dehors du vecteur de recombinaison, on peut choisir comme sonde : exon 3, 7 ou 8.

Par PCR, on utilise des amorces sens à l'extérieur et antisens dans puro puis dans exon 4 après le gène de résistance puromycine.
Partie 2 :

On va produire des souris chimères.

La mutation, même à l'état hétérozygote, est létale embryonnaire. Le gène VEGF est un des rares exemples d'une telle situation. La surexpression est également létale embryonnaire.
Le système Cre LoxP va être utilisé. Il faut insérer le gène de sélection dans un intron à côté de l'exon 4. De part et d'autre de cet exon, on introduira des sites loxP.

On microinjecte des cellules ES mutantes silencieuses dans des blastocystes. On devrait obtenir des animaux hétérozygotes par croisement des animaux chimériques. On va alors essayer par croisement d'obtenir des animaux homozygotes. Il faut générer des souris transgéniques pour la recombinase Cre avec un promoteur tissu spécifique du muscle lisse (généralement d'une forme particulière d'actine). On utilise l'intron du gène de globine puis Cre et ERT (récepteur des oestrogènes de synthèse).

On peut transfecter de manière stable des cellules ES avant de les injecter dans les blastocystes, ou alors microinjecter directement l'ADN dans l'oeuf fécondé.

On va croiser les animaux possédant cette mutation silencieuse avec des souris transgéniques exprimant la recombinase Cre. Ces souris seront hétérozygotes pour la mutation VEGF. On doit donc à nouveau faire un accouplement, une génération F1 va être accouplée entre elle pour obtenir des F2 homozygotes exprimant Cre.

On injecte du tamoxifen aux animaux nés.
Un vaisseau sanguin est composé d'une couche de cellules endothéliales entourée de cellules musculaires lisses, plus ou moins abondantes.

Le VEGF est important en cas de coupure : le VEGF permet de refaire des vaisseaux. Le VEGF permet également de maintenir la survie des cellules au niveau basal. C'est un facteur qui empêche l'apoptose des cellules.
Partie 3 :

Les cellules ES sont totipotentes.

Remarque : totipotent = permet de générer des animaux dérivés de ces cellules, pluripotent = un degré en dessous, permet de donner des cellules mais pas un animal complet.

Le LIF permet de maintenir les cellules ES sous cette forme. Pour favoriser la voie de différenciation en cellules de ce type.

On transfecte dans des cellules ES indifférenciées en présence de LIF, avec un gène de sélection (ex : néo) sous le contrôle d'un promoteur tissu spécifique, en l'occurrence endothélial spécifique. On cotransfecte avec un autre vecteur contenant un gène de sélection (puromycine) sous le contrôle d'un promoteur ubiquiste.

Des cellules vont intégrer soit l'un, soit l'autre, soit les deux. On sélectionne alors les cellules sur la base de la résistance à la puromycine. Il en restera très peu, et dans ce petit pool de cellules on recherchera par PCR les cellules ayant également intégré Néo. Cependant il faut choisir une taille assez petite à amplifier et on peut passer à côté d'un gène Néo tronqué par intégration dans le génome : la sélection par Néo ne sera pas bonne.

Une fois sélectionnées, on enlève le LIF, on met en présence de VEGF et on rajoute Néo (3-4 jours après). Toutes les cellules qui ne seront pas des cellules endothéliales n'exprimeront pas Néo.
Comment visualiser ces cellules facilement?

On aurait pu transfecter un troisième vecteur en parallèle, avec un promoteur tissu spécifique contrôlant l'expression de la GFP.

Comme on transfecte trois fois, on obtient un meilleur rendement par transfections séquentielles.
GFP sous le contrôle d'n promoteur tissu spécifique : seules quelques cellules parmi toutes (visualisées au DAPI) ressortent colorées en vert. Ces mêmes cellules ressortent en rouge à cause de leur CD31.

Après application de la pression de sélection (puromycine), toutes les cellules endothéliales vont survivre, grâce à l'expression du gène de sélection.
Les gènes codant pour les cyclines, notamment la cycline D, vont être étudiés. Dans le temps, les cyclines s'accumulent, puis on observe une nette diminution suivie d'une nouvelle accumulation (d'où le nom de «cycline». Les CDK sont associées à ces cyclines, ce sont les cyclines dependent kinase.

Le couple cycline D / CDK4 permet aux cellules de passer de la phase G1 à S. Il existe plusieurs cyclines D (1, 2, 3). L'importance de ce couple dans le cycle cellulaire a été très étudié, beaucoup de littérature existe à leur sujet. Après mutation du gène de la cycline D1, les souris sont tout à fait normales. En inactivant les cyclines D1 et D2, on n'observe toujours pas de phénotype. Le triple K.O. a alors été réalisé : D1, D2, D3. Ce triple K.O. est létal embryonnaire. On a croisé des D1 -/- D2 -/- D3 +/- entre elles pour l'obtenir. Cette manip a été faite un grand nombre de fois pour être fiable, le document sur le polycop n'en présente qu'un individu dans une grande série. Ces animaux meurent d'un déficit cardiaque sévère in utero. Ces expériences indiquent qu'il y a une redondance.
La sérotonine peut se fixer sur différents types de récepteurs, c'est un autre exemple de cas de figure semblable à celui-ci.
La capacité de transformation des cellules (rendre des cellules tumorales) a été étudiée. Bob Weinberg a eu le prix nobel dans les années 80 en montrant qu'il fallait deux oncogènes pour rendre les cellules tumorales. Des études ont été réalisées sur des cellules de fibroblastes embryonnaires pour vérifier si les cyclines D interviennent au niveau de cette transformation.

Les fibroblastes embryonnaires provenant de souris sauvages ou K.O. pour les 3 formes de cycline D et ont étudié l'effet d'une transfection avec Ras et Myc. En absence de facteur de croissance, les cellules wt pour la cycline peuvent pousser, on observe des colonies cellulaires alors que les cellules D1 D2 D3 -/- ne poussent pas.
Nous avons traité la plupart des cas auxquels nous pourrons être confrontés.
Nous allons aborder une pathologie importante : le cancer.
C'est une maladie que l'on peut qualifier de génétique, l'identification de mutations fortes et ciblées qui se passent dans certains cancers ainsi que des thérapies ciblées ont pu être développés.

La surexpression de certains facteurs de croissance permettant une division accélérée assez accrue, l'amplification génétique accompagnée d'une multiplication anarchique, des mutations ponctuelles (ex : oncogène Ras), des translocations chromosomiques sont autant de modifications génétiques que l'on peut observer. Le contexte inflammatoire est également important. D'autres récepteurs et facteurs de croissance peuvent être induits par des modifications d'expression au niveau génétique, intervenant dans des boucles de régulation autocrines permettant de maintenir le contexte inflammatoire.

A chacune des étapes, on peut trouver des thérapies ciblées. Les mutations liées au contexte tumoral peuvent être ciblées. On a notamment des anticorps monoclonaux humanisés, dirigés contre les facteurs de croissance, voire contre des récepteurs présents de manière anormale dans les cellules tumorales. Parmi ces anticorps, on a l'herceptine (semblable au trastuzumab). Ces anticorps sont dirigés contre un membre de la famille des EGF : HER2. Il existe HER1, 2, 3, 4. Dans le cas du cancer du sein, HER2 était un marqueur de très mauvais pronostic avant ma mise sur le marché de cet anticorps.

Un autre type de récepteur : les mimétiques de l'ATP. Dans les cas d'une tumeur, les récepteurs portent une activité tyrosine kinase, et comme toute kinase il leur faut de l'ATP pour fonctionner. Dans le cas de ces récepteurs, les mimétiques de l'ATP vont bloquer leur activité.

Des inhibiteurs de farnésyl transférase sont également utilisés. Ras est une protéine membranaire fixée par un groupement farnésyl associé à son extrémité C terminale. La farnésyl transférase permet de greffer ce groupement farnésyl. Ras n'est plus actif s'il n'est pas attaché à la membrane, donc dans le cas des Ras mutants constitutifs actifs ce sont des inhibiteurs très utiles.

Les Cox (cyclo oxygénase) sont à l'origine de la fabrication des prostaglandines, elles sont également une cible clinique. Un produit le ciblant, cardiotoxique, a été retiré du marché (effets cachés par cette entreprise au cours des tests cliniques) : viox (rofécoxib).
Cancer du poumon à «non petites cellules»

Le HER1 est surexprimé dans le cas de ces cancers.

Un composé, le Iressa/ Gefitinib va inhiber l'activité tyrosine kinase de l'EGF.

Des études cliniques ont été réalisées : ces composés qui donnaient des résultats chez la souris ne sont efficaces que dans 10% des cas. Cela marchait mieux chez les non fumeurs, les femmes et dans la population japonaise. Sur un échantillon de tumeurs, une PCR à l'aide d'amorces spécifiques sur le gène de l'EGF ont été réalisées. Il peut y avoir de grands introns séparant les régions exoniques. Comme ce récepteur est connu depuis longtemps, on peut designer des amorces très spécifiques des régions exoniques. Cependant ce récepteur à l'EGF est de taille importante, 180kDa, et il a une 20aine d'exons à étudier. L'étude a été faite sur 250 échantillons. Le récepteur à l'EGF a ainsi été séquencé.

Dans tous les cas sauf un, on a observé une mutation au niveau des récepteurs de l'EGF. La localisation des mutations de ces récepteurs a alors été étudiée.

De nombreuses kinases ont été identifiées, on parle de kinome, on a retrouvé des zones conservées : domaine I, domaine II, domaine VII et domaine VIII. On peut identifier 11 domaines conservés dans toutes les kinases, dont ces 4 totalement invariants.

Domaine I : GXGXXG

Domaine II : K

Domaine VII : DFG

Domaine VIII : APE ou SPE
Il existe une zone de 7 à 15 acides aminés entre la fin du domaine I et la lysine du domaine II. C'est à ce niveau que se fixe l'ATP. Le domaine VII est responsable du transfert de l'ATP sur le substrat. Si on mute le résidu lysine, par exemple en arginine, on créée une kinase morte, inactive, n'ayant plus du tout d'activité. De même pour le DFG.

L'espace entre la glycine et la lysine, c'est grâce à la variabilité de ce domaine qu'on a pu designer des mimétiques de l'ATP pouvant se fixer de manière spécifique sur une kinase, avec beaucoup moins de spécificité sur d'autres kinases. C'est ainsi qu'un inhibiteur spécifique d'une kinase peut être développé.
Dans l'étude, des mutations ont été retrouvées autour de la zone 746-753, 858... Ces mutations avaient été retrouvées, de manière totalement indépendante, chez les japonais et américains ayant fait ces études, et les ayant publié indépendamment.
La mutation en 858 se situe dans une région entre le domaine VII et le domaine VIII. Elle peut avoir pour effet d'empêcher ou de suractiver la phosphorylation...

On a regardé si des lignées déjà disponibles (4 testées) en culture possédaient déjà cette mutation, et l'une d'elles avait la mutation L858R. La viabilité cellulaire en fonction de la concentration de la drogue a été mesurée : deux lignées étaient insensibles, une commençait à être sensible à dose importante... Mais la lignée avec la mutation est beaucoup plus sensible, à faible dose. Cette drogue devient plus efficace à des doses plus faibles.

On peut cependant émettre une critique sur cette expérience : la notion de spécificité ne ressort pas vraiment, la baisse de viabilité pourrait très bien être due à autre chose. L'activité de la drogue sur le récepteur a donc été mesurée. Celui-ci s'autophosphoryle (trans phosphorylation de deux sous unités du récepteur). Des anticorps dirigés contre les formes phosphorylées de ce récepteur permettent de détecter son activité : p-EGFR. On observe un signal très fort en absence de drogue dans tous les cas, maintenu dans toutes les lignées sauf celle ayant la mutation L858R.

La voie de signalisation Erk et AKT a alors été étudiée pour confirmer ce résultat.
On a donc, en cas de mutation de ces récepteurs, une efficacité de la drogue chez les patients. On ne dépasse pas les 500mg/jour à cause d'éruptions cutanées ou de risques toxiques chez certains patients possédant cette mutation. Avant de traiter les patients, il est pertinent de rechercher si ce type de mutation existe, et on peut essayer d'administrer une dose supérieur aux patients ne possédant pas cette mutation.

Cas d'une translocation chromosomique célèbre : entre le gène BCR et ABL (qui aboutit à la fusion des deux gènes). ABL est une tyrosine kinase intracellulaire. Celle-ci devient constitutive active, non régulée. La conséquence est à l'origine de la leucémie myéloïde chronique (forme rare). Cette fusion est connue sous le nom de chromosome philadelphie. Cette leucémie peut évoluer en leucémie aigue, avec une espérance de vie très réduite (quelques mois).

Le traitement de ces leucémies qui a révolutionné le traitement du cancer est que la société novartis a été la première à mettre sur le marché le gleevec, qui inhibe l'activité de cette tyrosine kinase. Pour la première fois, il y avait un tel bénéfice de traitement que tous les patients ayant reçu le placebo ont ensuite reçu le traitement. Il fallait une 10aine d'années entre les essais et la mise sur le marché, alors que pour le Gleevec il n'a fallu que 3 à 5 ans.

Des personnes incapables de se lever sont sorties de leur état anémié ont pu recommencer à refaire de la marche... Ces résultats ont été observés à l'an 2000. Ce Gleevec venait d'être mis sur le marché en 2000, le PDG de Nokia a alors contacté le PDG de Novartis et a parlé de sa femme qui était atteinte d'une autre forme de cancer (gastro intestinal), il a réussi à obtenir qu'elle ait ce traitement. Cela a été efficace. Le Gleevec a une spécificité considérable pour ABL, mais a une spécificité pour d'autres récepteurs à activité tyrosine kinase, notamment C-kit, surexprimé dans ces cas de cancers gastro intestinaux. Même si le Gleevec n'a pas la meilleure affinité pour ce récepteur, il est efficace dans ces cancers.

Le bémol est que certains patients LMC sont réfractaires (traitement toxique, résistances). Des mutations dans la poche ATP ont été trouvées, faisant que le gleevec ne peut plus se fixer de façon aussi optimale. Une suramplification du gène est également défavorable, il faut augmenter les doses dans ce cas là. L'amplification de kinases apparentées à ABL, de la famille SRC comprenant les kinases Lyn, Fyn et Yes est également un problème. Si Lyn est suractivé, on observe un phénomène de résistance.

Environ 10% des patients traités ont des résistances.

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